微生物实验教学的实验室安全等级

微生物实验教学

来源：http://www.jyu.edu.cn/huaxue/kejian/weishengwuxue/syjx.htm

实验一 培养基的制备 一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基 三、培养基的制备过程

称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌 1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。 2.配调

向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。

如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 3.调节pH值

一般做法是：培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。

微生物实验教学

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实验一 培养基的制备 一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基 三、培养基的制备过程

称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌 1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。 2.配调

向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。

如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 3.调节pH值

一般做法是：培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。

微生物实验教学

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实验一 培养基的制备 一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基 三、培养基的制备过程

称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌 1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。 2.配调

向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。

如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 3.调节pH值

一般做法是：培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。

生物安全实验室等级

参照美国国立卫生研究所、美国疾病控制中心的标准，我国生物安全实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四个等级，分别对应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级生物安全标准。 美国国立美国疾控中国卫生病原 操作 一级屏障 二级屏障 卫生研究中心 部 所 P1 BSL-1 一级 不会经常引发健标准的微生物操作 不要求 开放实验台、洗手池 康人疾病 P2 BSL-2 二级 人类病原菌，因BSL-1 操作如： 一级、二级生物安全柜 BSL-1 如： 皮肤伤口、吸入、1、限制进入 实验服、手套、若需要高压灭菌锅 黏膜暴露而发生2、有生物危险警告标志 则采取面部保护措施 危险 3、“利器”安全措施 4、生物安全手册，其中规定废物消毒和医疗观察 P3 BSL-3 三级 内源性和外源性BSL-2 操作如： 一级、二级生物安全柜 BSL-2如： 病源，可通过气1、控制进入 保护性实验服、手套、1、与进入走廊隔开 溶胶传播，能导2、所有废物消毒 若需要则采取呼吸保2、双门进入，门自动致严重后果或生3、洗涤前，实验服消毒 护措施 关闭 命危险 4、有基础血清 3、排除的空气不循环、 4、实验室内负压 P4 BSL-4 四级 对生命有高度危BSL

课题1: 微生物的实验室培养（导学案）

高二生物组

目标导引

1、通过学习知道培养基的种类、营养要素及如何配制培养基 2、通过学习知道消毒灭菌的原理和方法

3、通过学习你将知道如何用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养

问题导学

一、培养基:阅读课本培养基的相关内容，完成下列问题：

（1）培养基分为哪两类？二者的区别？培养基有何用途？

（2）不同的微生物所需要的培养基配方相同吗？培养基的基本成分（主要营养物质）有哪些？为什

么大多数培养基都需要具备这些基本成分？

（3）培养基除能为微生物生长提供几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长的哪些要求？

（4）你知道牛肉膏、蛋白胨可以为微生物的生长提供哪些营养物质吗？

二、无菌技术：阅读无菌技术的相关内容，完成下列问题：

（1）获得纯净培养物的关键是什么？无菌技术围绕什么而展开？主要包括哪几个方面？

（2）什么是消毒与灭菌？二者的区别？实验室常用的消毒方法、灭菌方法有哪些？分别适用于那些用具？

（3）利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是什么？

（4）请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。

①培养细菌用的培养基与培

微生物 知识 管理

微生物实验室规范指导原则

微生物 知识 管理

影响药品微生物的检验结果的因素。 1、实验人员在取样或试验过程中污染微 生微。 2 、生物学分析方法本身的误差。 3 、样品中或环境中微生物分布不均匀等 因素在药品检验中，为保证微生物试验数 据的可靠性和重现性，药品微生物实验室 必须使用经验证的检测方法并按良好的实 验室规范指导试验。

微生物 知识 管理

药品微生物实验室规范包括以下几个方 面：人员、培养基、菌种、实验室的布 局和运行、设备、文件、实验记录、结 果的判断等。

微生物 知识 管理

人员培训从事药品微生物试验工作的人员均要受到教育、培训及 具备相关工作的经验。 微生物实验人员应具备微生物学或相近专业知识的教育 背景。 岗前培训 1 、根据实验人员的岗位及职责对其进行相应的培训 2、工作所必需的设备操作的培训 3、微生物检验技术的培训 4、实验室生物安全等方面的培训 经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级 别实验人员的继续教育计划。

微生物 知识 管理

微生物实验室管理人员的培训 1、微生物实验室管理人员培训 包括：管理技能、实验室安全、试验按排、 预 算、实验室研究、实验结果评估和数据 偏差的调查及技术报告书写等。 。

微生物

良好的微生物实验室操作规范

简介

在微生物实验室中，良好的实验室操作规范是基于很多原则，包括以下活动：无菌技术、培养基的控制、菌种的制备、仪器设备的管理、细致的记录和数据的评估、人员的培训。众所周知，微生物测定数据的可变性、可靠性和重现性是基于公认方法的使用和坚持良好的实验室操作规范。

微生物菌种的维护

生物样本是最灵敏(delicate)的,因为他们生存能力和特性是依赖于适当的处理和贮存。菌种的处理和贮存的标准是使用者的实验室制定的，采用减少污染的机会和减少生长特性变更。小心一致的处理贮存用菌种是微生物测试结果一致性的重要因素。按药典方法方法使用的菌种应该取自国家菌种保藏中心。可以包括冷冻的、冻干的、斜面培养的或是马上使用的形式。在质量控制测试使用前应进行菌种纯度的确定和菌种的鉴别。马上使用的菌种要求确定纯度、鉴别、接种体大小。鉴定的确认，对通常用的实验室菌种，理想的是进行基因水平的分析（如：使用合适的经过验证的探针进行DNA指纹,RNA基因排序,PCR光电导继电器）

菌种的制备和复壮应该参照供应商的说明书或采用己验证批准的方法。种子批技术被推荐用于贮备用菌种的保存。

从国家菌种保藏中心得到的初始菌种在合适的培养基被复壮、培养

实验室生物安全基本原理与相 关法律法规

柯昌文 广东省疾病预防控制中心 2010年7月

提纲★ 基本原理★ 实验室生物安全管理

★ 我国及国外微生物实验室生物安全 相关法律法规

★ 微生物菌毒种及样本的运输与保藏★ 小结

基本原理生物危害

广义上的生物危害：指有害或有潜在危害的 生物因子对人、环境、生态和社会造成的危 害或潜在危害实验室生物危害：指在微生物和生物医学实 验室教学、诊断和研究过程中对人、环境、 生态和社会造成的危害和对环境造成的污染

基本原理有害生物因子及有潜在危害生物因子的材料

病毒、细菌、真菌、毒素和寄生虫等

来自感染的人和动物的血液、体液和各种 组织等

基本原理暴露途径

经皮接种感染 气溶胶吸入感染 粘膜接触感染

食入感染

基本原理宿主因素

疫苗接种状况身体状况：性别、年龄 专业和知识水平

基本原理危害等级分类的依据 微生物的致病性； 传播方式和宿主范围； 具有的有效预防措施；

具有的有效治疗措施

基本原理微生物的危害等级(分为四个等级):

危害等级I:是指低个体和低社会危害；不可能引起健康成人或动物致病的微生物；要 求I I级生物安全防护水平

(BSL-1)危害等级II:是指中等个体危 害，有限的社会危害；很少引起严重的人或 动

教学准备

1. 教学目标

1.1 知识与技能：了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的分类、成分及用途，无菌技术等基本操作技术。

1.2过程与方法：分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加印象。

1.3情感、态度与价值观： 形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神。

2. 教学重点/难点

2.1 教学重点：培养基的分类、成分及用途及无菌技术的操作 2.2教学难点：无菌技术的操作

3. 教学用具

多媒体、板书

4. 标签

教学过程

引入新课

在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。

课题背景 到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关。 微生物基础知识：微生物的分类见课件。 进行新课

1．微生物基础知识

微生物包括五类：病毒、细菌、放线菌、真菌、原生动物

特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显

微生物实验室管理规章制度

1. 无菌室的门要随手关闭，以防外界微生物的进入。 2. 微生物室内应保持清洁，不得存放与实验室无关的物品。 3. 进入无菌室前要更换经过灭菌的专用工作衣帽鞋。

4. 无菌室内应备有体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液体积分数为

70~75%的酒精棉球，以便样品表面及意外污染消毒。 5. 无菌室内应备有镊子剪刀接种针接种环，每次使用前后应在酒

精灯火焰上灼烧至无菌。

6. 检验人员在操作过程中需严格按照要求进行操作，不得随意减

少工序。

7. 无菌室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒灭菌的

区域，与该工作无关人员不得随便出入无菌室。

8. 微生物（无菌室缓冲间）每次使用前，用紫外灯照射30min，

要每周检测一次室内空气清洁度，确保其符合实验条件。每周对微生物室进行至少一次2h以上紫外灯消毒。微生物室内的的菌种总数>5cfu/平皿时，需要对无菌室缓冲间用85~95%乳酸熏蒸1h，熏蒸结束后（必要时可以将空间密闭整晚），用体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液或体积分数为70~75%的酒精棉彻底对洁净室缓冲间及其内所有设备物品进行清洗；后对无菌室缓冲间进行半小时以上紫外线消毒，结束后，验证室内空气清

洁度是否合格，仍不合格，则可加大