实验五 DNA的限制性酶切和电泳
更新时间:2023-03-08 09:53:30 阅读量: 综合文库 文档下载
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实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳
一、实验目的
掌握DNA的限制性酶切的基本原理 和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术
二、实验原理 1、DNA的限制性酶切
限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶,它能够识别双链DNA的特定位点并切开DNA,这个特定位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段。。
绝大多数的限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列。EcoRI的识别序列是G↓AATTC,BmHI的识别序列是G↓GATCC,HindIII的识别序列是A↓AGCTT。
每种限制性内切酶都有特定的反应条件,如特定的pH范围,缓冲液组分,温育温度等,具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一般温度37℃,pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的,但缓冲液的组分则变化很大,典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2,和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。
典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20和50μ之间,反应时间在1小时,而反应的终止则由EDTA溶液的加入完成,因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。
2、DNA的琼脂糖电泳
DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳,它们是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。在pH值为8.0-8.3时,核酸分子带负电,在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。而分离小片段DNA(5~500bp)则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,其分辨力极高,能分离相差1bp的片段。
电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB(溴化乙啶)进行染色,EB是一种丫啶类染料,其分子呈扁平形,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。即可确定DNA条带在凝胶中的位置,而且灵敏度相当高,少至1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。
试剂
(1)1 ×TBE电泳缓冲液:45mmol/Ltris-硼酸,1mmol/LEDTA,pH8.0 (2)加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液。 (3)λ-DNA和提取的DNA
λ-DNA是λ噬菌体的基因组DNA,全长50kb。用HindIII或(和)BamHI酶切得到的片段被广泛用于DNA电泳的分子量标准。
(4)分子量标准(λ-DNA/HinD III) (5)限制性内切酶。
操作方法
1、DNA的限制性酶切
取1只0.5mL离心管,按下列顺序加入:
DNA 10×buffer 蒸馏水 限制酶 (2)轻轻摇匀,置于37℃保温1小时。 (3)加入4uL加样缓冲液,摇匀。 (4)取10uL进行电泳 2、DNA的琼脂糖凝胶电泳 (1)将电泳槽彻底洗净。
(2)将电泳槽置于平整的台面上并调节水平。 (3)用2%琼脂糖封固胶模边缘,任其凝固。 (4)配制1×TBE电泳缓冲液。
(5)用1×TBE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使之溶解。 (6)待琼脂糖溶液冷至60℃时,缓缓倒入胶模,厚约0.5mm。 (7)立即插入梳子,静待琼脂糖凝固。
(8)去掉封固的有机玻璃封条,将胶模放进电泳槽。 (9)向电泳槽倒入1×TBE电泳缓冲液,没过凝胶5mm。 (10)小心地拔掉梳子。
(11)用20uL的枪吸取DNA溶液,缓缓注入点样孔。
5uL 2uL 12uL 1uL
(12)按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次点样 (13)接通电源,电泳。
(14)电泳完毕,取出胶模,将胶置入EB染色液中染色10min。 (15)用搓板取出胶,置于紫外灯下观察。 3、结果记录与分析
绘出电泳图谱或照相,如果可能的话,作出分子量与迁移率的关系图。
思考题
1、加样缓冲液的作用是什么?
2、琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和适用范围有什么异同?
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