苯酚的生物降解特性研究 - 丁霞

“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案

丁霞

一、 实验目的

酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。 二、 实验原理

利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。 1）微生物生长量的测定方法——比浊法

比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。 2) 苯酚浓度的测定方法 见后面附录。

3）苯酚降解菌的系统发育分析

16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术

的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为微生物检测和鉴定的一种强有力工具。该技术主要有三个步骤：首先，基因组DNA的获得；其次，16S rRNA基因片段的PCR扩增，并进行TA克隆用于测序分析；最后，进行16S rRNA基因序列的系统发育分析。

三、 实验所需仪器设备及台套数、实验用具与消耗品清单及数量 1. 实验设备

分光光度计（6台），PCR仪（2台），双层摇床（3台），恒温培养箱（1台），普通显微镜（3台），超净工作台（2台），灭菌锅（2个），琼脂糖凝胶电泳系统（2套），凝胶成像系统（1台），微波炉（1台），水浴锅（2台），干燥箱（1台），离心机（3台），磁力搅拌器（3台），电子天平（3台）。 四、 实验用具

250ml三角瓶（300个），平板（60），试管（100），移液器（10套），100mL 的分液漏斗（10个），接种环（4支），枪盒、枪头、EP管（若干），酒精灯（10），玻片和载玻片（各3盒）。

五、 消耗品（未注明数量的均为1瓶）

苯酚（5瓶），酵母粉，蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，柠檬酸，氯化铵，氨水，盐酸，氢氧化钠， 4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿（10瓶），饱和酚，异戊醇，无水乙醇（3瓶），氨苄霉素，ITPG，X-gal，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，Na2HPO4，NaH2PO4， K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，醋酸钠，Tris，HCl，EDTA，结晶紫，番红，碘液，pH试纸，琼脂粉（2瓶），琼脂糖（2瓶），蛋白酶K（2瓶），溶菌酶（2瓶），RNA酶，DNA marker，DNA加样缓冲液（6x），硼酸，TA载体（2盒），Taq酶（4支），dNTP(2支)，引物，感受态细胞（20支），PCR产物回收试剂盒（1盒），琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒（1盒）。

实验一 苯酚浓度的测定方法 （8课时）

方法一 ：

所用溶液 1）苯酚标准液

精确称取 0.1g 苯酚溶于蒸馏水中，移入 1000ml 容量瓶中，稀释至标线，并贮存于密封良好的棕色瓶中。置冰箱内保存，可使用一个月。 2）20%氨性氯化铵缓冲溶液

称取 20.00g 氯化铵溶于浓氨水中，用浓氨水定溶于 100ml， 此缓冲液pH9.8，贮存在具橡皮塞的瓶中，在冰箱内保存备用。 3） 2%（m/V）4-氨基安替比啉溶液

精确称取4-安替比啉 2.00g 溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中，此液应临时配制。 4） 8%（m/V）铁氰化钾溶液

精确称取 8.00g 铁氰化钾溶于蒸馏水中，并定融至100ml，此试剂最好临用时配制。

测定步骤

(1) 标准曲线的绘制

于一组8支50ml比色管中，分别加入0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、12.50ml的酚标准液，加水至50ml标线。加0.5ml缓冲液，混匀，此时pH值为10.0左右。加4-氨基安替比啉溶液lml，混匀。再加lml铁氰化钾溶液，充分混匀后，放置10min后，以水为空白，用分光光度计测定OD510值(用光程为20nm比色皿)。经空白校正后，绘制吸光度值对苯酚含量(mg)的标准曲线(图2-1)。

(2) 培养液中苯酚浓度的测定

将分离得到的降酚菌分别接种在苯酚浓度为 500mg/L 的无机盐培养液中，每隔 24 小时测定培养液中苯酚的浓度，最后分析数据，判断每个菌株降解苯酚能力的大小。具体培养液中苯酚测定方法是首先将培养液以1000rpm离心10min，取上清 0.5ml 置于 50ml 的比色管中，加入无酚蒸馏水到 50ml 标线，加入 0.5ml缓冲液混合均匀。加入 1ml 2%的 4-氨基安替比啉，混匀。再加入lm1 8%的铁氰化钾溶液，混匀。10-15min 后，在 510nm 处读取吸光度。若读数过大则进行适当的稀释，使其读数介于 0.2-0.8 之间。根据苯酚标准曲线得出相应的苯酚浓度，起始苯酚浓度与终点苯酚浓度的差反映每株降酚菌株降解苯酚能力的大小。

注意：测量苯酚浓度时，苯酚要根据标准曲线和测试组苯酚的浓度，进行相应稀释，使得OD值在有效区间内。

方法二 4-氨基安替比林直接光度法

（1）原理

4-氨基安替比林直接光度法是测量溶液中酚类浓度常用的方法。苯酚在碱性条件（pH=10±0.2）并有铁氰化钾存在的情况下，能与4-氨基安替比林发生化学反应，生成橙红色的安替比林吲哚酚染料，其水溶液在波长510nm处有最大吸收，利用这一特性，可以测定溶液中苯酚的浓度。 （2）溶液配制

①苯酚标准储备溶液(1.0000g/L ) : 准确称取1.0000g苯酚,用新煮沸并冷却的蒸馏水溶解并定容至1000mL;

②苯酚标准工作溶液(10mg/L) : 移取10. 00mL苯酚标准储备溶液,用新煮沸并冷却的蒸馏水定容至1000mL (临用前配制) ; ③NH3 ?H2O: 取35mL NH3 ?H2O稀释至1000mL;

④K2HPO4 - KH2 PO4 缓冲溶液: 溶解104. 5g K2HPO4 和72. 3g KH2 PO4 于无酚水中,稀释至100mL;

⑤ 4 - 氨基安替比林溶液(每周新配制) : 20g/L; ⑥K3〔Fe (CN) 6 〕溶液: 80g/L; ⑦三氯甲烷。

注：实验所用水均为无酚水,化学试剂为分析纯。 （3）实验方法

准确移取4. 0mL酚标准工作溶液于100mL烧杯中, 加入2. 0mL 0. 5mol/L 的NH3 ?H2O, 稀释至20mL, 用磷酸缓冲溶液调节pH为8. 0。将调好pH值的溶液转入100mL 的分液漏斗中, 加入0.4 mL 4 - 氨基安替比林,混匀; 再加入0.6 mL K3〔Fe (CN) 6 〕溶液充分混匀后, 放置10min。准确加入4. 00mL三氯甲烷进行萃取,闭塞、剧烈振摇2min, 静置分层。将氯仿层放入1cm比色皿,以试剂空白为参比测定其吸光度。 （4）制作苯酚浓度的标准曲线

将标准苯酚溶液稀释成不同浓度，按实验方法，测定吸光值，绘制标准曲线。得曲线如下：

吸光值0.70.60.50.40.30.20.10-0.102468苯酚含量（mg）系列1线性 (系列1)

图2-1苯酚标准曲线

思考题：

比较两种测量苯酚的方法，哪种方法更好，说明理由。

实验二：各种因素对菌株降解苯酚的影响（16课时）

一、实验目的

采用单因子分析，分别考查苯酚浓度、温度、pH 值、NaCl浓度，溶氧量（摇床转速）、碳源、等环境因素对降酚菌生长和降解苯酚能力的影响。进而确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性。 二、材料、试剂及器具 1、材料 降解菌 2、试剂

苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。 磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：

NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L； 无机盐培养基（g·L-1）

NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚 0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）； 3、器具

摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。 三、实验步骤

1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法

见实验一的方法

2）降酚菌生长与降解特性的研究 1. 各种不同碳源下菌株的生长情况

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。分别接入含有其它碳源（不含苯酚）的无机盐培养基中，观察菌株在各种不同碳源上的生长情况。

参考碳源：葡萄糖，苯酚，淀粉，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺等； 2. 苯酚浓度对菌株降酚能力的影响

取2%接种量，苯酚浓度分别为100，250，500，750，1000，1 500mg/L 的培养基中，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。 3. pH对菌株生长和降解苯酚能力的影响

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。pH值分别为3、5、7、9、11，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。 4. NaCl对菌株生长和降解苯酚能力的影响

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。NaCl浓度分别为0.05%，0.1%，0.5%，1%，3%，15%，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。

思考题：

确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性时，上面的因子分析是否充分，实验结果表明哪种因素的影响最大？还有哪些因子需要考虑？

实验三 降解菌生长和降解曲线的测定 （8个学时）

一、 实验目的

学习微生物生长曲线的测定，掌握苯酚降解菌苯酚降解曲线的测试。 二、材料、试剂及器具 1、材料 降解菌 2、试剂

苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。

磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：

NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L； 无机盐培养基（g·L-1）

NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚 0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）； 3、器具

摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。 三、实验步骤

1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法

见实验一的方法

2）降解菌生长和降解曲线的测定

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中，共培养两天。理论上每隔4小时（此次实验周二下午2点接种，第二天上午10点和下午2点，第三天上午10点和下午2点共测试四次），0D600测定降解菌生长曲线的测定，同时测定苯酚浓度，并绘制生长和苯酚降解曲线。

思考题：

测定了其生理生化的特性指标和生长曲线, 对其降解特性进行了初步了解, 如何对菌株的降解条件进行优化？

实验四 苯酚生物降解的途径及其降解关键酶 （8学时）

一、实验原理

苯酚的降解基因通常排列成簇，位于大质粒上，部分位于染色体上。在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个酶，将苯酚转化成邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解为三羧酸(TCA)循环产物，从而进入物质和能量的代谢。

邻苯二酚的开环裂解是在不同酶的作用下，经过不同的降解途径实现的。

其中，以邻苯二酚2，3双加氧酶(C23O)催化的开环途径称为间位裂解途径，邻苯二酚通过间位开环产生黄色的2-羟基粘糠酸半醛以及α-酮基己二酸中间物。假单胞菌主要通过这个途径降解苯酚。

以邻苯二酚1，2加氧酶(CatA，C120)催化的开环途径称为邻位裂解途径，邻苯二酚邻位开环裂解产生粘康酸，以及内脂和琥珀酸等无色的中间物。醋酸不动杆菌等以此途径降解苯酚。由上述两途径中形成的乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用。一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供微生物新陈代谢所需的能量。在微生物降解苯酚的过程中，需要其多酶系统和氧的辅助来共同完成。

二、实验材料

⑴50mM磷酸缓冲液（pH 7.0，K2HPO4 14.022g/L；KH2PO4 5.236g/L） ⑵50mM磷酸缓冲液（pH 7.6，K2HPO4 19.745g/L；KH2PO4 1.822g/L） ⑶邻苯二酚（儿茶酚）20μmol/L

三、实验步骤

3.1 粗酶液制备

①分别接种PD，DX，QY三种菌落于50ml无机盐培养基中，37℃震荡培养过夜。

②培养液于4℃，4000r/min离心，沉淀在缓冲液中洗涤一次并重悬。 ③将重悬液在冰浴中超声波破壁50个循环（5秒工作，10秒停顿）。 ④将悬液在4℃，12000r/min离心20min，上清转入新管得粗酶液。

3.2 测定方法

500μl测定体系如下（实际操作时可加6个体系使比色皿中液层厚度为3cm）：

①邻苯二酚1,2-双加氧酶（C120）

50mM磷酸缓冲液（pH 7.0）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD260下的变化。

②邻苯二酚2,3-双加氧酶（C230）

50mM磷酸缓冲液（pH 7.6）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD375下的变化。 3.3 蛋白标准曲线的绘制 所用试剂：

1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml95%的乙醇中，加入

100ml85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1L，滤纸过滤。最终试剂含有0.01%考马斯亮蓝G-250,4.7%乙醇，8.5%磷酸。

2）标准蛋白溶液：牛血清蛋白（PBS）用0.15mol/L的NaCl配成1mg/ml蛋白

溶液

3）50mM磷酸缓冲液：PH7.0，K2HPO4 14.022g/l，KH2PO4 5.236g/l 取7组三角瓶，分别按下表平行操作

表2-2 蛋白标准曲线测定组分表

试管编号

0

1 1 9 5

2 2 8 5

3 3 7 5

4 4 6 5

5 5 5 5

6 6 4 5

标准蛋白溶液（ml） 0 0.15mol/lNaCl（ml） 10 考马斯亮蓝试剂5 （ml）

摇匀，20min内以0号管为空白对照，在595nm处比色。以A595为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。 3.4 测定细胞裂解液蛋白质浓度

测定方法同上，取合适体积的裂解液，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出裂解液的蛋白质浓度，在计算出提取液（粗酶液）中蛋白质的质量mg。

思考题：

实验五：微生物基因组的提取（4课时）

一、实验目的

掌握微生物总DNA的抽提方法和基本原理。 二、材料、试剂及器具

耗材：吸头塑料制品（包括吸头、EP管等），EP管架

试剂：TE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0），醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），酚/氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇，醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），无水乙醇，溶菌酶（20mg/ml 无菌水配置，-20°store），RNA酶（10mg/ml，in 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 15mM NaCl, 100℃加热5min，冷却，-20°store），蛋白酶K（20mg/ml，in 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 2.9mg/ml CaCl2, 50% 甘油，-20°store）

仪器：高速冷冻离心机，-20 oC冰箱，移液器，恒温水浴锅 三、实验步骤

1. 将细菌接单菌落接种于培养基中，30oC，150r/min培养过夜。

2. 5000r/min离心2min，TE洗涤一次，再次离心，重悬菌体于0.5mlTE中。 3. 加入20μL 20mg/ml的溶菌酶和20μL 10mg/ml RNA酶，混匀，于37oC保温1h。

4. 加入20μL 20mg/ml的蛋白酶K于37oC保温1h。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入一新1.5ml EP管中。

6. 加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入一新管中。

7. 加入1/5体积的醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），两倍体积的无水乙醇，颠倒几次离心管混匀。-20oC放置2h，10000r/min，4oC离心5min，倾去上

清液。

8. 70%乙醇洗涤沉淀两次，室温下晾干后，溶于0.1ml TE中，置于4oC冰箱中，待用。

思考题：

1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? 氯仿, 乙醇。 2. DNA提取过程中应注意什么?

实验六：PCR扩增16s RNA（4课时）

以细菌的总DNA为模板，以16S rRNA通用引物对16S rRNA基因片段进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。 一、实验目的：

PCR和琼脂糖凝胶电泳是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、材料、试剂及器具 1、材料

微生物基因组，引物

BSF8/20 BSR1541/20 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 2、试剂

Taq DNA聚合酶；dNTP；灭菌的去离子水；100ul EP管；加样缓冲液（6×）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；0.5×TBE电泳缓冲液(每升含有54g的Tris，27.5g的硼酸和20ml的0.5mol/L的EDTA（pH8.0）)；DNA Marker。 3、器具

（1）PCR扩增：PCR仪、吸头塑料制品（包括吸头、EP管等） （1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等 （2）紫外透射仪 三、实验步骤： 1）PCR扩增

以基因组为模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。向PCR反应管中依次加入：

去离子水 PCR缓冲液 dNTPs 上游引物 下游引物

16.75μl 2.5μl 1μl 1μl 1μl

DNA

Taq DNA聚合酶

反应条件为：

34 cycles

2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果

1μl 0.25μl

95°C 95°C 54°C 72°C 72°C

5 min 30s 30s 1.5min 10min

1、按所分离的DNA分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶

中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。

2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好

胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，

使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳

槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的

加样孔中。1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品（+0.5μlEB液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。）

7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，

开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止

电泳。

9、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，

放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染

色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。

思考题：

1. 退火温度Tm是如何计算得到? 2. PCR循环次数是否越多越好?

实验七：TA克隆（8课时） （备选）

1）实验目的

TA克隆是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、快速等优点。本实验学习TA克隆的使用技术，掌握有关的技术。 2）实验原理

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。 通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。 3）实验步骤 1、PCR产物的纯化

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增为单一条带，用PCR产物纯化试剂盒进行

纯化。具体步骤参照试剂盒说明书。 2、TA克隆

连接：纯化后的PCR产物与T载体混匀，并加入5μL的Solution I（含连接酶），置于PCR管中，16oC下过夜连接。

转化：取5μL的连接产物置于eppendorf管中，加入DH5α感受态细胞混匀，冰上放置30min；将管放到42oC水浴热激90s，冰浴2min后，加入800μl LB液体培养基，37oC，200r/min培养1h，稍离心吸取适当体积菌液涂布在含有氨苄青霉素、IPTG\\X-gal的LB培养基平板上，37oC倒置培养12-16h。

蓝白斑筛选：将平板上长出的白色菌落随机挑选若干于含LB培养基（加有氨苄霉素）的试管中培养，培养到一定的时间后，以菌细胞为模板进行PCR检测。从检测呈阳性的克隆送往公司进行序列测定。将测序结果用BLAST软件与GenBank已经录入的16S rRNA基因序列进行同源性比较。

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