蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

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蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

xxxx大学生命科学学院 生物工程 第一组

前言: 因为自发突变率小, 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外,紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253.7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。 本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况,可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效,稳定的菌种提供了有效可能的方法。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品:老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制

1)液体培养基:牛肉膏0.3g,蛋白胨 1.0g,NaCl 1.0g,pH7.0~7.5,H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶,分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃,灭菌 30min。

2)固体培养基(300ml):牛肉膏0.9g,蛋白胨3g,NaCl 3g, H2O 定容300ml,pH值7.0。配好后,按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶,包扎,112℃,灭菌 30min。

取牛奶粉25g用250ml水溶解,包扎,116℃,灭菌 15min。按10%分别加入上述3个三角瓶中,每个三角瓶10ml。混匀后,倒平板。

1.1.3生理盐水:取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中,即配制0.9%的生理盐水。

1)每支试管中加入4.5ml蒸馏水,塞上试管塞,22支试管分4组分别包扎; 2)剩下的生理盐水装入三角瓶包扎; 112℃灭菌 30min。

1.1.4器材

血球计数板,显微镜,紫外诱变箱,红灯泡,

移液管,涂布棒,含有7颗玻璃珠的空三角瓶等,112℃灭菌 30min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养

从老师给的菌悬液各取50ul接入2个液体培养基,37°C,220rpm,震荡培养过夜。

1.2.2 出发菌株菌悬液的制备

1)取出发酵培养基,从生长良好的一瓶取20ml倒入50ml离心管中5000转离心5分钟,弃上清,倒扣离心管于滤纸上吸干残留培养基;

2)加30ml无菌生理盐水,重新震荡悬浮菌体,再离心,弃去上清;重复一次;

3)重复上述步骤加入5ml生理盐水恢复成菌悬液,用血球计数板在显微镜下直接计数,逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL;

4) 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡10~20min,以打散细胞;

5)取0.5ml 菌悬液进行10——10稀释分离,取10、10、10三个稀释度,每一梯度取100ul

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菌液涂布平板,37℃倒置培养24h。

1.2.3 蛋白酶产生菌株的紫外诱变

1)将紫外灯打开,预热30min;

2)取三个无菌空培养皿,加入菌悬液5ml;

3) 将待处理的培养皿置于诱变箱内,轻轻晃匀后打开皿盖,分别处理1min、5min、10min,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭紫外灯;

4) 分别取0.5ml处理后的菌液进行10-1——10-5稀释分离,取10-3、10-4、10-5三个稀释度。每个样品的每一梯度取100ul菌液涂布平板,待菌液干后用黑色包装袋包好37℃倒置培养24h.(避光培养),做好标记。

诱变过程在暗室红灯下进行。

1.2.4 实验结果观察

观察和比较对照组和3个实验组的单个菌落情况,稀释梯度生长情况,以及水解圈大小。

2 实验结果与分析

在对照组与紫外5min诱变中都出现了较好的单个菌落,并且菌落数随着稀释度的增加而减少;以及各个培养基中都出现了较明显的水解圈。如下图:

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3 实验讨论

因为基因突变具有不定向性。因此在此紫外诱变的过程中,是否产生高产,稳定的蛋白酶产生菌,须做进一步的实验。将紫外诱变后的突变菌株与野生型菌株经行酶活比较。才能判断和筛选出正向突变的菌株。

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本文来源:https://www.bwwdw.com/article/rgbr.html

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