3蔗糖酶蛋白含量测定及活力测定

实验报告

专业： 姓名： 孙程珂 学号： 3150100531 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 成绩： 日期： 地点： 同组学生姓名：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理 三、实验材料和主要仪器 四、实验方法和步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果和分析 七、实验讨论和心得

一、实验目的和要求

1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； 3、掌握分光光度计的使用方法。 4、掌握酶活力测定的基本原理和方法； 5、学习酶的比活力的计算。

二、实验内容和原理

装 Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.

优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。 缺点： 该反应受多种因素的干扰。

蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林试剂法等。 本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在500nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。

蔗糖酶活力单位(u)：

蔗糖酶在室温(50℃）, pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。 蔗糖酶比活力的计算：

酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。

比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力＝活力单位/mg蛋白

订 线

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P.2

三、实验材料和主要仪器

1、实验材料

蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。 可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。 2、实验试剂

(1)Folin-酚测定法：

①标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ②Folin-酚试剂（甲试剂、乙试剂） (2)3,5-二硝基水杨酸比色法：

①1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17） ②5％蔗糖溶液

③0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ④3,5－二硝基水杨酸试剂（DNS） 3、实验器材与仪器

（1）恒温水浴（50℃、100℃）；

（2）可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿； （3）试管、试管架； （4）移液管；

（5）微量移液器：200μl、1000μl

装 四、实验方法和步骤

1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线

订 线

以光吸收值（A500）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg）为横坐标，绘制蛋白质标准曲线。

2、各步分离纯化的样品蛋白含量测定

表2（4倍稀释：样品0.25ml+蒸馏水0.75ml）

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P.3

根据测得的光吸收值（A500），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。

3、制备3,5-二硝基水杨酸法标准曲线

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。

4、各样品蔗糖酶的酶活力测定

表4（200倍稀释：4倍稀释液0.02ml+蒸馏水0.98ml）

装 订 线

根据测得的光吸收值（A520），查标准曲线得蔗糖酶活力，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ溶液的最终蔗糖酶活力的计算。

五、实验数据记录和处理

1. 数据：已记录在实验步骤的表格当中

2. 处理：

实验名称：_ ___________________姓名： 学号：

六、实验结果和分析

1.经计算，可得总表如下

样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ 样品Ⅳ

体积(ml) 蛋白浓度(mg/ml) 总蛋白(mg) 活力(u/ml) 总活力u 比活力u/mg

35 30 9.5 5.5

2.95 3.22 9.71 0.805

103.25 96.6 92.245 4.4275

61.35 51.02 88.5 98.04

2147 1531 840.7 539.2

20.79 15.85 9.114 121.8

2.分析：①样品Ⅳ的比活力在数值上比其他样品大太多，原因可能是柱层析时收集蛋白液的时机没有把握好，使得蛋白含量较少；另一方面，可能是在测酶活力时稀释的时候所用的酶量过多，导致稀释造成的误差太大；当然，体积测量、分光光度测量的过程中均存在误差。

②由数据还是可以看出蛋白酶在一系列的纯化操作中不断的更纯，杂蛋白被逐步的去除。

七、实验讨论和心得

1.加入Folin-酚试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸被破坏之前。

2.在使用分光光度计的时候，要等等热平衡后再进行光吸收值的测定，而且作为空白对照的一直比色皿要始终插在分光光度计内，每次换不同待测液后都要调零。比色皿使用时要注意其方向性，需配套使用，拿的时候不能触及光面，而且要保证在比色皿架上不倾斜，防止影响测定结果的准确性。

3.利用标准曲线测定未知样品的蛋白浓度时要考虑其适用范围，超出其范围的就不能根据标准曲线来求蛋白浓度。

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