Vc含量测定

第八章 设计性实验

实验设计，就是要求学生设计实验方案，选择实验器材，安排实验步骤，进行数据处理及分析实验现象。它包括设计实验方案，设计实验步骤、设计实验改进方法等。实验设计，主要考察学生是否理解实验原理，是否具有灵活运用实验知识的能力，是否具有在不同情境下迁移知识的能力。

学生通过完成设计性实验，可以了解科学研究的思路、方法和步骤，使之具有严肃的科学态度、严密的科学思想和严谨的工作作风，培养学生的创新意识和创新精神，提高学生分析问题和解决问题的能力，提高学生综合素质，能有效地推动学生科研立项活动的开展，为将来从事科学研究打下良好的基础。

一、实验设计的目的

学生应在已掌握生物化学基础知识、基本理论和基本实验技能的基础上，在教师指导下，利用本实验室已有的设备条件和材料试剂等技术基础，自己从网络上获取相关资料，设计出综合性的、探索性的实验，在学生讨论、实验教师点评的基础上，学生修改实验设计方案，并在学生设计方案中选出最适合开展的方案若干个，将学生进行编组完成实验。因此实验中学生参与完成选题、设计实验、实验准备、实施实验和实验论文撰写等全过程。这种“理论-实践-理论-综合实践”的过程能使学生深刻理解生物化学实验技术与原理，能熟练运用已经学习的多种技术，学会充分利用本实验室已有的实验设备和条件，将自己的想法付诸于实践。

学生自主设计实验将技术性、综合性、探索创新性的实验融合在一起，通过学生的独立实验设计和实践，培养了学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。

二、实验设计的四个原则

1. 对照性原则

在实验设计中，通常设置对照组，通过干预或控制研究对象以消除或减少实验误差，鉴别实验中的处理因素同非处理因素的差异。

实验设计中可采用的对照方法很多，除了有阳性对照、标准对照、自身对照、相互对照之外，通常采用空白对照的原则，即不给对照组以任何处理因素，值得强调的是，不给对照组任何处理因素是相对实验组而言的，实际上对对照组还是要做一定的处理，只是不加实验组的处理因素。

2. 随机性原则

实验设计中的随机化原则，是指被研究的样本是从总体中任意抽取的，这样做的意义在于：一是可以消除或减少系统误差，使显著性测验有意义；二是平衡各种条件，避免实验结果中的偏差。

3. 平行重复原则 平行重复原则，即控制某种因素的变化幅度，在同样条件下重复实验，观察其对实验结果影响的程度。任何实验都必须能够重复，这是具有科学性的标志。上述随机性原则虽然要求随机抽取样本，这能够在相当大的程度上抵消非处理因素所造成的偏差，但不能消除它的全部影响。平行重复的原则就是为解决这个问题而提出的。

4. 单因子变量原则

单因子变量原则，即控制其他因素不变，只改变其中某一变量，观察其对实验结果的影响。除了整个过程中欲处理的实验因素外，其他实验条件要求做到前后一致。

三、实验设计的基本方法

1. 了解题目要求

选题首先要明确题意，只有明确题意才能方向明确，少走弯路。看清题意是要求设计实验方案、步骤还是分析实验结果。

2. 明确实验目的原理

明确实验到底要解决什么问题，要用到生物化学的什么原理。 3. 确定实验思路

根据原理对实验做出假设，并对可能产生的现象做出预期估计，并充分利用实验材料设计实验思路。 4. 设计实验步骤

根据上述实验目的、原理和思路，设计出合理的实验操作步骤。要思考所给出的实验材料和试剂分别起什么作用？怎样运用？由于实验设计是一种开放性层面，可能存在多种实验步骤，但一般应遵循以下几个要求：简便性、可行性、安全性和精确性。

5. 记录实验现象和数据

在实验中将观察到的现象如实、准确地记录下来。除了用文字进行记录外，还可以用数据、符号或影像进行记录。

6. 分析得出结论

根据实验观察的现象和记录的数据，通过分析、计算、图表、推理等处理，归纳出一般概括性判断，并用文字、图表、绘图等方法作一个简明的总结。

四、实验设计阶段的考核

1. 实验设计

（1）实验设计过程

设计方案是设计性实验的前提和基础。设计实验时要按实验要求与要点提示将传统信息检索与现代网络信息检索相结合，多渠道、多方位进行文献检索，拟定实验方案。

首先每人写一份实验设计书，要求包括确定实验目的、阐明实验原理；标明实验所用仪器、使用方法；确定、标出实验所用试剂和名称、状态、浓度、数量、颜色、有无毒性；材料的选择和处理过程；详细列出操作步骤并标明每步的注意事项；写出对于结果的处理方法；标注参考文献的出处；预计大约的费用等。

然后在学生中分组讨论修改实验方案，再由指导教师对学生上交的实验设计书进行评审，选出最适合开展的方案若干个，将学生进行编组，准备小组实验方案的答辩。答辩时每组各派1名学生简要概括本组实验的目的、原理、注意事项及本实验课题的研究意义等，要求突出本实验课题的特色和关键性问题，随后回答教师和同学们的提问。 （2）评分标准

① 内容：是否贴近生活或生产；是否有一定的实用价值；是否解决了某个问题。 ② 创造性：方法是否有创新。

③ 可操作性：实验方法是否可行；是否科学。

④ 设计书的书写：原理明确与否、过程是否详细、参考文献是否详实。 2. 实验操作

科学、规范地进行实验操作是实验课的主要组成部分，对实验操作的考核主要从实验动手能力、团队协作能力、分析和解决问题能力等多个方面进行综合评价。具体要考察能否按实验设计方案准备实验材料并按操作步骤顺利进行实验；能否安全、规范地使用各种实验仪器；能否及时、完整、真实地记录和收集各种实验数据等。

3. 论文撰写

实验结束后，每个学生可根据自己实际完成实验的情况，进行结果整理或数据处理， 对实验结果进行合理地分析，并按照科技论文撰写规范写出论文。

要求学生独立完成实验论文，不准抄袭。实验论文是文字表达，即使同一小组学生的实验数据相同，但不同的人对同一问题会有不同的见解，用不同的语言进行表达，因此每个人的实验论文都应是不同的。

科技论文一般应包括题目、作者、单位、摘要、关键词、引言、正文（包括材料、方法、结果和讨论）、致谢和参考文献等。其中摘要是论文全文的浓缩，主要包括研究的目的、方法、结果和结论等。关键词是摘要内容的浓缩，也是反映论文主题内容的最重要的词、词组和短语。引言是文章的开场白，其作用是向读者揭示文章的主题、目的和总纲，包括研究的背景、拟解决的问题、研究范围和技术方案等。正文是科研论文的主体，应占据最大篇幅，表达其创造性成果和新的结果。结果是文章的关键部分，是文章的价值所在，一般以文字、表格、插图或照片等形式来进行合乎逻辑的分析。讨论是对结果进行理论分析和综合，回答为什么出现这样的结果以及出现这样的结果意味着什么。

实验论文的语言要求流畅，逻辑性强，且用语规范。文字简练正确，富有感染力，基本无错字，图表整洁，布局合理。论文的结构要完整、格式要规范。

实验六 果蔬中维生素C含量的测定

（一）2,6–二氯酚靛酚法

一、实验目的

（1）掌握维生素C测定的原理和方法。

（2）了解各种蔬菜、水果中维生素C的含量。

二、实验原理

维生素C是一种水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一。人体若缺乏维生素C会出现坏血病，因此又将维生素C称为抗坏血酸。此外维生素C还具有预防和治疗感冒以及抑制致癌物质产生的作用。

维生素C 的分布很广，尤其在水果（如猕猴桃、橘子、柠檬、山楂、草莓等）和蔬菜（如苋菜、芹菜、青椒、菠菜、黄瓜、番茄等）中含量更为丰富。不同种类及品种的果蔬、不同栽培条件、不同成熟度、不同贮藏条件、不同加工方式等都可以影响果蔬中维生素C的含量。测定维生素C 含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。

维生素C 纯品为白色无臭结晶，熔点在190 ~ 192℃，易溶于水，微溶于丙酮，在乙醇中溶解度更低，不溶于油剂。维生素C 具有很强的还原性，可分为还原型和脱氢型。结晶抗坏血酸在空气中稳定，但它在水溶液中易被空气、金属铜、抗坏血酸氧化酶和其他氧化剂氧化为脱氢型。此外维生素C在碱性条件下易分解，见光加速分解；在弱酸条件中较稳定。

果蔬中维生素C 含量的测定一般采用2, 6–二氯靛酚滴定法、碘量法、2, 4–二硝基苯肼比色法、荧光分光光度法、电化学法和高效液相色谱法。

还原型维生素C能被染料2, 6–二氯酚靛酚氧化成脱氢型。该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变成无色。因此当用这种染料滴定含有维生素C酸性溶液是维生素C尚未被全部氧化时滴下的染料立即被还原成无色。当溶液中的维生素C已被全部氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成淡红色。所以当这种染料维生素C至溶液呈淡红色为滴定终点。根据染料消耗量即可计算出样品中还原型维生素C的含量。

图8-1 维生素C检测原理

三、试剂

（1）1%草酸溶液：称取1 g草酸溶于少量蒸馏水中，定容至100 mL。 （2）2%草酸溶液：称取2 g草酸溶于少量蒸馏水中，定容至100 mL。 （3）标准抗坏血酸溶液（0.1 mg / mL）：精确称取纯抗坏血酸10 mg（应为洁白色，如变黄则不能用），用1%草酸溶液溶解并定容至100 mL。此溶液应贮存于棕色瓶中，最好现用现配。

（4） 0.05%2, 6–二氯酚靛酚溶液：称取500 mg 2, 6–二氯酚靛酚溶于300 mL含104 mg碳酸氢钠（A.R.）的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至1000 mL，过滤后贮存于棕色瓶中，4℃冷藏可稳定一周，临用前用标准抗坏血酸标定。

四、器材

电子太平、组织捣碎机（或研钵）、微量滴定管（5 mL）、容量瓶（100 mL、1000 mL）、刻度吸管、三角瓶（100 mL）。

五、操作步骤

1. 提取

将新鲜的蔬菜或水果用水洗净后，用纱布或吸水纸吸干表面水分。称取50 g果蔬，加入50 mL 2%草酸，用组织捣碎机打成匀浆。过滤后滤液备用，滤饼可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，记录滤液的总体积。

2. 2, 6–二氯酚靛酚溶液的标定

准确吸取4.0 mL标准抗坏血酸溶液（含0.4 g抗坏血酸）于100 mL锥形瓶中，加入16 mL 1%草酸溶液，用2, 6–二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色（15 s不褪色即为终点）。记录所用染料溶液的体积，计算出1 mL染料溶液所能氧化的抗坏血酸的毫克数。

3. 样品滴定 准确吸取两份样品提取液，各20 mL于100 mL锥形瓶中，用已标定过的2, 6–二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色（15 s不褪色即为终点），记录所用染料溶液的体积。每个样品做三次重复。

4. 空白滴定

吸取20 mL 1%草酸溶液于100 mL锥形瓶中，作三份空白对照滴定。 5. 计算

式中：V1 — 滴定两份样品所消耗的染料的平均毫升数；

V2 — 滴定空白对照所消耗的染料的平均毫升数； V — 样品提取液的总体积；

V3 — 滴定时取用的样品提取液的体积；

M — 1 mL染料所能氧化的抗坏血酸的毫克数； W — 待测样品的重量（克）。

六、注意事项

（1）在选择实验材料的时候尽量避免选择提取后带有较深颜色的材料，否则会干扰滴定终点的判断。

如样品本身带有较浅的颜色，可使用硅藻土脱色，或者在滴定前预先加入2 ~ 3 mL 二氯乙烷，以二氯乙烷层变为淡红色为滴定终点。 （2）本法只能测定还原型维生素C的含量，不能测定具有同样生理功能的氧化型和结合型维生素C的含量。

（3）用2%草酸制备提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免维生素C变为氧化型而无法滴定，而1%草酸无此作用。

（4）如样品浆状物泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。

（5）样品提取制备和滴定过程中，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免破坏维生素C。

（6）滴定过程宜迅速，一般不超过2 min。药品滴定消耗染料以1 ~ 4mL为宜，如超出此范围，应增加或减少样品提取液的用量。

（二）分光光度法

一、实验目的

（1）掌握维生素C测定的原理和方法。

（2）了解蔬菜、水果中维生素C的含量情况。

二、实验原理

维生素C 是烯醇化合物，具有－C＝C－基，在可见光区无吸收，在紫外区有吸收。按实验方法，分别对不同浓度的标准维生素C与试剂空白溶液在200 ~ 400 nm波长范围内进行扫描，通过吸收光谱曲线法确定维生素C水溶液的最大吸收波长。又根据维生素C对碱不稳定的特性，于最大吸收波长处测定样品溶液与碱处理样品两者吸光度之差，通过查标准维生素C的校准曲线，即可计算样品中维生素C的含量。这种方法具有准确、快速、重现性好等优点，还适合深色样品的测定。

由于维生素C 极不稳定，在样品前处理过程中，防止抗坏血酸的氧化是非常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解决。因为它们均能抑制抗坏血酸的氧化酶，而起稳定作用。但由于2%草酸在波长200 ~ 400 nm处有非常强的吸收，所以不能作为维生素C 的提取液，而2%偏磷酸虽然在波长200 ~ 400 nm处有微弱的吸收，可通过扣除其空白吸光值，便可计算出样品维生素C 的吸光值差 ?A。因此，本实验选择2%偏磷酸作为分光光度法的溶剂。

三、试剂

标准抗坏血酸溶液（0.1 mg / mL）：精确称取抗坏血酸10 mg (准确至0.1 mg) ，用2% 偏磷酸溶解并定容至100 mL。此溶液应贮存于棕色瓶中，最好现用现配。

2% (W / V ) 偏磷酸溶液和0.5mol / L NaOH溶液。

四、器材

紫外–可见分光光度计、石英比色皿、组织捣碎机、高速离心机、50 mL 容量瓶、1000 mL容量瓶、10 mL 移液管、10 mL比色管。

五、操作步骤

1. 标准曲线的测定

（1）绘制吸收光谱曲线：以蒸馏水为参比，取标准抗坏血酸溶液6.00 mL，在220 ~ 320 nm 范围绘制维生素C 的吸收光谱曲线，并确定最大吸收峰所对应的入射光波长λmax。

（2）绘制标准曲线：吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 抗坏血酸标准溶液，置于10mL 比色管中；用2% 偏磷酸定容，摇匀。此标准系列抗坏血酸的浓度分别为0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0、12.0 μg / mL。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1 cm石英比色皿测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光度。抗坏血酸吸光度为A，试剂空白吸光度为A0，计算吸光度差 ?A = A － A0。以吸光度差值⊿A 对抗坏血酸浓度C 绘制校准曲线。

2. 样品的提取

将水果、蔬菜样品洗净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。称取具有代表性样品的可食部分100 g，放入组织捣碎机中，加入100 mL 2.0%偏磷酸溶液，迅速捣成匀浆。称取10 ~ 50 g 浆状样品，用2.0%偏磷酸将样品移入100 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。若提取液澄清透明，则可直接取样测定，若有浑浊现象，可通过离心来消除。

3. 样品的测定

准确移取澄清透明的0.1 ~ 0.5 mL的提取液，置于10 mL 的比色管中，用2% 偏磷酸稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1 cm 石英比色皿测定其吸光度。每个样品做三次重复。

待测碱处理样液的测定：分别吸取0.1 ~ 0.5 mL澄清透明提取液，加入6 滴0.5 mol / L 的NaOH溶液，置于10 mL 比色管中混匀，在室温放置40 min 后，加入2%偏磷酸稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处测定其吸光度。每个样品做三次重复。

4. 结果计算

由待测样品与待测碱处理样品的吸光值之差查校准曲线，即可计算出样品中维生素C 的含量，也可直接以待测碱处理液为参比，测得待测液的吸光值，通过查校准曲线，计算出样品的维生素C的含量。

式中：m —— 样品重量（g）；

200 —— 稀释倍数；

C —— 从校准曲线上查得抗坏血酸的含量，μg / mL； V —— 测试时吸取提取液体积，mL。

六、注意事项

（1）在优化的实验条件下得到的校准曲线，表明维生素C在1.00 ~ 12.0 μg / mL范围内吸光度与浓度C之间呈良好的线性关系，服从朗伯比尔定律。所以测定的最大吸光度值最好不要超过0.8 A，否则浓度过高容易造成曲线弯曲。

（2）要求每批测定样品都要有校准曲线。

（3）在处理样品时，如遇到泡沫产生，可以加入数滴辛醇消除。

（4）若样品浑浊，则可用离心机分离。用转速3000 rpm，时间约为20 ~ 30min，至样液澄清、透明，取上清液分析。

（5）一般分析纯抗坏血酸纯度为99. 5%以上，可不标定。如试剂发黄，则弃去不用。

式中：m —— 样品重量（g）；

200 —— 稀释倍数；

C —— 从校准曲线上查得抗坏血酸的含量，μg / mL； V —— 测试时吸取提取液体积，mL。

六、注意事项

（1）在优化的实验条件下得到的校准曲线，表明维生素C在1.00 ~ 12.0 μg / mL范围内吸光度与浓度C之间呈良好的线性关系，服从朗伯比尔定律。所以测定的最大吸光度值最好不要超过0.8 A，否则浓度过高容易造成曲线弯曲。

（2）要求每批测定样品都要有校准曲线。

（3）在处理样品时，如遇到泡沫产生，可以加入数滴辛醇消除。

（4）若样品浑浊，则可用离心机分离。用转速3000 rpm，时间约为20 ~ 30min，至样液澄清、透明，取上清液分析。

（5）一般分析纯抗坏血酸纯度为99. 5%以上，可不标定。如试剂发黄，则弃去不用。

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