银染方法总汇及注意事项

ptotocol是这样的，请看哪里不妥： 蛋白银染步骤 步骤 溶液 时间 固定 甲醇 100ml 冰醋酸 25ml

加双蒸水至250ml 30min 冲洗 双蒸水 3次 敏化 甲醇 75ml

戊二醛（25%w/） 1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/) 10ml 醋酸钠（17g）

加双蒸水至250ml 30min 冲洗 双蒸水 3次

银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml 甲醛(37%w/) 0.1ml

加双蒸水至250ml 20min 冲洗 双蒸水 2次 显色 碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min

终止 EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min 冲洗 双蒸水 3次

建议使用silia的方法！！ 简单，快！

本人的银染方法：

1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟； 2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟； 3. 预处理：0.02％ Na2S2O3 处理一分钟； 4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；

5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟； 6. 水洗：同上；

7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％ Na2S2O3, 漂洗10－15分钟； 8. 水洗：同上；

9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！

5.2.2.3 银染色

1 银染液1（1000ml） ： 甲醇50％ 乙酸12％ 甲醇 500ml 冰醋酸 120ml

2 银染液2（1000ml）： 甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%， （含乙酸 1－2ml）

甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml 3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛 0.02% 无水碳酸钠25g， 甲醛1.5ml 4 硝酸银（100ml）： 20%硝酸银 （过滤后待用）

染色步骤：

1 银染液1 洗2次， 每次5分钟 2 银染液2 洗1次，每次30分钟 3 超纯水 洗2次， 每次1分钟 4 0.5%硝酸银 洗30分钟

5 超纯水洗5次，每次1分钟 （关键步骤，共计5分钟）显色液显色 6 看到各条带，则倾去显色液, 1％ 乙酸中止

我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。但水洗不充分又可能导致背景较深。 我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。

固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水

浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛 0.625ml，0.2% NaS2O3?5H2O 银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛 显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛 终止液：1.46% EDTA-2Na?2H2O

silia wrote:

我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下： 1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟 2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒 3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒

4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗 5）加中止液10％乙酸中止即可

银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，对关键操作及要求做了补充！主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋 白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究

银染操作规程

实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。

试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛

实验操作程序：

固定：30min或者更长时间

100ml 乙醇 40% 乙醇 25ml冰醋酸 10% 冰醋酸 加水到250ml 致敏：30min

75ml 乙醇 30% 乙醇 17g 乙酸钠 28.2g 三水乙酸钠 0.5g硫代硫酸钠

加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min 银染：20min 0.625g AgNO3

100 ul 37%甲醛 （在使用前加入） 加水到终体积250ml

水洗： 2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色) 显色：视情况而定 6.25 g Na2CO3

50 ul 37% 甲醛 （在使用前加入） 加水到终体积250ml 终止：10min

3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸 加水到终体积250ml 保存：1% 冰醋酸，4 ℃ 注意事项：

1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。

2．甲醛在使用前加入。

3． 最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。

4． 显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。

5．银染液和显色液需要预冷。

6． 所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！

7． 清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。

银染注意事项:

1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。

2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。

3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。

4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.

5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。

7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。 8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。

10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。

11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。

12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。

13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。

14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。

15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。

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