暗霉素定向生物合成研究

分 类 号 Q78 密级 公开 收藏编号 学号 N110820019 学校代码 10386 编号

暗霉素定向生物合成研究

学研

科究

专方

业： 生物化学与分子生物学 向： 应用微生物学 名： 肖剑萍

研究生姓

指导教师、职称： 洪文荣 教授 所

在

学

院： 生物科学与工程学院

答辩委员会主席签名：

二〇一四年 六月

一 遵守学术行为规范承诺

本人已熟知并愿意自觉遵守《福州大学研究生和导师学术行为规范暂行规定》的所有内容，承诺所提交的毕业和学位论文是终稿，不存在学术不端行为，且论文的纸质版与电子版内容完全一致。

二 独创性声明

本人声明所提交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得福州大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

三 关于论文使用授权的说明

本人完全了解福州大学有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）

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1、保密论文： □本学位论文属于保密，在 年解密后适用本授权书。 2、非保密论文： √本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。

研究生本人签名： 肖剑萍 签字日期：2014 年 6 月 4 日

研究生导师签名： 洪文荣 签字日期：2014 年 6 月 4 日

暗霉素定向生物合成研究

中文摘要

妥布霉素是临床使用的重要抗生素，其产业化生产菌黑暗链霉菌Tt-49主产安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素等复合物。利用基因工程技术，先阻断安普霉素的生物合成，后进一步阻止氨甲酰基修饰，获得单组分妥布霉素工程菌。在此基础上，插入可能负责庆大霉素C3', C4'脱羟基作用的基因模块，探索其与安普霉素和妥布霉素生物合成基因组合的可能性。具体内容如下：

1. aprH基因缺失突变株TH304的构建：构建重组质粒pTH407，经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49，得到单交换工程菌TH303。经松弛培养后，利用影印筛选和PCR鉴定，获得aprH基因缺失突变株TH304。经发酵检测，TH304生产力约2250 μ/mL，为Tt-49的75%。TLC分析和MS分析确认，TH304不再合成安普霉素，主要积累氨甲酰妥布霉素。但与Tt-49相比，TH304生长周期较长，产孢能力差，不利于生产上的应用。

2. aprJ基因缺失突变株TJ302的构建：构建重组质粒pTJ401，导入黑暗链霉菌Tt-49，获得aprJ基因缺失突变株TJ302。发酵结果显示，TJ302不再合成安普霉素，主要积累氨甲酰妥布霉素，总效价约2500 μ/mL，为Tt-49的85%。经考察发现，TJ302生长性状稳定，适合进一步改造。

3. tobZ基因缺失突变株TJZ308的构建：将重组质粒pTZ501，导入黑暗链霉菌TJ302，获得tobZ基因缺失突变株TJZ308。发酵结果显示，TJZ308为单组分妥布霉素产生菌，且发酵单位与TJ302相近。发酵提取妥布霉素无需层析分离，就能达到药典规定的质量标准，解决了困扰企业几十年的关键技术难题，填补了国内外的研究空白。

4. 庆大霉素3', 4'脱羟基酶基因与妥布霉素生物合成基因的组合研究：构建将红霉素启动子ermE*组装于genB3-P-B4基因模块上游的重组质粒pZP606，导入黑暗链霉菌TJZ308，组合至妥布霉素生物合成基因簇的tobZ位点，获得工程菌TZP310。发酵结果显示，TZP310发酵单位显著下降，仅300 μ/mL左右。经MS分析确认，genB3-P-B4基因模块的插入，破坏了妥布霉素的正常合成，使代谢产物停滞于尼泊拉胺。

5. 庆大霉素3', 4'脱羟基酶基因与安普霉素生物合成基因的组合研究：构建重组质粒pDP605，导入黑暗链霉菌ST314，组合至安普霉素生物合成基因簇的aprD3-D4位点，获得工程菌TDP306，其发酵单位与ST314相近。经MS分析确认，TDP306仍积累卡那霉素B，genB3-P-B4基因模块的插入，并未达到定向合成地贝卡星的预期效果。但确定了外源基因的插入位点，为进一步研究庆大霉素3', 4'脱羟基酶基因在链霉菌中的表达，生物合成地贝卡星奠定了基础。

关键词：暗霉素，定向生物合成，妥布霉素，安普霉素，黑暗链霉菌

I

Study on Directed Biosynthesis of Nebramycins

Abstract

Tobramycin is an important clinical antibiotic. Streptomyces tenebrarius Tt-49 is an industrial strain, mainly producing apramycin, carbamoyltobramycin, tobramycin and other compounds. In order to obtain a single compound tobramycin producing strain, the biosynthesis of apramycin was firstly blocked by using genetic engineering techniques. And then, the carbamylation was further interdicted. On this basis, to explore the possibility of combinating the exogenous genes with apramycin and tobramycin biosynthesis genes, gene modules, which may be responsible for gentamicin C3', C4' dehydroxylation, was inserted. The details are as follows:

1. Construction of aprH gene deletion strain TH304: The single crossover mutant TH303 was obtained after the recombinant plasmid pTH407 has been introduced to S. tenebrarius Tt49 by conjugation. The aprH gene deletion strain TH304 was selected by replica plating and PCR analysis after TH303 has been continuously cultured in the absence of erythromycin. The result of fermentation showed that the antibiotic production of TH304 was 2250 μ/mL, about 75% of Tt49’ s. TLC and MS analysis indicated that TH304 mainly produced carbamoyltobramycin, apramycin was no longer produced. However, in contrast to Tt-49, TH304 had a longer growth cycle and poor spore production ability, it was not conducive to the industrial manufacture.

2. Construction of aprJ gene deletion strain TJ302: The aprJ gene deletion strain TJ302 was obtained after the recombinant plasmid pTJ401 has been introduced to S. tenebrarius Tt49 by conjugation. The result of fermentation showed that the antibiotic production of TJ302 was 2500 μ/mL, about 85% of Tt49’ s. TJ302 mainly produced carbamoyltobramycin, apramycin was no longer produced. The research found that TJ302 had a more stable growth characteristics, it was more suitable for further reform.

3. Construction of tobZ gene deletion strain TJZ308: The tobZ gene deletion strain TJZ308 was obtained after the recombinant plasmid pTZ501 has been introduced to S. tenebrarius TJ302 by conjugation. The antimicrobial activity of TJZ308 was as same as TJ302. TLC and MS analysis indicated that, TJZ308 was a single compound tobramycin producing strain. The quality of tobramycin could achieve the standards set by the pharmacopoeia without chromatography separation. It has not noly solved the key technical problems, which have troubled company about for decades, but also filled the blank at domestic and abroad research.

4. The combination of gentamicin 3', 4' dehydroxylation genes and tobramycin biosynthesis genes: The recombinant plasmid pZP606, which has been constructed for ermE* and genB3-P-B4 genes insertion, was introduced to S. tenebrarius TJZ308. The gene insertion strain

II

TZP310 was obtained after ermE* and genB3-P-B4 genes has been integrated to tobramycin biosynthesis gene tobZ. The total titer of antibiotic production of TZP310 has seriously reduced, which was only about 300 μ/mL. MS analysis showed that, tobramycin was no longer produced. TZP310 only produced nebremine as the insertion of genB3-P-B4 genes.

5. The combination of gentamicin 3', 4' dehydroxylation genes and apramycin biosynthesis genes: The recombinant plasmid pDP605 was introduced to S. tenebrarius ST314. The gene insertion strain TDP306 was obtained after ermE* and genB3-P-B4 genes has been integrated to apramycin biosynthesis genes aprD3-D4. The antibiotic production of TDP306 was as same as ST314. MS analysis showed that, TDP306 still accumulated kanamycin B, dibekacin was not biosynthesis as expected as the insertion of genB3-P-B4 gene. However, the insertion loci of exogenous gene has been affirmed, which was essential to further research the expression of gentamicin 3', 4' dehydroxylation genes in the S. tenebrarius and provide the condition of dibekacin biosynthesis.

Key words: Nebramycins, Directed biosynthesis, Tobramycin,

Apramycin, Streptomyces tenebrarius

III

目 录

中文摘要 ............................................................................................................................................................... I Abstract ........................................................................................................................................................... II 目 录 ................................................................................................................................................................ IV 第一章 引言 ........................................................................................................................................................ 1

1.1 暗霉素在抗生素中的地位 ................................................................................................................... 1

1.1.1 氨基糖苷类抗生素简介 ............................................................................................................ 1 1.1.2 氨基糖苷类抗生素的分类 ........................................................................................................ 1 1.1.3 氨基糖苷类抗生素的抗菌机制 ................................................................................................ 3 1.1.4 氨基糖苷类抗生素的耐药机制 ................................................................................................ 4 1.1.5 氨基糖苷类抗生素的生物合成研究进展 ................................................................................ 5 1.2 黑暗链霉菌及其次级代谢产物 ........................................................................................................... 6

1.2.1 黑暗链霉菌简介 ........................................................................................................................ 6 1.2.2 暗霉素简介 ................................................................................................................................ 7 1.3 暗霉素生物合成基因研究进展 ........................................................................................................... 8

1.3.1 安普霉素生物合成基因研究进展 ............................................................................................ 8 1.3.2 妥布霉素生物合成基因研究进展 ...........................................................................................11 1.4 暗霉素定向生物合成研究进展 ......................................................................................................... 13

1.4.1 安普霉素定向生物合成研究进展 .......................................................................................... 13 1.4.2 妥布霉素定向生物合成研究进展 .......................................................................................... 14 1.5 选题依据与研究内容 ......................................................................................................................... 14

1.5.1 选题依据 .................................................................................................................................. 14 1.5.2 研究内容 .................................................................................................................................. 15

第二章 材料与方法 .......................................................................................................................................... 16

2.1 实验材料 ............................................................................................................................................. 16

2.1.1 菌株与质粒 .............................................................................................................................. 16 2.1.2 培养基 ...................................................................................................................................... 17 2.1.3 试剂 .......................................................................................................................................... 18 2.1.4 仪器与设备 .............................................................................................................................. 20 2.1.5 其他 .......................................................................................................................................... 20 2.2 实验方法 ............................................................................................................................................. 20

2.2.1 菌种培养与保藏 ...................................................................................................................... 20 2.2.2 引物设计 .................................................................................................................................. 21 2.2.3 黑暗链霉菌基因组DNA的提取 ........................................................................................... 22

IV

2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）....................................................................................................... 22 2.2.5 DNA片段回收 ......................................................................................................................... 23 2.2.6 DNA酶切反应 ......................................................................................................................... 24 2.2.7 DNA酶连反应 ......................................................................................................................... 24 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 .................................................................................................. 25 2.2.9 质粒转化 .................................................................................................................................. 25 2.2.10 SDS碱裂解法制备质粒DNA（小量制备） ....................................................................... 26 2.2.11 大肠杆菌-链霉菌接合转移 ................................................................................................... 26 2.2.12 黑暗链霉菌的摇瓶发酵 ........................................................................................................ 27 2.2.13 黑暗链霉菌次级代谢产物的处理 ........................................................................................ 27 2.2.14 效价测定（二剂量法） ........................................................................................................ 28 2.2.15 暗霉素的检测 ........................................................................................................................ 28

第三章 aprH基因缺失突变株的构建 ............................................................................................................. 30

3.1 重组质粒pTH407的构建 .................................................................................................................. 30

3.1.1 黑暗链霉菌Tt-49基因组的提取 ........................................................................................... 31 3.1.2 同源交换臂的扩增 .................................................................................................................. 32 3.1.3 抗性筛选标记的扩增 .............................................................................................................. 32 3.1.4 重组质粒pTH407的构建 ....................................................................................................... 32 3.2 aprH基因缺失突变株的筛选 ............................................................................................................. 34

3.2.1 接合转移 .................................................................................................................................. 34 3.2.2 单交换工程菌的鉴定 .............................................................................................................. 34 3.2.3 aprH基因缺失突变株的筛选 .................................................................................................. 35 3.3 工程菌TH304次级代谢产物分析 .................................................................................................... 36 3.4 小结 ..................................................................................................................................................... 37 第四章 aprJ基因缺失突变株的构建 .............................................................................................................. 39

4.1 重组质粒pTJ401的构建 ................................................................................................................... 39

4.1.1 同源交换臂的扩增 .................................................................................................................. 40 4.1.2 重组质粒pTJ401的构建 ........................................................................................................ 41 4.2 aprJ基因缺失突变株的筛选 .............................................................................................................. 42

4.2.1 单交换工程菌的鉴定 .............................................................................................................. 42 4.2.2 aprJ基因缺失突变株的筛选 ................................................................................................... 43 4.3 工程菌TJ302次级代谢产物分析 ..................................................................................................... 44 4.4 小结 ..................................................................................................................................................... 45 第五章 单组分妥布霉素工程菌的构建 .......................................................................................................... 47

5.1 tobZ基因缺失突变株的构建 .............................................................................................................. 47

V

5.1.1 单交换工程菌的鉴定 .............................................................................................................. 47 5.1.2 tobZ基因缺失突变株的筛选 ................................................................................................... 48 5.2 工程菌TJZ308次级代谢产物分析 ................................................................................................... 49 5.3 小结 ..................................................................................................................................................... 50 第六章 庆大霉素-妥布霉素生物合成基因组合的探索 ................................................................................. 51

6.1 重组质粒pZP606的构建 .................................................................................................................. 52

6.1.1 红霉素启动子ermE*与genB3-P-B4基因模块的扩增 ......................................................... 53 6.1.2 重组质粒pZP606的构建 ....................................................................................................... 54 6.2 庆大霉素-妥布霉素生物合成基因的组合 ........................................................................................ 55

6.2.1 单交换工程菌的鉴定 .............................................................................................................. 55 6.2.2 基因组合工程菌的筛选 .......................................................................................................... 56 6.3 工程菌TZP310代谢产物分析 .......................................................................................................... 57 6.4 小结 ..................................................................................................................................................... 58 第七章 庆大霉素-安普霉素生物合成基因组合的探索 ................................................................................. 60

7.1 重组质粒pDP605的构建 .................................................................................................................. 60 7.2 庆大霉素-安普霉素生物合成基因组合工程菌的构建 .................................................................... 62

7.2.1 单交换工程菌的鉴定 .............................................................................................................. 62 7.2.2 基因组合工程菌的筛选 .......................................................................................................... 63 7.3 工程菌TDP306代谢产物分析 ......................................................................................................... 64 7.4 小结 ..................................................................................................................................................... 65 全文总结 ............................................................................................................................................................ 67 参考文献 ............................................................................................................................................................ 68 致 谢 ................................................................................................................................................................ 72 附录 .................................................................................................................................................................... 73 个人简历 ............................................................................................................................................................ 80

VI

暗霉素定向生物合成研究

第一章 引言

1.1 暗霉素在抗生素中的地位

1.1.1 氨基糖苷类抗生素简介

暗霉素属氨基糖苷类抗生素，是临床使用的重要抗感染药物。自1944年Waksman发现链霉素以来，氨基糖苷类抗生素便以其优异的抗菌活性而得到高度关注。几十年来，该抗生素作为一种高效的抗菌药物，在临床上广泛使用，并以抗菌谱广、疗效好、性质稳定和生产工艺简单等优势备受青睐。美国Achaogen公司通过对西索米星进行结构修饰，筛选到了ACHN-490，并被誉为“新一代氨基糖苷类抗生素”。该衍生物对产氨基糖苷类钝化酶的葡萄球菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌等具有明显的抗菌活性，被认为是一种对抗全世界医疗机构中耐药菌的潜在有效药物[1]。目前，该药物已完成I期临床研究，进入了II期临床研究阶段[2]。

氨基糖苷类抗生素是一大类在分子中含有氨基糖苷结构的抗生素，其化学结构以氨基糖与氨基环醇母核缩合而成。一般为白色或淡黄色晶体或无定形的粉末，易溶于水，微溶或不溶于有机溶媒。这类抗生素的抗菌活性取决于糖基与氨基环醇母核的组合，通过与细菌核糖体RNA的特殊交互作用，来抑制细菌蛋白质的合成[3]。

根据氨基糖苷类抗生素的结构特征以及抗菌活力，可将其划分为三代：第一代以卡那霉素为代表，其结构特征为完全羟基化的氨基糖与氨基环醇母核结合，均不抗铜绿假单胞菌，品种最多，包括链霉素、新霉素、巴龙霉素和核糖霉素等；第二代以庆大霉素为代表，其化学结构中均含有脱氧氨基糖，抗铜绿假单胞菌，包括西索米星、小诺霉素、妥布霉素和地贝卡星等；第三代则全是1-N-(2-DOS)取代的半合成衍生物，以奈替米星为代表，包括阿贝卡星、阿米卡星和依替米星等，特点是保留母体的抗菌活性，抗耐药菌，耳肾毒性小等[4]。

1.1.2 氨基糖苷类抗生素的分类

氨基糖苷类抗生素的发展历经半个多世纪，已报道的天然和半合成氨基糖苷类抗生素超过3000种，其中由微生物产生的天然氨基糖苷类抗生素有近200种，从各种途径得到的新化合物多达300余种，而具有临床价值的不下70多种，已在临床应用的有50多种，有些品种应用于农牧业领域[5]。根据各氨基环醇母核生物合成起始点（图1-1）的不同，这类抗生素可分为四类：1）肌醇衍生类；2）2-脱氧鲨肌醇衍生类；3）2-表-5-表-有效酮醇衍生类；4）环戊糖醇衍生类[6]。

1

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OHHOOHHOOHOHOOHHOOHOHOHHOOHOHHOOHOHHOOHOHOOH肌醇2-脱氧鲨肌醇2-表-5表-有效酮醇环戊糖醇

图1-1 不同氨基环醇母核生物合成起始点

Fig. 1-1 The biosynthetic origin of different core aminocyclitol moieties

CH2OHHONH2OOHOHOHOOOHOR2HNOHNHR1OHH2NHOOHOONHCH3OHONH2NH2OHOOHOHygromycin BDestomycin ASS-56-CR1CH3HHR2HCH3HR3R3HHOHNH2OHApramycin

图1-3 6-单取代脱氧链霉胺衍生物

Fig. 1-3 6-monosubstituted 2-deoxystreptamine-derived aminoglycoside

OHHOHONH2OHHOONH2OONH2OOHNH2图1-2 5-单取代脱氧链霉胺衍生物

Fig. 1-2 5-monosubstituted 2-deoxystreptamine-derived aminoglycoside

NH2HOHOHOONH2OONH2OOOOHR2R1OHOHOOOHR2R1OHOHH2NH2NNeomycin BNeomycin CNH2HOHOHOONH2OOR1R2HCH2NH2CH2NH2HParomomycin IParomomycin IINH2HOHOHOONH2OOR1NH2OR1R2HCH2NH2CH2NH2HNH2OOHOHHNOHONH2NH2HOOHR1OHRibostamycinButirosin AButirosin BR1OHHR2HOH

图1-4 4, 5-双取代脱氧链霉胺衍生物

Fig. 1-4 4, 5-disubstituted 2-deoxystreptamine-derived aminoglycoside

2

暗霉素定向生物合成研究

同其它2-脱氧鲨肌醇衍生类抗生素一样，暗霉素以2-脱氧鲨肌醇为起始点，经C-1位的氧化、转氨和C-3位转氨作用，生成2-脱氧链霉胺母核，因此这类抗生素又称为2-脱氧链霉胺衍生物[7]。根据氨基糖在2-脱氧链霉胺上取代位置的不同，该类又可细分成四种类型：1）5-单取代脱氧链霉胺衍生物，包括潮霉素B、越霉素A等（图1-2）；2）6-单取代脱氧链霉胺衍生物，如安普霉素（图1-3）；3）4, 5-双取代脱氧链霉胺衍生物，包括新霉素、巴龙霉素、核糖霉素和布替罗星等（图1-4）；4）4, 6-双取代脱氧链霉胺衍生物，如庆大霉素、西索米星、卡那霉素、妥布霉素及其他相关化合物（图1-5）。

R2R1ONH2H2NOHOOHOOH3CHNCH3OHHONH2ONH2H2NOHOOOH3CHNCH3OHR1HOHONH2ONH2R2OHOOHOONH2OHOHNH2NH2Gentamycin C1Gentamycin C1aGentamycin C2NH2HOOR1CH3HCH3R2NH2CH3NH2NH2NH2OSisomicin C1Kanamycin AKanamycin BKanamycin CNH2OR1NH3NH2OHR2OHNH2NH2NH2H2NOHOOHOONH2OHOHNH2H2NOHONH2NH2OHOONH2OHOHH2NOHONH2HNOHNH2OOHOOOHOHNH2TobramycinDibekacinArbekacin

图1-5 4, 6-双取代脱氧链霉胺衍生物

Fig. 1-5 4, 6-disubstituted 2-deoxystreptamine-derived aminoglycoside

1.1.3 氨基糖苷类抗生素的抗菌机制

细菌核糖体负责蛋白质的合成，依靠rRNA-蛋白质相互作用以及蛋白质-蛋白质相互作用集合在一起，包括两个亚基，即50S大亚基和30S小亚基。16S rRNA对30S小亚基的功能起着重要作用，能与50S大亚基、mRNA以及A位和P位中的tRNA反密码子直接作用。2-脱氧链霉胺氨基糖苷类抗生素的抗菌机制，主要是作用于细菌核糖体30S亚基16S rRNA解码区的A位点，导致翻译过程平移精确度降低甚至中止位移，最终抑制细菌蛋白质的合成。其中，抗生素环Ⅰ被认为主要负责与16S rRNA的结合，通过插入到由A1408、A1492、A1493和碱基对C1409-G1491形成的内环，进而发生相互作用。结合位点如图1-6所示，环Ⅰ与A1408形成氢键，与G1491则是通过碱基堆积力作用。即使抗生素化学结构发生变化，环Ⅰ仍然作用同一区域，并与1408位点的腺嘌呤形成“伪碱基对”，由环Ⅰ上的氧原子接受腺嘌呤N6位的氢键，而C6'位的羟基或氨基则为腺嘌呤N1位提供氢键[8]。

3

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图1-6 环Ⅰ与16S rRNA A位点的相互作用

Fig. 1-6 Interaction of ring I with residues in the A site loop of 16S rRNA

1.1.4 氨基糖苷类抗生素的耐药机制

细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制主要有两方面：一方面是产生一种或多种钝化酶，如酰基转移酶（AAC）、腺苷转移酶（ANT）或核苷转移酶（ADD），以及磷酸转移酶（APH）等，对进入胞内的抗生素进行修饰，使之失活（以卡那霉素B为例，其被钝化酶修饰的位点如图1-7所示）；另一方面是氨基糖苷类抗生素的作用靶标（16S rRNA），或与rRNA结合的核蛋白发生突变，导致抗生素不能与靶标结合或结合力降低。除此之外，研究还发现其它的耐药机制，如细菌对抗生素的吸收能力降低以及细胞膜的通透性降低等。从临床耐药菌中发现的耐药机制，在许多氨基糖苷类抗生素产生菌中同样存在。因此，研究认为作用靶标或核蛋白结构变异所致的耐药程度，与产生菌合成抗生素的能力具有正相关性[9]，这对采用抗自身代谢产物筛选高产菌株，具有重要意义。

4

暗霉素定向生物合成研究

AAC(6')ONHCCH3OH3CCHNOAAC(2')AAC(3)ONHCCH3OHOO-2ANT(4')AMPO-2O3POAPH(3')NH2OHOHO3POOAPH(2'')ONHCCH3AAC(3'')

图1-7 卡那霉素B的化学结构及其被钝化酶修饰的位点

Fig. 1-7 The chemical construction and modification sites of kanamycin B

1.1.5 氨基糖苷类抗生素的生物合成研究进展

对氨基糖苷类药物生物合成的研究，已有几十年。最初采用放射性同位素喂养、稳定同位素标记、营养缺陷突变株选育及中间产物积累等研究法，都未能有效证明合成过程中酶的反应机制。后来，Walker[10]等人应用酶学分析的方法，对生物合成途径中酶的反应水平进行研究，得到了重要信息。但由于次级代谢过程中参与酶较多，且提取困难，限制了这一方法的发展。

1999年，作为2-脱氧链霉胺生物合成途径中，催化第一步反应的关键酶，2-脱氧鲨肌醇合酶的相关基因 btrC首先被克隆，并被证实具有2-脱氧鲨肌醇合酶活性[11]。接着，研究人员通过染色体步移法，以2-脱氧鲨肌醇生物合成基因为基础，第一次成功克隆了丁酰苷菌素生物合成基因簇[12]，进而推动其它2-脱氧链霉胺衍生类药物生物合成基因簇的鉴定。例如，新霉素、巴龙霉素、核糖霉素、庆大霉素、西索米星、卡那霉素、妥布霉素以及天神霉素等。此外，链霉素、奇霉素、福提霉素、春雷霉素、潮霉素A、阿卡波糖和井冈霉素等生物合成基因簇也相继被公布（表1-1），从而揭开了利用基因工程技术研究氨基糖苷类抗生素生物合成机制的序幕。

2005年开始，本课题组[13-16]先后从依纽小单孢菌（Micromonospora inyoensis）中克隆得到高抗性基因sisR、2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB、2-脱氧蟹肌胺(DOIA)脱氢酶基因sisP和糖基转移酶基因sisZ。并在此基础上，以抗性基因和保守性基因为探针，从依纽小单孢菌TS388和HP变种分别克隆，得到两套西索米星生物合成基因簇（GeneBank：FJ160413和JF431003）[17]。随后，绛红色小单孢菌生产菌株G1008基因文库的构建，及其庆大霉素生物合成基因簇（GeneBank：JQ975418）的获得，则进一步推动了庆大霉素生物合成特色基因的研究。通过与西索米星生物合成基因簇比较，推测绛红色小单孢菌的gntI基因和伊纽小单孢菌sisI基因应为3',4'-双脱羟基酶基因，并对其进行分析与预测，为该酶的功能研究提供了参考[18]。2012年，庆大霉素生物合成基因gntK的敲除结果表明，GntK负责绛红糖胺C-6′甲基化。这是国内外首次，在庆大霉素生物合成基因研究中取得实验性突破，为早日揭开庆大霉素生物合成调控机制奠定了基础[19]。

5

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表1-1 已公布的氨基糖苷类抗生素生物合成基因簇

Tab. 1-1 Biosynthetic gene clusters for aminoglycoside antibiotics

Gene

Compound Producing organism

cluster

GenBank LOCUS

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

amglyccycl-butyrolactone

lant terpene-nrps ectoine terpene butyrolactone

t1pks-nrps-butyrolactone

other siderophore siderophore t2pks other butyrolactone melanin other other siderophore t2pks nrps-t1pks butyrolactone terpene bcin nrps terpene

lant-t2pks-terpene

other t1pks-nrps lant terpene

29 terpene C1

C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C29 50 26 56 7 18 8 93 39 19 22 36 43 7 9 30 37 19 36 68 8 26 16 55 17 66 33 44 23 32 32

Aureothin-like

granaticin

Jad-like

spore pigment

1.2 黑暗链霉菌及其次级代谢产物

1.2.1 黑暗链霉菌简介

黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）属放线菌科链霉菌属，1967年由美国礼莱公司（Eli Lilly and Company）研究人员从墨西哥土壤中分离而得[20]。黑暗链霉菌的孢子丝呈螺旋形或波曲状，孢子为圆形或圆柱形，表面光滑。黑暗链霉菌生长良好时，斜面生长周期为3～4天，菌落呈雪白色（图1-8 A）。但传代不稳定，退化的显著特征是出现淡黄色菌落，且菌落表面有褶皱（图1-8 B）[21]。

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暗霉素定向生物合成研究

AB

图1-8 黑暗链霉菌菌落特征

Fig. 1-8 Culture characteristics of Streptomyces tenebrarius

1.2.2 暗霉素简介

暗霉素（Nebramycins）是由黑暗链霉菌发酵产生的一系列化合物，至少包括8个组分，且均为氨基糖苷类抗生素。根据这些组分在纸色谱上移动的先后顺序，依次称之为暗霉素因子1、1′、2、3、4、5、5′和6（factor 1、factor 1′、factor 2、factor 3、factor 4、factor 5、factor 5′、factor 6），主要组份为暗霉素因子2、4、和5′[22]。 1.2.2.1 安普霉素

暗霉素因子2为安普霉素（Apramycin），亦称阿伯拉霉素（图1-3）。安普霉素的化学结构独特，含有一个β型吡喃糖苷八碳双环构型的辛二糖环结构，明显不同于其他氨糖类抗生素。迄今为止，已报道的具有辛二糖环结构的氨糖类抗生素只有3 种：安普霉素、氧化安普霉素和糖霉素（4′′-去氨-4′′-羟基安普霉素，KA-686）[23]。该抗生素主要通过干扰原核生物蛋白质的合成达到抑制细菌的繁殖，是一种对猪痢疾以及沙门氏菌病有效的畜用氨基糖苷类抗生素，其氨基糖环上不同位置修饰后所得的衍生物，可增加母体的抗菌活性，该组分既具有治疗作用，又可促进家畜生长，是一种很好的兽药[24]。 1.2.2.2 妥布霉素

暗霉素因子5′为6′′-O-氨甲酰妥布霉素，经酸或碱加热水解失去1分子CO2和1分子H2O，变成暗霉素因子6，即妥布霉素（Tobramycin，图1-5）。妥布霉素是一个良好的广谱抗生素，在临床上使用广泛，其抗菌谱和药理与庆大霉素相似，主要用于治疗革兰阴性菌引起的感染，对铜绿假单胞菌的活性特强，是庆大霉素的2～4倍，对产生3′-磷酸转移酶的耐药菌和许多耐庆大霉素的铜绿假单胞菌特别有效[25]。最新研究还发现，妥布霉素具有抑制基因表达过程中mRNA翻译过早终止的作用，而翻译过早终止是导致囊肿性纤维化等基因遗传疾病的根本原因[26]。 1.2.2.3 卡那霉素B

暗霉素因子4为6′′-O-氨甲酰卡那霉素B，经酸或碱加热水解失去1分子CO2和1分子H2O，变成暗霉素因子5，即卡那霉素B（Kanamycin B，图1-5）。卡那霉素B的杀菌能

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力比卡那霉素A强2～4倍，但毒性也大1～1.5倍。

1971年，Umezawa等[27, 28]首次以卡那霉素B为前体，成功合成出了3′, 4′-双脱氧卡那霉素B（地贝卡星，Dibekacin），地贝卡星对耐药性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及产生3′-磷酸转移酶的致病菌都高度有效，而毒副作用却比庆大霉素和卡那霉素小，因此一直倍受青睐。目前，生产上主要是从卡那霉素的废液中分离卡那霉素B，严重制约了地贝卡星的开发利用[22]。因此，利用黑暗链霉菌直接发酵合成卡那霉素B，为开发地贝卡星提供了一条新途径，具有重大意义。

2004年，Jie等[29]对卡那霉素衍生物进行深入研究，通过分析多个位点不同基团修饰后抑菌活力的变化，来阐述卡那霉素衍生物的构效关系（Structure activity relationship，SAR）。同时，他们还提出了一个简便的药物建库方法，极大地丰富了卡那霉素衍生物的种类。氨基糖苷类抗生素的抗菌机制，主要是作用在原核生物30S核糖体亚基16S rRNA解码区的A位点，最终抑制其蛋白质的合成。而耳毒性机制则是因为，氨基糖苷类抗生素非选择性作用于真核生物线粒体核糖体。2014年，Deborah等以药物与靶标之间的相互作用为切入点，化学合成并筛选得到多种2-脱氧链霉胺衍生物，这些药物既增强了抗菌活性，又表现出对真核生物核糖体较弱的结合能力[8]。

1.3 暗霉素生物合成基因研究进展

1.3.1 安普霉素生物合成基因研究进展

2002年，李相丰等[30]通过微生物转化实验和阻断变株共合成研究，结合国内外研究成果，提出了安普霉素生物合成途径，但仍未指出相应的功能基因。直到2005年，Aboshanab[7]对大量氨基糖苷类抗生素的生物合成进行分析和总结，才提出较为详细的安普霉素生物合成途径，及其每一步骤可能对应的功能基因（图1-9）。随后，许铭翾[31]等利用同位素示踪实验，证实在安普霉素的生物合成中，辛二糖C7′-N位的甲基是由甘氨酸提供，并认为这一过程很可能是通过甲硫氨酸循环完成的，而丝氨酸则是C2′位氨基的主要供体。这些研究成果，都为后来详细研究安普霉素生物合成途径奠定了坚实基础。

2006年，Piepersberg等[32]公布了一套较为完整的安普霉素生物合成基因簇（GeneBank：AJ629123 ，图1-10）。该基因簇的公布，进一步促进安普霉素生物合成基因的研究。此后，研究人员通过基因阻断与表型分析，陆续阐明了安普霉素生物合成过程中部分关键基因的功能。李天伯等[33]通过Southern杂交获得S. tenebrarius H6中完整的dTDP-葡萄糖-4, 6-脱水酶基因，命名为aprE（GeneBank：AF306787），而Du Yu等[34]通过阻断互补实验表明aprE不参与安普霉素的生物合成。程杉等[35]克隆安普霉素抗性基因下游4.8 kb片段，经分析表明该片段含有三个基因，分别命名为aprC、aprD和aprF，认为aprC编码水解酶或磷酸化酶，aprD编码与UDP-葡萄糖-4-异构酶（UDP-glucose-4-epirnerase）同源的蛋白。王

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暗霉素定向生物合成研究

新路等[36]关于aprG基因阻断的研究表明，aprG与安普霉素合成直接相关。朱碧银等[37]则通过敲除aprF-G基因，发现aprF-G不仅与暗霉素合成密切相关，而且与黑暗链霉菌的生长发育有关。倪现朴等[38]通过阻断aprD3和aprD4基因实验，证明了aprD3编码催化安普霉素生物合成过程中3′-脱氧反应的酶，aprD4同时参与氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中脱氧过程。严绍德等[39]通过敲除aprH-M基因，获得一株不再合成安普霉素的突变株，黑暗链霉菌T106（△aprH-M），但由于其一次性破坏多个基因，各基因的功能未能得到阐明。

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CH2O-POOH2-deoxy-scyllo-inosose synthase (AprC)OHOHOOHOH2-deoxy-scyllo-inosose Aminotransferase (AprS)HOHONH2OHOHHOHOOHGlucse-6-phosphatePentose phosphate pathway IntermediateHOHOD-octosamine-1-P + NTP52-Deoxy-scyllo-inosose2-Desoxy-scyllo-3-inosamineAminocyclitol1-dehydrogenase (AprE)4NH236211-keto-2,3-deoxy-3-amino-NH2scyllo-inositol Aminotransferase (AprS)HOHONH2OOH2-Desoxystreptamine1. phosphosugar mutase (AprJ)2. N-octosamine synthase (AprK)3. NDP-sugar epimerase (AprD1)4. NDP-octosaminyltransferase (AprH)OH1-keto-2,3-deoxy-3-amino-scyllo-inositolHOOHOH8＇7＇6＇4＇5＇OO2＇NH2HO1＇4NH2233＇NH62O1HO5OHHOPseudodisaccharidic intermediate ?HOCH2OHOOHOHOOHOOHO1. NDP-D-glucosyltransferase (AprM)2. NDP-D-glucose synthase (AprN)D-glucose -1-P + NTPCH2OHOOHNHCH3OHOOHOONH2NH2ONH2OHNH2HOPseudodisaccharidic intermediate IIHOHO1. 7′-dehydrogenase (AprQ)2. 7′-aminotransferase (AprL)3. 7′-N-methyltransferase(AprI)NH2ONH2OH＇6＇CH2OH4＇＇＇O5＇＇2＇3＇＇OHHOSaccharocin (KA-5685)1. 4\-dehydrogenase (AprD2)2. 4\-aminotransferase (AprL)CH2OHH2NHOONHCH3OHOOHOOHH2NHO1＇＇O1. 3′-dehydratase (AprD3)2. 3′-oxidoreductase (AprD4)ONH2NH2OOHNHCH38＇7＇6＇4＇5＇OO2＇3＇NH21＇O4NH23526OH1NH2HOApramycinNH2OHOxyapramycinHO

图1-9 推测的安普霉素生物合成途径

Fig. 1-9 Proposed biosynthetic pathway of apramycin

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暗霉素定向生物合成研究

图1-10 安普霉素生物合成基因簇

Fig. 1-10 The biosynthetic gene cluster of apramycin

1.3.2 妥布霉素生物合成基因研究进展

2004年，Kharel等[40]公布妥布霉素生物合成基因簇（GeneBank：AJ810851），并通过基因异源表达，体外实验证明了tbmA基因和tbmB基因所编码的酶，分别是2-DOS生物合成的第一步关键酶与第二步关键酶，其中TbmA催化6-磷酸葡萄糖合成2-DOI，TbmB为2-脱氧青蟹肌醇单酮转胺酶。杨钧等[41]在李天伯的研究基础上发现新的基因tobH，并通过对该基因的阻断，结果不再合成妥布霉素，证明了tobH是妥布霉素生物合成途径中的关键基因。余永红等[42]对妥布霉素生物合成基因簇中tacB基因进行敲除，结果发现阻断突变株合成了一种新组分，该组分经MS、NMR分析确定为3′-脱氧氨甲酰卡那霉素C，证明了tacB编码6′-脱氢酶。夏焕章等[43]采用框架内删除失活的方法对黑暗链霉菌H6中tacA基因进行阻断，发现阻断突变株不再产生氨甲酰妥布霉素，直接产生妥布霉素，证明了tacA编码氨甲酰转移酶。Aboshanab[7]通过比较分析，推测出4, 6-双取代2-DOS氨基糖苷类抗生素的一般生物合成途径，包括妥布霉素生物合成途径（图1-11）。

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CH2OHONH2NH235NH2OHO4HOHO5NH2362NH21HOHO6＇CH2OH4＇5＇O2＇3＇HOHONH2OCH2OHOHOH1＇4NH2OHO26OH1NH2HOO2-DesoxystreptamineOHParomamine(323.347 )6-O-Glc-Paromamine(323.347 )1. 3\-Dehydrogenase (TobD2)2. 3\-Aminotransferase (TobS2)UDP-D-glucosamine Transferase (TobM1)CH2OHONH2HOHOUDPHOHOUDP-D-glucosyltransferase CH2OH(TobM2)OHOHOCH2OHNH2OOHOUDPOHNH2NH2OHOONH2CH2OHOHUDP-D-glucosamineUDP-D-glucoseKanamycin C (484.504 )1. 6′-Dehydrogenase (TobQ)2. 6′-Aminotransferase (TobB) HOCH2NH2ONH2NH2OHONH2OHOONH2HOHO1. 3′- Dehydratase (AprD3)2. 3′- Oxidoreductase (AprD4) CH2NH2ONH2NH2OHONH2OCH2OHOHNH2CH2OHOHHOOTobramycin (467.52)1. 6′′-Carbamoyl-phosphate synthase (TobL)2. 6′′-Carbamoyltransferase (TobZ) Kanamycin B (483.519)1. (TobL)2. (TobZ) 6＇CH2NH24＇5＇O2＇HO3＇1＇4NH2OHONH23526O11＇＇NH26＇CH2NH24＇5＇O2＇HO1＇HO3＇4NH2OHONH23526O11＇＇NH25＇＇6＇＇CH2CONH2O3＇＇HOOH4＇＇2＇＇NH25＇＇6＇＇CH2CONH2O3＇＇HOOH4＇＇2＇＇NH26′′-O-Carbamoyltobramycin (510.545)6′′-O-Carbamoylkanamycin B (526.545 )

图1-11 推测的妥布霉素生物合成途径

Fig. 1-11 Proposed biosynthetic pathway of tobramycin

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pH 7.0，115℃灭菌30 min 3) MS固体培养基（%）：接合转移

黄豆饼粉2.0，甘露醇2.0，琼脂2.0 pH 7.0，121℃灭菌30 min[57]

4) 营养琼脂培养基（%）：枯草芽孢杆菌培养

蛋白胨1.0，氯化钠0.5，牛肉浸出粉0.3，琼脂1.5～2.0 pH 7.0～7.2，115℃灭菌30 min

5) 抗生素微生物检定培养基Ⅰ（%）：效价检测

蛋白胨0.5，牛肉浸出粉0.3，磷酸氢二钾0.3，琼脂1.5～2.0 pH 7.8～8.0，115℃灭菌30 min[58] 6) 黑暗链霉菌斜面培养基（HSB，%）

蔗糖3.0，蛋白胨0.5，硫酸亚铁0.001，氯化钾0.05，硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.1，琼脂2.0

pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min 7) 黑暗链霉菌种子培养基（%）

葡萄糖0.5，玉米淀粉1.0，黄豆饼粉1.5，氯化钙0.025，磷酸二氢钾0.05，氯化钾0.1，硫酸镁0.5

pH 7.2～7.4，121℃灭菌30 min 8) 黑暗链霉菌发酵培养基（%）

葡萄糖1.5，玉米淀粉2.0，淀粉酶0.05，鱼粉0.6，蚕蛹粉0.7，玉米粉2.0，黄豆饼粉3.5，硫酸锌0.01，硫酸铵0.7，硫酸镁1.1，碳酸钙0.7，豆油1.0 pH 7.0～7.2，121℃灭菌30 min[54]

2.1.3 试剂

2.1.3.1 试剂与工具酶 1) 化学试剂

十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、Tris-HCl、氢氧化钠、冰醋酸、饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、异戊醇、醋酸钾、碳酸钙、氯化钙、氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和溴化乙锭等均为国产或进口分析纯。 2) 生物试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉浸出粉、麦芽抽提物和酪氨酸等购自生工生物工程（上海）有限公司，蔗糖、玉米淀粉、鱼粉、蚕蛹粉、玉米粉、黄豆饼粉和琼脂等购自福州永辉超市，溴酚蓝、DNA-Maker和DNA凝胶回收试剂盒等购自宝生物工程（大连）

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暗霉素定向生物合成研究

有限公司。 3) 工具酶

常用限制性内切酶、RNase A 酶、T4 DNA连接酶、rTaq聚合酶、ExTaq聚合酶、Proteinase K和小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）等购自宝生物工程（大连）有限公司。 2.1.3.2 溶液与缓冲液

1) 链霉菌基因组DNA提取缓冲液（SET）

Tris-HCl 20 mmol/L，EDTA 25 mmol/L，氯化钠75 mmol/L pH 7.5，121℃灭菌30 min[57] 2) 碱变性法质粒抽提溶液

Solution I：葡萄糖 50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH 8.0 Solution II：氢氧化钠0.2 mol/L，SDS 1%，现配现用

Solution III：醋酸钾（5 mol/L）60%，冰乙酸 11.5%，双蒸水28.5% 3) TE缓冲液

Tris-HCl 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L pH8.0，121℃灭菌30 min 4) 核酸电泳缓冲液50×TAE

Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，EDTA（0.5 mol/L, pH 8.0）100 mL，加双蒸水定容至1 L[56] 5) 磷酸盐缓冲液

磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加双蒸水定容至1 L pH7.8，115℃灭菌30 min[58] 2.1.3.3 抗生素

本研究所使用的抗生素及其作用浓度见表2-3。

表2-3常用抗生素及其作用浓度

Tab. 2-3 Antibioties and their working concentrations

抗生素 氨苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 安普霉素 红霉素 萘啶酮酸

英文名称及缩写 Ampicilin, AMP Chloramphenicol, CHL Kanamycin, KAN Apramycin, APR Erythromycin, ERY Nalidixic acid, NA

抗性基因 bla cat neo aac(3)IV ermE —

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母液浓度（mg/mL）

100 25（乙醇配制）

25 50 50（乙醇配制）

25

作用终浓度（μg/mL） 大肠杆菌（LB） 链霉菌（MS）

100 25 25 50 — —

— — — — 50 25

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2.1.4 仪器与设备

本研究所使用的仪器与设备见表2-4。

表2-4仪器与设备

Tab. 2-4 Instruments and equipments

仪器设备型号

安捷伦6520四极杆-飞行时间质谱仪 冰箱BCD-216SDX

超低温冷冻储存箱DW-HW138 超声波清洗机KQ3200E 电子天平FA1004N 电泳仪DYY-8C 电泳槽DYCZ-24DN 电热恒温水槽DK-8D 多功能摇床HYG-C 高速冷冻离心机Z326 隔水式恒温培养箱GNP-9080 立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50SI 迷你型旋涡振荡器 生物显微镜B203

全自动凝胶成像分析仪JS-680B SHB-IIIA-循环水式真空泵 双人单面洁净工作台SW-CJ-2FD Thermal Cycler S1000 台式恒温振荡器THZ－D

厂商

安捷伦科技有限公司 青岛海尔股份有限公司 中科美菱低温科技有限责任公司 昆山市超声仪器有限公司 上海精密科学仪器厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂

上海精密实验设备有限公司 苏州培英实验设备有限公司 德国哈默公司

上海精宏实验设备有限公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 广州仪科实验室技术有限公司 重庆奥特光学仪器厂 上海培清科技有限公司 郑州长城科工贸有限公司 苏州苏洁净化设备有限公司 美国Bio-Rad公司 太仓市实验设备厂

2.1.5 其他

本研究所使用的GF254硅胶薄层板（高效板）购自青岛市基亿达硅胶试剂厂。

2.2 实验方法

2.2.1 菌种培养与保藏

1) 黑暗链霉菌

20

暗霉素定向生物合成研究

孢子培养使用斜面培养基，将孢子转接斜面，37℃恒温培养3～4 d即可；

种子培养使用种子培养基，将孢子转接种子培养基，280 rpm，37℃振荡培养16～18 h； 菌丝体培养使用YEME培养基，按10%的接种量（v/v）将生长良好的种子液转接YEME培养基，280 rpm，37℃振荡培养12～14 h；

摇瓶发酵培养使用发酵培养基，以10%的接种量（v/v）将生长良好的种子液转接发酵培养基，280 rpm，37℃振荡培养96～120 h；

短期保藏可置于4℃，长期保藏采用砂土管保藏法，可保藏10年左右[57]。 2) 大肠杆菌

液体培养使用LB液体培养基，带质粒的加入相应抗生素，220 rpm，37℃振荡培养12 h；

固体培养使用LB固体培养基，带质粒的加入相应抗生素，37℃恒温培养12 h； 采用低温甘油保藏法进行保藏[56]。 3) 枯草芽孢杆菌

使用营养琼脂培养基，35～37℃培养7 d，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上

[58]

。

2.2.2 引物设计

以GenBank公布的安普霉素生物合成基因簇（登记号：AJ629123）或妥布霉素生物合成基因簇（登记号：AJ810851）为模板，利用Vector NTI软件进行引物设计，所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，见表2-5。

表2-5 本研究所使用的引物 Tab. 2-5 Primes used in this study

Primers PE1 PE2 PE3 PE4 PH1 PH2 PH3 PH4 PH5 PH6 PJ1 Sequences

5′-GAATTC CCTAGGCCTATTAATATTCC-3′ 5′-GAATTC ATAGTTCTAGAGGTACCAGC-3′ 5′-TTGCAGGTCCAGGAAGGGGA-3′ 5′-GTTCGTCCGTCGTCGCGATT-3′ 5′-GAATTC AGGACCAGCCCGTCGATC-3′ 5′-TCTAGA AGGAGGGATGGGTGCCGT-3′ 5′-TCTAGA AGATCTGCTGCGTCGGCG-3′ 5′-AAGCTT CGGGGAGGTAACGGGTGA-3′ 5′-CTCAACGCCAGTCTCCTTCG-3′ 5′-ACGTAGTCGGTCAGCATCGC-3′ 5′-AAGCTT GTGTTCGTCGCCGACCTC-3′ 21

Role

Sense primer of ermE Antisense primer of ermE Detection of ermE Detection of ermE Sense primer of H1 Antisense primer of H1 Sense primer of H2 Antisense primer of H2 Screening △aprH mutant strain Screening △aprH mutant strain Sense primer of J1 福州大学硕士学位论文

Primers PJ2 PJ3 PJ4 PJ5 PJ6 PZ1 PZ2 PD1 PD2 PD3 PD4 PD5 PD6

Sequences

5′-TCTAGA TGTTCTCGCCGGGCAGGA-3′ 5′-TCTAGA ACGTGGCGGTGGTACTGCTC-3′ 5′-GAATTC GGAGGTGTTCACGGTCGG-3′ 5′-AGATCTGCTGCGTCGGCG-3′ 5′-CGGGGAGGTAACGGGTGA-3′ 5′-TTGTAGGCGGCGAAGTCCCT-3′ 5′-TGCCTTGGTGAGGATGTCGG-3′ 5′-TCTAGA CCCTACGACGCGACGAAC-3′ 5′-GATATC CGGTTCCCCTCTGACCCTC-3′ 5′-TCTAGA GAGCTCTCCGGAGGTCGCA-3′ 5′-GATATC TACCAGCCCGACCCGAGCA-3′ 5′-AGTACGTGGTGCGAGGACAAGT-3′ 5′-CGATCAGGAACAGGAAGACCAG-3′

Role

Antisense primer of J1 Sense primer of J2 Antisense primer of J2 Screening △aprJ mutant strain Screening △aprJ mutant strain Screening △tobZ mutant strain Screening △tobZ mutant strain Sense primer of genB3-P-B4 Antisense primer of genB3-P-B4 Sense primer of ermE* Antisense primer of ermE*

Screening strain with genB3-P-B4 insertion Screening strain with genB3-P-B4 insertion

2.2.3 黑暗链霉菌基因组DNA的提取

1) 将黑暗链霉菌新鲜孢子接种至装有50 mL黑暗链霉菌种子培养基的250 mL锥形瓶中，

280 rpm，37℃振荡培养16～18 h；

2) 按10%的接种量（v/v）将生长良好的种子液转接至装有30 mL YEME液体培养基的

250 mL锥形瓶中，280 rpm，37℃振荡培养12～14 h；

3) 将菌丝体培养液转移至50 mL的离心管，4000 rpm离心15 min收集菌丝体，用30 mL

无菌水洗涤离心两次；

4) 弃上清，加入5 mL SET缓冲液，振荡分散菌丝体，使其充分悬浮，加入溶菌酶（终浓

度5 mg/mL），37℃恒温水浴1 h；

5) 加入1 mL SDS（10%）和150 μL Proteinase K，55℃恒温水浴2 h，期间不断振荡； 6) 室温下冷却，加入5 mL氯化钠（5mol/L）和8 mL氯仿，室温放置30 min，期间不断

振荡，12000 rpm离心15 min；

7) 用粗头移液管将上清液转移至另一干净离心管中，缓慢加入等体积异丙醇，用头部封

口且弯曲的毛细管在分层处缓慢搅动，使DNA充分缠绕到毛细管上；

8) 用70%的冰乙醇溶液洗涤DNA后放置室温干燥，加入1 mL TE缓冲液溶解，-20℃保

存备用[57]。

2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）

1) PCR扩增体系

22

暗霉素定向生物合成研究

本研究所使用的PCR扩增体系见表2-6，DNA模板为相应的基因组DNA、质粒DNA或黑暗链霉菌孢子，DMSO用于提高特异性。

表2-6 PCR扩增体系

Tab. 2-6 Components in PCR amplification

Components 10×PCR buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (2.5 mM, each)

DMSO (99%) Sense primer (2 μM) Antisense primer (2 μM) Template DNA (100 μg/mL) Taq DNA polymerase (5 U/μL)

ddH2O

Final concentration

1× 0.25 mM 7.5% 0.2 μM 0.2 μM 100 ng 2.5 U —

Volume（μL）

2.0 2.0 1.5 1.0 1.0 1.0 0.5 Up to 20

2) PCR扩增程序

本研究所使用的PCR扩增程序见表2-7。

表2-7 PCR扩增程序

Tab. 2-7 Program of PCR amplification

步骤 1 2 3 4 5

说明 预变性 变性 退火 延伸 最后延伸

1 30 循环数 1

温度（℃）

95 95 m 72 72

时间（min）

5 1 1 n 10

说明：根据引物的Tm值确定最适退火温度m，黑暗链霉菌一般在50～65℃之间。根据扩增片段的长度确定延伸时间n，一般以1000 bp/min计算。可先设不同的退火温度和模板浓度梯度进行预实验，确定最适扩增条件后再进行大量扩增[56]。

2.2.5 DNA片段回收

本研究使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA片段的回收，具体操作过程如下：

23

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1) 准备工作：

检查Washing Solution中是否已经加入乙醇； 检查Buffer B2是否出现沉淀； 将水浴锅调至55℃；

2) 利用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA分开，在紫外光下用干净的手术刀

割下含目的DNA的胶块，装入预先称重的离心管中，称量胶块净重（若胶块不足100 mg用双蒸水补足至100 mg）；

3) 加入3倍胶块重量的Buffer B2，55℃水浴5 min，使胶块彻底溶化，期间每隔摇匀一

次；

4) 将溶胶液转移至吸附柱中，室温静置2 min，8000 rpm离心1min； 5) 重复步骤4两次，倒掉收集管中的废液；

6) 向吸附柱的膜中央加入500 μL Washing Solution，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中

的废液，重复操作1次；

7) 将吸附柱放入同一个收集管中，12000 rpm空柱离心2 min，；

8) 将空吸附柱放入一根新的离心管中， 50℃恒温干燥5mim，使酒精充分挥发，以提高

DNA的洗脱效率；

9) 在吸附柱的膜中央加入20～40 μL事先55℃预热的Elution Buffer，室温静置2 min，

12000 rpm离心1 min，管中液体为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

2.2.6 DNA酶切反应

确定样品的浓度，并选择合适的限制性内切酶及其最适缓冲液，设计合适的酶切方案。单酶切反应体系见表2-8，双酶切可选择通用缓冲液进行同时酶切，一般使用10 μL或20 μL体系，37℃恒温水浴0.5～1 h，酶切结束后加入1/10体积的loading buffer终止反应，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

表2-8 DNA酶切反应体系

Tab. 2-8 Components in DNA digestion reaction system

Components 10× buffer DNA Restriction enzyme

ddH2O

Volume（μL）

1.0 2.0 0.5 Up to 10

2.2.7 DNA酶连反应

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暗霉素定向生物合成研究

本研究使用的酶连反应体系见表2-9。为提高连接效率，应控制载体和外源片段的摩尔比在1:3～1:10，酶连前先确定样品的浓度，再设计合适的方案。一般使用10 μL体系，16℃过夜。

表2-9 DNA酶连反应体系

Tab. 2-9 Components in DNA ligation reaction system

Components 10×T4 buffer Vector DNA

T4 DNA ligase enzyme

ddH2O

Volume（μL）

1.0 0.5 2.0 0.5 Up to 10

2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

1) 从新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保藏菌液接种至3 mL LB液体培养基中，220

rpm，37℃振荡培养12 h；

2) 以1%的接种量将菌液转接至装有30 mL LB液体培养基的锥形瓶中，220 rpm，37℃振

荡培养1.5～2 h（控制OD600在0.3～0.5之间）；

3) 将菌液倒入50 mL离心管，冰浴10 min，4℃，8000 rpm离心5 min，弃上清； 4) 加入10 mL 4℃预冷的氯化钙溶液（0.1 mol/L）悬浮菌体，冰浴30 min；

5) 4℃，8000 rpm离心5 min，弃上清，将菌体重新悬浮于1 mL预冷的氯化钙溶液（0.1

mol/L）；

6) 制备好的感受态细胞分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，每管100 μL，4℃冰箱冷藏

或者低温甘油保藏备用[56]。

2.2.9 质粒转化

1) 取方法2.2.8制备大肠杆菌感受态细胞一管，加入适量质粒DNA（约1 μL）或方法2.2.7

的酶连产物（约5 μL），用手指轻叩离心管底部，小心混匀后，冰浴30 min； 2) 将离心管置于42℃恒温水浴槽中，热激90 s（期间不要摇动离心管）后快速冰浴，静

置2 min；

3) 加入800 μL LB液体培养基混匀，220 rpm，37℃振荡培养1 h进行复苏；

4) 取适量复苏后的菌液，均匀涂布在含相应抗生素的LB平板上，质粒转化只需50 μL

即可，酶连产物转化可全部涂布； 5) 将平板倒置，37℃恒温过夜培养[56]。

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2.2.10 SDS碱裂解法制备质粒DNA（小量制备）

1) 挑取方法2.2.9中过夜生长的单菌落或吸取其他含目标质粒的大肠杆菌菌液，转接至含

相应抗生素的3 mL LB液体培养基中，220 rpm，37℃振荡培养12 h；

2) 吸取1.5 mL菌液于离心管中，10000 rpm离心1 min，弃上清，将菌体尽可能打散； 3) 加入100 μL预冷的Solution I，置于旋涡振荡器上剧烈振荡，使菌体充分悬浮； 4) 加入200 μL新鲜配制的Solution II，快速温和颠倒离心管数次（不要振荡），使Solution

II与菌体充分接触，细胞裂解至透明粘稠状，4℃静置5 min；

5) 加入200 μL预冷的Solution III，轻轻旋转离心管，使白色絮状物卷成一团，冰浴5 min

后，12000 rpm离心5 min，小心将上清液转移至新的离心管中；

6) 加入等体积的苯酚/氯仿（1:1），充分混匀，12000 rpm离心5 min，小心将上清液转移

至新的离心管中；

7) 加入等体积氯仿，上下振荡混匀，12000 rpm离心5 min以去除残留的痕量酚，小心将

上清液转移至新的离心管中；

8) 加入0.6倍体积的预冷异丙醇，上下振荡混匀，室温静置10 min，沉淀质粒DNA，12000

rpm离心5 min，弃上清；

9) 加入1 mL 70%冰乙醇洗涤沉淀，15000 rpm离心5 min，弃上清，并吸干残余液体，使

沉淀自然干燥；

10) 用20～50 μL含RNase（50 μg/mL）的TE缓冲液溶解沉淀，65℃静置15 min去除RNA，

电泳检测后-20℃保存备用[56]。

2.2.11 大肠杆菌-链霉菌接合转移

1) 根据方法2.2.9，将构建好的重组质粒转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），获得大肠杆

菌-链霉菌接合转移供体菌ET12567（pUZ8002/重组质粒）；

2) 挑取供体菌的单菌落，转接至3 mL LB液体培养基中，加入相应的抗生素（CHL和

KNA作用终浓度为25 μg/mL，APR为50 μg/mL，下同），220 rpm，37℃振荡培养12 h； 3) 以1%的接种量将培养好的供体菌转接到30 mL LB液体培养基中，加入相应的抗生素

（CHL、KNA和APR），220 rpm，37℃振荡培养2～3 h（控制OD600在0.4～0.6之间）； 4) 将菌液倒入50 mL无菌离心管中，8000 rpm离心5 min，收集菌体，用30 mL LB液体

培养基洗涤离心两次，以去除残留的抗生素，最后用500 μL LB液体培养基悬浮菌体备用；

5) 挑选黑暗链霉菌产孢丰富的优质新鲜斜面1支，用接种针将孢子刮至1 mL无菌水中，

在涡旋振荡器上充分振荡分散，8000 rpm离心5 min，收集孢子，再次用1 mL无菌水洗涤离心，最后用500 μL无菌水制成单孢子悬液；

6) 将孢子悬液50℃热激10 min后，冰浴10 min，然后室温放置备用；

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暗霉素定向生物合成研究

7) 将步骤4处理好的供体菌悬液和步骤6处理好的受体菌孢子悬液各500 μL进行混合，

8000 rpm离心5 min后，弃去大部分上清液，使菌体重新悬浮在残留的上清液中； 8) 步骤7的混合菌液进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3和10-4），各梯度分别涂布在MS平

板上，37℃恒温培养18～24 h；

9) 用500 μL含红霉素和萘啶酮酸（作用终浓度均为50 μg/mL）的水溶液覆盖步骤8的

MS平板表面，在超净台静置至表面水分不再流动； 10) 37℃继续培养3～4 d后即可观察到接合子[57]。

2.2.12 黑暗链霉菌的摇瓶发酵

1) 发酵前分离出产孢丰富的黑暗链霉菌单菌落，转接至斜面培养基上，37℃培养3～4 d； 2) 挑选黑暗链霉菌产孢丰富的优质新鲜斜面，刮取约1 cm3孢子，接种至装有50 mL种

子培养基的锥形瓶中，280 rpm，37℃振荡培养16～18 h（控制菌体处于对数生长期）； 3) 以10%的接种量（v/v）将生长良好的种子液转接至装有50 mL发酵培养基的锥形瓶中，

280 rpm，37℃振荡培养4～5 d，放瓶测定发酵液效价与组分[54]。

2.2.13 黑暗链霉菌次级代谢产物的处理

2.2.13.1 732阳离子交换树脂的预处理

732新树脂制造过程中常有杂物残留，会影响交换效果和产品质量，因此必须进行预处理才能使用，操作步骤见图2-1。

新树脂80%乙醇蒸馏水1 mol/L 氢氧化钠蒸馏水2 mol/L 盐酸蒸馏水1 mol/L 氢氧化钠清洗清洗清洗浸泡4 h浸泡4 h浸泡4 h浸泡4 h蒸馏水5%氨水清洗浸泡过夜蒸馏水清洗至pH 7.0～7.2732-NH4+阳离子交换树脂蒸馏水2 mol/L 盐酸清洗浸泡4 h

图2-1 732-NH4+阳离子交换树脂的预处理

Fig. 2-1 Pretreatment of 732-NH4+ cation exchange resin

2.2.13.2 暗霉素的提取

1) 将黑暗链霉菌发酵液用浓硫酸调节至pH 1.5～2.0，静置30 min，然后用1 mol/L NaOH

调节发酵液至pH 6.0～6.5；

2) 将发酵液于12000 rpm离心15 min，取1 mL上清液供效价测定，其余上清液按以下步

骤处理；

3) 往上清液投入适量预处理的732-NH4+树脂（按50000 μg/mL计算），室温振荡8 h后，

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收集饱和树脂装柱，并用蒸馏水漂洗干净；

4) 用0.1%氨水对饱和树脂进行洗涤，直到流出液pH 8.0为止，改用5%的氨水进行洗脱，

氨水用量为饱和树脂体积的8～10倍，洗脱速度控制在1 mL/min，收集暗霉素洗脱液； 5) 利用旋转蒸发仪对洗脱液进行浓缩除氨，浓缩液用稀硫酸调节至pH 6.0；

6) 浓缩液与无水乙醇按比例混合结晶，最后用适量蒸馏水溶解供TCL分析或MS检测。

2.2.14 效价测定（二剂量法）

1) 双碟的制备

取直径90 mm，高16 mm的平底双碟，倾入20 mL加热融化的培养基Ⅰ，凝固后作为底层。另取适量培养基Ⅰ加热融化，冷至60℃，加入适量的枯草芽孢杆菌悬液（高浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22 mm）摇匀，在每一双碟中分别加入5mL，凝固后作为菌层。在已凝固的平板中等距离放置4个牛津杯（内径6.0 mm±0.1 mm，高10.0 mm±0.1 mm，外径7.8 mm±0.1mm），用陶瓦盖覆盖备用。 2) 效价测定

在双碟对角的2个牛津杯中，分别滴装等体积高（H）、低（L）浓度的标准品溶液（S），其余2个牛津杯中分别滴装相应的高（H）、低（L）浓度供试品溶液（U），高、低浓度的剂距为2∶1。37℃恒温培养14～16 h，测量各个抑菌圈直径，参照公式2-1进行效价计算（供试品效价=θ×估计效价）[58]。

θ：供试品与标准品的效价比； SH：标准品的高剂量所致抑菌圈直径； SL：标准品的低剂量所致抑菌圈直径； UH：供试品的高剂量所致抑菌圈直径； UL：供试品的低剂量所致抑菌圈直径；

I：高低浓度剂量之比的对数，当比为2∶1时，I＝0.301。

公式（2-1）

2.2.15 暗霉素的检测

2.2.15.1 薄层色谱法（TLC）

1) 点样：用微量注射器分别吸取1 μL标准品、工程菌提取液和出发菌提取液，在距GF254

硅胶薄层板底边1.0 cm处点样；

2) 展开：配置展开剂（正丙醇：甲醇：25%浓氨=2：2.5：2.3）[59]，取适量加入层析缸中，

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暗霉素定向生物合成研究

将点样后的薄层板放入缸中，浸入展开剂的深度以距薄层板底边0.5 cm为宜，待展开剂前沿距薄层板顶边1.0 cm时取出薄层板；

3) 显色：薄层板吹干或烘干后，放入碘熏器内进行碘熏显影。 2.2.15.2 质谱法（MS）

使用仪器为安捷伦6520四极杆-飞行时间质谱仪，数据分析软件为Agilent Masshunter (B.04.00)。

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第三章 aprH基因缺失突变株的构建

黑暗链霉菌Tt-49主产安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素等，其罐上发酵水平可达5865 μ/mL，是产业化生产菌[54]。然而，由于黑暗链霉菌Tt-49发酵产生的暗霉素结构相近、理化性质相似，导致发酵过程调控困难，代谢产物提取工艺复杂。

为了简化生产工艺，提高妥布霉素生产水平，研究人员倾注了大量心血，对黑暗链霉菌及其生产工艺进行了长期研究：育种方面，主要采用物理方法诱变、化学试剂诱变以及敏感菌株筛选等传统技术，进行主产氨甲酰妥布霉素菌株的选育[54, 60-63]；发酵方面，主要以优化工艺为主，最大限度地合成氨甲酰妥布霉素[54, 64-67]；提取精制方面，采取层析法，先去除氨甲酰妥布霉素以外的组分，然后水解去除氨甲酰基，最后得到妥布霉素[68, 69]。因此，生产工艺复杂，提取工艺繁琐，污染严重，成本高以及质量不稳定，是长期困扰企业生产技术升级换代的拦路虎。

近年来，随着安普霉素和妥布霉素生物合成基因簇的相继公布，以及有关基因功能的理论预测，研究人员开始尝试利用基因工程技术定向改造黑暗链霉菌。2012年，严绍德等

[39]

以Tt-49为出发菌株，敲除aprH-M基因，阻断了安普霉素的合成，获得只产氨甲酰妥

布霉素的工程菌HM106。然而，由于其未明确安普霉素生物合成的关键基因，一次性破坏多个基因，代谢产物总效价大幅度降低，仅为出发菌株的40%左右。因此，探索安普霉素生物合成的关键基因，构建高产氨甲酰妥布霉素工程菌，具有重要意义。

经生物信息学分析，安普霉素生物合成基因簇上的aprH基因，可能编码糖基转移酶，负责2-脱氧链霉胺与辛二糖的结合。为此，本章拟采用基因工程技术敲除aprH基因，探究aprH基因缺失后对暗霉素生物合成的影响，以期阐明aprH基因在安普霉素生物合成途径中的地位。

3.1 重组质粒pTH407的构建

锁定aprH基因上下游序列，设计敲除aprH基因部分DNA序列方案（图3-1）。选择穿梭质粒pKC1139作为基本载体，红霉素抗性基因ermE为筛选标记，构建重组质粒pTH407，具体流程如图3-2所示。

H1(2056bp)aprFaprG765bpaprHH2(1931bp)aprIaprJaprK

图3-1 aprH的敲除方案

Fig. 3-1 Gene deletion scheme of aprH

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暗霉素定向生物合成研究

EcoRⅠH12068 bpXbaⅠXbaⅠH21943 bpHind ⅢLacZCloning SiteAmprTA-clonepMD19-T2694 bpTA-cloneAmprEcoRⅠXbaⅠXbaⅠoriXbaⅠHind ⅢEcoRⅠlacZoriTAmprXbaⅠHind ⅢpTH1014760 bporiH1pTH2064635 bporiaac(3)IVHind ⅢXbaⅠH2pKC11396500 bpEcoRⅠoriXbaⅠ/EcoRⅠHind Ⅲ /EcoRⅠHind Ⅲ /XbaⅠEcoRⅠ H2Hind ⅢoriTXbaⅠH1EcoRⅠermEEcoRⅠ H1XbaⅠH2EcoRⅠXba ⅠHindⅢermEEcoRⅠ 1740 bpermEpTH30210418 bpaac(3)IVoriEcoRⅠpTH40712158 bpaac(3)IVori

Hind ⅢoriT图3-2 重组质粒pTH407的构建流程

Fig. 3-2 The procedures in the construction of recombinant plasmids pTH407

3.1.1 黑暗链霉菌Tt-49基因组的提取

根据方法2.2.3，提取黑暗链霉菌Tt-49的基因组DNA，经电泳检测，结果见图3-3。

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1Mbp193297743622342543472269018821489925图3-3 S.tenebraris Tt-49基因组DNA的电泳图 Fig. 3-3 Electrophoretogram of Genomic DNA

1: S.tenebraris Tt-49 Genomic DNA; M: marker (λ-EcoT14)

3.1.2 同源交换臂的扩增

以GenBank公布的安普霉素基因簇（登记号：AJ629123）为模板，选择aprH基因上下游序列作为同源交换臂。引物PH1/PH2用于扩增交换臂H1，引物PH3/PH4用于扩增交换臂H2，引物序列见表2-5。以黑暗链霉菌Tt-49基因组DNA为模板，根据表2-6 PCR 扩增体系与表2-7 PCR扩增程序，扩增交换臂H1和H2，经电泳检测，结果见图3-4。

1M2bp50003000200015001000750500250100bp50003000200015001000750500250M1

图3-4 H1与H2 PCR扩增产物电泳图 图3-5 ermE PCR扩增产物电泳图 Fig. 3-4 Electrophoretogram of PCR products Fig. 3-5 Electrophoretogram of PCR products of

of H1 and H2 ermE

1: H1; 2: H2; M: marker (DL5000) 1: ermE; M: marker (DL5000)

3.1.3 抗性筛选标记的扩增

以质粒pAGe为模板，利用引物PE1/PE2扩增红霉素抗性基因ermE，经电泳检测，结果见图3-5。

3.1.4 重组质粒pTH407的构建

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暗霉素定向生物合成研究

重组质粒pTH407的构建过程如下：

1) 克隆载体pMD19-T与交换臂H1酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在

含有氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证（图3-6），成功构建中间质粒pTH101。利用同样的方法，将克隆载体pMD19-T分别与交换臂H2和红霉素抗性基因ermE进行酶连，成功构建中间质粒pTH206和pTE1，酶切验证如图3-6和图3-7所示。

2) 质粒pTH101经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，回收2062 bp片段；质粒pTH206经XbaⅠ和

HindⅢ双酶切，回收1937 bp片段；穿梭载体pKC1139经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收6419 bp片段。将以上三个片段酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有安普霉素的LB平板上培养，挑选阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证（图3-8），成功构建中间质粒pTH302。

3) 质粒pTE1经EcoRⅠ酶切，回收1740 bp的红霉素抗性基因ermE，与经EcoRⅠ单酶

切的质粒pTH302酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含安普霉素的LB平板上培养，挑取阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证（图3-9），成功构建重组质粒pTH407。

1M2bp50003000200015001000750500250100bp50003000200015001000750500250100M1

图3-6 中间质粒pTH101和pTH206的酶切鉴定 Fig. 3-6 Restriction analyses of plasmid pTH101

and pTH206

1: pTH101/ EcoR I/Xba I; 2: pTH206/Xba I/Hind III;

M: marker (DL5000)

图3-7 中间质粒pTE1的酶切鉴定 Fig. 3-7 Restriction analyses of plasmid pTE1 1: pTE1/EcoRⅠ; M: marker (DL5000)

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1Mbp500030002000150010007505002501001Mbp50003000200015001000750500250100

图3-8 中间质粒pTH302的酶切验证 Fig. 3-8 Restriction analyses of plasmid pTH302 1: pTH302 /EcoR I/Hind III; M: marker (DL5000)

图3-9 重组质粒pTH407的酶切验证 Fig. 3-9 Restriction analyses of recombinant

plasmid pTH407

1: pTH407 /EcoR I/Hind III; M: marker (DL5000)

3.2 aprH基因缺失突变株的筛选

3.2.1 接合转移

将重组质粒pTH407转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），获得供体菌大肠杆菌ET12567（pUZ8002/pTH407）。根据方法2.2.11，处理供体大肠杆菌与受体黑暗链霉菌孢子，将大肠杆菌悬液和孢子悬液等比例混合，梯度稀释后涂布于MS平板，置于37℃培养18～24 h，再用含红霉素（50 μg/mL）与萘啶酸（25 μg/mL）的水溶液覆盖，继续培养3～4天，直到接合子长出。

由于重组质粒pTH407携带有链霉菌温度敏感型复制子，当培养温度高于34℃时，该质粒在链霉菌中无法自主复制。因此，在双重选择压力下，只有重组质粒pTH407经同源重组整合至链霉菌基因组上的菌株方能生长，而Tt-49和ET12567（pUZ8002/pTH407）均不能生长，MS平板上长出的接合子极可能为单交换工程菌。

3.2.2 单交换工程菌的鉴定

挑取长势较好的3个单菌落，编号TH301、TH302和TH303，在含红霉素（50 μg/mL）和萘啶酮酸（25 μg/mL）的抗性平板上传代5次，经考察生长性状稳定。为进一步验证，提取突变株TH303的基因组DNA，根据同源重组原理设计引物PH5/PH6进行PCR鉴定，同源重组示意图及引物PH5/PH6的位置见图3-10。如图所示，理论上Tt-49的PCR产物只有1881 bp的条带，而突变株TH303的PCR产物有1881 bp和1116 bp两条条带。PCR产物电泳检测结果与理论相符（图3-11），这说明重组质粒pTH407已整合至基因组，确定突变株TH303为单交换工程菌。

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aac(3)IVoripTH40712158 bpermEoriTH2②H2H1①H1①Single Crossover IPH5ChromosomeaprF1116bpPH6aprGaprHaprIaprJaprKPH51881bpPH6②H1PH5H21881bporiToriaac(3)IVermEH1aprHH2PH51116bpPH6Single Crossover II①Reverse Mutation②Double CrossoverPH6oriTPH5oriaac(3)IV1881bpH1aprHH2ermEPH6H1H2②H1aprHH2PH51116bpPH6①H2H1

图3-10 重组质粒pTH407与Tt-49基因组DNA同源重组示意图

Fig. 3-10 Sketch map of homologous recombination between plasmid pTH407 and Tt-49 chromosome DNA

123Mbp50003000200015001000750500250100

图3-11 工程菌PCR产物电泳检测

Fig. 3-11 PCR verification of engineering bacteria 1: Tt-49; 2: TH303; 3: TH304; M: marker (DL5000)

3.2.3 aprH基因缺失突变株的筛选

单交换工程菌具有遗传不稳定性，容易发生第二次同源重组，形成目的基因部分缺失的突变株，或重组质粒从基因组上脱落的回复突变株（图3-10）。因此，可利用这一原理

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筛选aprH基因缺失突变株。由于引物PH5/PH6分别覆盖了交换臂H1下游序列和交换臂H2上游序列，根据同源重组模型，Tt-49或回复突变株可扩增得到1881 bp的片段，单交换工程菌则可扩增得到1881 bp和1116 bp的两条片段，基因缺失突变株可扩增得到1116 bp的片段。

将突变株TH303转接斜面培养基，松弛培养3代后进行分离纯化，挑取单菌落影印至添加红霉素的抗性平板以及不添加抗生素的普通平板上，经筛选得到10株在普通平板上生长，而在抗性平板上不生长的红霉素敏感型（EryS）菌株。这些EryS菌株可能为aprH基因部分缺失突变株，也可能是回复突变株。利用引物PH5/PH6进行PCR验证，获得一株PCR产物与理论相符的突变株，命名为黑暗链霉菌TH304，简称TH304。以出发菌Tt-49和单交换工程菌TH303作对照，PCR产物检测结果见图 3-11。经测序验证（附1），与预测吻合，确定工程菌TH304为aprH基因缺失突变株。

3.3 工程菌TH304次级代谢产物分析

以出发菌Tt-49作对照，对工程菌TH304进行多次传代培养，发现其与Tt-49相比，菌株生长周期较长，产孢能力差。在相同条件下，对二者进行5次摇瓶发酵。结果显示，工程菌TH304代谢产物总效价均值为2250 μ/mL，约为出发菌的75 %。

根据方法2.2.13，对出发菌Tt-49和工程菌TH304的发酵产物进行处理，提取次级代谢产物。将发酵液处理样品按方法2.2.15.1进行TLC分析，结果如图3-12所示：出发菌Tt-49主要产安普霉素和氨甲酰妥布霉素，含少量的妥布霉素；而工程菌TH304主要积累氨甲酰妥布霉素，并未检测到安普霉素。

CTBTOBAPR1234图3-12 工程菌TH304代谢产物TLC分析 Fig. 3-12 TLC analysis of metabolites from TH304

1: 安普霉素标准品; 2: 妥布霉素标准品; 3: Tt-49; 4: TH304

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根据方法2.2.15.2对工程菌TH304的次级代谢产物进行MS分析，结果见图3-13：Tt-49检测到m/z 468.2703、m/z 511.2765和m/z 540.2922三个分子离子峰，分别对应妥布霉素、氨甲酰妥布霉素和安普霉素；而工程菌TH304只检测到m/z 468.2697、m/z 511.2758两个分子离子峰，并没有安普霉素的分子离子峰，这说明安普霉素生物合成已被成功阻断，工程菌TH304主产氨甲酰妥布霉素。

Intens.x106Tt-49氨甲酰妥布霉素511.2765安普霉素540.29220.80.60.40.20Intens.5x103.22.82.42.01.61.20.80.40410420430440450460470480490500400410420430440450460470480妥布霉素468.2703490500510520530540550560570580TH304氨甲酰妥布霉素511.2758妥布霉素468.2697510520530540550560570580590Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)图3-13 工程菌TH304代谢产物MS分析 Fig. 3-13 MS analysis of metabolites from TH304

3.4 小结

通过克隆aprH基因上下游序列作为同源交换臂，插入到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139的多克隆位点上，并在交换臂外侧连接红霉素抗性基因ermE作为筛选标记，成功构建了用于敲除aprH基因的重组质粒pTH407。将pTH407转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49，利用红霉素抗性筛选得到单交换工程菌TH303。对TH303松弛培养后，利用影印筛选和PCR鉴定，最终获得aprH基因失活突变株TH304。

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对工程菌TH304进行多次传代培养，发现其与出发菌Tt-49相比，生长周期较长，产孢能力差。效价测定结果显示，Tt-49代谢产物总效价约3000 μ/mL，而TH304为2250 μ/mL，约Tt-49的75%。TLC分析和MS分析结果一致，都证明工程菌TH304不再合成安普霉素，主要积累氨甲酰妥布霉素。

结果表明，aprH基因的框内敲除同样可以阻断安普霉素的合成，提高氨甲酰妥布霉素的产量。由此可见，aprH基因是安普霉素生物合成的关键基因，可能编码糖基转移酶（AprH），在2-脱氧链霉胺合成假二糖的过程中发挥不可替代的作用。

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第四章 aprJ基因缺失突变株的构建

第三章通过阻断安普霉素生物合成基因簇中的aprH基因，获得了主产氨甲酰妥布霉素的工程菌TH302。然而，TH302生长周期较长，产孢能力差，发酵单位仅为Tt-49的75%，不利于生产上的应用。经生物信息学分析，安普霉素生物合成基因簇上aprJ基因，可能编码与辛二糖合成相关的磷酸变位酶。为此，拟采用同样的原理与方法，对安普霉素生物合成基因簇中的aprJ基因进行框内敲除研究。以期获得尽可能高产的氨甲酰妥布霉素工程菌，简化从暗霉素中分离氨甲酰妥布霉素的繁琐过程，直接发酵制备氨甲酰妥布霉素，进而降低生产成本，提高经济效益。

4.1 重组质粒pTJ401的构建

锁定aprJ基因上下游序列，设计敲除方案（图4-1）。选择穿梭质粒pKC1139作为载体，红霉素抗性基因ermE为筛选标记，构建重组质粒pTJ401，具体流程如图4-2所示。

J1(1985bp)aprHaprI405bpaprJJ2(1925bp)aprKaprM图4-1 aprJ的敲除方案

Fig. 4-1 Gene deletion scheme of aprJ

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Hind ⅢJ11997 bpXbaⅠXbaⅠLacZCloning SiteJ21937 bpEcoRⅠTA-cloneAmprpMD19-T2694 bpTA-cloneoriAmprXbaⅠHind ⅢXbaⅠHind ⅢEcoRⅠlacZoriTAmprEcoRⅠXbaⅠEcoRⅠpTJ1064691 bporiHind ⅢXbaⅠHind Ⅲ /XbaⅠJ1pTJ2054629 bporiaac(3)IVXbaⅠJ2pKC11396500 bporiHind Ⅲ /EcoRⅠXbaⅠ/EcoRⅠEcoRⅠ J1Hind ⅢoriTXbaⅠJ2EcoRⅠermEEcoRⅠ 1740 bpermEEcoRⅠXba ⅠBamHⅠJ2HindⅢermEBamHⅠEcoRⅠ XbaⅠJ1pTJ30210341 bpaac(3)IVoriEcoRⅠpTJ40112081 bpaac(3)IVoriBamHⅠHind ⅢoriT图4-2 重组质粒pTJ401的构建流程

Fig. 4-2 The procedures in the construction of recombinant plasmids pTJ401

4.1.1 同源交换臂的扩增

以GenBank公布的安普霉素基因簇（登记号：AJ629123）为模板，选择aprJ基因上下游序列作为同源交换臂。引物PJ1/PJ2用于扩增交换臂J1，引物PJ3/PJ4用于扩增交换臂J2，引物序列见表2-5。以黑暗链霉菌Tt-49基因组DNA为模板，根据表2-6 PCR 扩增体系与表2-7 PCR扩增程序，扩增交换臂J1和J2，经电泳检测，结果见图4-3。

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12Mbp5000300020001500100075050025010012Mbp50003000200015001000750500250100

图4-3 J1与J2 PCR扩增产物电泳图 Fig. 4-3 Electrophoretogram of PCR products of

J1 and J2

1: J1; 2: J2; M: marker (DL5000)

12Mbp50003000200015001000750500250100

图4-4 中间质粒pTJ106和pTJ205的酶切鉴定 Fig. 4-4 Restriction analyses of plasmid pTJ106

and pTJ205

1: pTJ106/ HindⅢ/ XbaⅠ; 2: pTJ205/ XbaⅠ/

EcoRⅠ; M: marker (DL5000)

123Mbp19329774362233472269018821489925

图4-5 中间质粒pTJ305的酶切验证 Fig. 4-5 Restriction analyses of plasmid pTJ305 1: pTJ305/EcoR I/ HindⅢ; 2: pTJ305/ EcoRⅠ;

M: marker (DL5000)

图4-6 质粒pTJ401酶切验证

Fig. 4-6 Restriction analyses of plasmid pTJ401 1: pTJ401/BamHⅠ; 2: pTJ401/HindⅢ; 3: pTJ401/EcoRⅠ; M: marker (λ-EcoT14)

4.1.2 重组质粒pTJ401的构建

重组质粒pTJ401的构建：

1) 克隆载体pMD19-T与交换臂J1酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在

含有氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证，成功构建中间质粒pTJ106。利用同样的方法，将克隆载体pMD19-T与交换臂J2酶连，成功构建中间质粒pTJ205，酶切验证如图4-4所示。

2) 质粒pTJ106经HindⅢ和XbaⅠ双酶切，回收1991 bp片段；质粒pTJ205经XbaⅠ和

EcoRⅠ双酶切，回收1931 bp片段；穿梭载体pKC1139经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，回收6419 bp片段。将以上三个片段酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有安普霉素的LB平板上培养，挑选阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证（图4-5），成功构建中间质粒pTJ305。

3) 质粒pTE1经EcoRⅠ酶切，回收1740 bp的红霉素抗性基因ermE，与经EcoRⅠ单酶

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切的质粒pTJ305酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含安普霉素的LB平板上培养，挑取阳性克隆子进行扩大培养，抽提质粒并酶切验证（图4-6），成功构建重组质粒pTJ401。

4.2 aprJ基因缺失突变株的筛选

4.2.1 单交换工程菌的鉴定

将重组质粒pTJ401转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），获得供体菌大肠杆菌ET12567（pUZ8002/pTJ401）。根据方法2.2.11，将重组质粒pTJ401导入出发菌株Tt-49，获得接合子。

挑取长势较好的接合子，编号TJ301，在含红霉素（50 μg/mL）和萘啶酮酸（25 μg/mL）的抗性平板上传代5次，经考察生长性状稳定。提取突变株TJ301的基因组DNA，根据同源重组原理设计引物PJ5/PJ6进行PCR鉴定，同源重组示意图及引物PJ5/PJ6的位置见图4-7。如图所示，理论上Tt-49的PCR产物只有1931 bp的条带，而突变株TJ301的PCR产物有1931 bp和1526 bp两条条带。PCR产物电泳检测结果与理论相符（图4-8），这说明重组质粒pTJ401已整合至基因组，确定突变株TJ301为单交换工程菌。

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