文库构建

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cDNA基因文库的构建

2009-10-11 17:56:18| 分类: 生命科学|举报|字号 订阅

一、cDNA文库的特征和发展:

cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板,在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA,反义链),以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链,正义链),得到双链cDNA。

将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板,在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA,然后连接到合适的载体上,并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。

1)cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区,不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。

2)cDNA一般较短,平均长度1.5kb左右,多数为100bp至10kb。 3)表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4)不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 二、cDNA文库的构建: 1、RNA的分离

mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA,而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪,平均为2%,mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小,因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量,可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。 1)根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件,用于提取RNA。

2)保持mRNA的完整性,是构建全长cDNA文库的核心。

3)选取合适的提取方法,除完整性外,mRNA还要求纯度高、DNA污染少,最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。

4)RNA定量准确,保存合理。

5)根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。 2、第一链cDNA的合成

由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT),由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶,合成DNA是需要引物引导。常用的引物有:

oligo(dT)引物:在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物, oligo(dT)引物与mRNA 3’末端的poly(A)配对,引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA,反转录的是整个表达谱,可以产生全长cDNA,应用最广。

随机引物:与mRNA分子内的多处配对,从多个位置合成cDNA第一链,反转录的几乎是整个表达谱,最多只能产生近全长cDNA,适合于得到总cDNA的5’末端。

基因特异引物(gene-specific primer, GSP):仅反转录特定目标基因cDNA的5’末端。

有AMV和MMLV两种RTase,最适温度分别为42℃和37℃,需要敲除其RNase H活性,较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构,得到全长cDNA。 反转录过程中要防止mRNA降解,可以添加RNase抑制剂。 3、第二链cDNA的合成

cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。 4种cDNA第二链合成的方法:

自身引导合成法:解离的cDNA第一链的3’末端会产生一个发夹状结构,可以引导第二链的合成,然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5’不完整,且S1核酸酶处理不好控制,易导致cDNA的丢失,所以该法现已少用。 置换合成法:RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶联合处理,得到近全长cDNA,5’缺失短序列。

引导合成法:利用末端转移酶在cDNA第一链的3’末端加上poly(dC)尾巴,利用poly(dG)为引物引导第二链合成,利用同源多聚尾与载体进行重组。

引物-衔接头合成法:引导合成法的改进型,在反转录引物和poly(dG)引物的5’引入优化设计的人工接头,可用PCR扩增广大总cDNA,也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。

4、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖

反转录和第二链合成过程中为cDNA两端引物合理的人工接头序列是关键(试剂盒),可以方便定向克隆和克隆子的处理。

总cDNA的分级分离:采用排阻层析柱,去除过大和过小的cDNA分子,保留500bp至8kb的总cDNA,以提高连接后文库的质量。 三、cDNA文库的均一化处理 1、基因组DNA饱和杂交法

mRNA水平上,基因之间丰度差异极大。 基因组水平,基因之间拷贝数差异不大。

将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针,与总cDNA单链饱和杂交,弃除未杂交的总cDNA,从cDNA-DNA杂交体上变性释放除均一化后的总cDNA,转化宿主。

优点是简单,缺点是易导致部分基因cDNA的丢失。 2、基于复性动力学原理的均一化处理

二次复性动力学原理(second-order kinetcs):浓度大的组分复性所需时间短,浓度越小复性越迟。

控制复性时间,用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开,保留单链cDNA后转化宿主。

优点是基因丢失较少、均一化效果好,缺点是操作难度大。 四、扣除杂交cDNA文库

利用分子杂交原理,去除非差异表达基因的cDNA,保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。

tester: 待测样本的总cDNA。

driver: 表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。

tester与过量的driver杂交,用特定方法将二者共同表达的cDNA去除。 1、抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)

为Clontech公司的专利试剂盒原理,将tester打上两组特定设计的接头,分别与过量driver进行第一轮杂交,然混合两种杂交体系进行第二轮杂交,通过PCR法特异扩增差异表达基因的cDNA,特定接头会通过锅柄结构而抑制非差异表达基因的PCR扩增。

2、mRNA-cDNA杂交:过量的驱动总mRNA与总cDNA杂交,利用生物素磁珠法将公共表达基因去除。 五、全长cDNA文库

cDNA不完整的原因:mRNA的降解、第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶的特性的RNase H活性、反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)。

1、SMART全长cDNA文库的构建方法

为Clontech公司的专利试剂盒原理,应用广泛,其独特的反转录酶具有末端转移酶活性, RTase自动在反转录得到的全长cDNA第一链的3’末端加上oligo(dC),利用具oligo(dG)的接头引导第二链的合成。由于oligo(dC)比较短,因此较短的oligo(dG)容易介导合成假全长cDNA。 2、Cap-Trapper法构建全长cDNA文库

在mRNA的两端均打上生物素标记,合成cDNA第一链时用dm5 CTP代替dCTP,用RNaseⅠ消化单链RNA。 3、烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库

Invitrogen公司的试剂盒原理,首先利用碱性磷酸酶处理使非全长mRNA无效化。用烟草酸性焦磷酸酶(tobacco acid pyrophosphatease, TAP)处理以移去全长mRNA的帽子结构,然后为脱帽后的全长mRNA的5’末端接上人工接头,利用具oligo(dT)的人工接头进行反转录,得到的全长cDNA第一链的两端就打上了特别设计的人工接头,可用PCR法对全长总cDNA进行放大,酶切后与载体连接。

优点是理论上全部cDNA都将是全长,缺点是操作的技术性强。

六、其它cDNA文库

表达cDNA文库:用表达载体构建全长cDNA文库,文库的每一个克隆子可以表达出蛋白,利用蛋白对克隆子进行筛选。

双杂交全长cDNA文库:将表达文库与酵母双杂交系统结合使用,利用酵母作宿主,通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选,用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因,主要为转录因子。

重组酶克隆策略的cDNA文库:将重组酶的特异识别序列attP1和attP2构建到每个cDNA的两端,在非消化情况下实现与载体的重组连接,避免了基因被切断。

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/18ap.html

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