1 构建质粒

基因序列分析：

同源比对（保守性） 不同蛋白比对相似序列 预测结构域 记录：

1） 保存预测结果（同源性、二级结构）

2） 记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等

电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）

3） 确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）

网站：

NCBI CDS（mRNA编码区) Expasy 软件： Jalview

1） sequence alignment：

a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行搜索）； Main:

human/Homo sapiens

chimpanzee/Pan troglodytes monkey/Macaca mulatta dog/

horse/Equus caballus cattle/Bos taurus pig/ Sus scrofa

mouse/Mus musculus Rat/Rattus norvegicus chicken/ Gallus gallus

frog/ Xenopus (Silurana) tropicalis zebrafish/ Danio rerio

_chimpanzee _monkey _dog _horse _cattle

_pig _mouse _Rat _chicken _frog

_zebrafish

b、将FASTA导入记事本后，用ClustalW2进行align，（option-Input），根据结果删除差别大的、重要性小的。 2）功能域预测：

用SMART预测domain，（full annotation看domain相关信息）。不够准确! 3）比较相似结构：

用sequence进行搜索（PDB），BLAST看相似度，用pymol分析相似结构，将未算出相似结构的进一步搜索。 4） pymol结构分析：

（可选取片段保存；command：load[protein code]）

Generate-symmetry mates看晶胞中堆积方式（+cap帮助堆积） 复合物与单体进行align，看结合面 查阅报道相似结构的文献 5） sequence pattern：

二级结构预测：Jpred、PSIPRED（截片段） 三级结构预测：Phyre2（full length）

引物设计：

1） 分析自身酶切位点：软件DNAMAN（copy/paste/select/load sequence/from

selection/restriction analysis），选择要用的酶切位点（注意同尾酶， BgLⅡ和BamHⅠ） 2） 设计引物：软件Primer Premier

（突变时不考虑酶切位点；

一段引物+（终止密码子）+酶切位点+保护碱基（注意读码框），长度为15-25bp左右； 上下游引物的Tm尽可能相近，不要多于4bp互补； 引物在未加酶切片段前，Tm=55左右； 3’端为C或G；）

记下引物序列（酶切位点用小写表示）以及Tm值，订购引物

突变引物：

1） 环P，平末端连接 2） 四引物

3） 环p，Dnpi酶解甲基化质粒

PCR:

1） 克隆基因名称 2） 60?L体系：

5x Q5 Buffer 12?L dNTP(2.5mM) 2.4?L P1 3?L（10??） P2 3?L Gene 1??L （Nanodrop测得>100，一般稀释1/10） Q5 0.6??L （与Easy Tag相比效率高，是高保真酶） ddH2O 38??L （加入GC enhancer 12??L时，为26??L） 3） 分为6个10??L，执行梯度PCR程序：

98℃：3min 98℃：8s

（多为52-64℃，记下6管对应值）：20s 72℃：（1min/2Kb） (循环25-30次) 72℃：10min 12℃：2h

琼脂糖凝胶电泳：

1） 配1%琼脂糖凝胶：

称1g Agarose Gel，加入100mLTAE Buffer，微波炉中高热2min溶解，冷却2min后加入2dEB，倒入模具冷却。 2） 电泳：

上样：Sample（10?L）+ 6xLoading Buffer（2?L） 电泳：150-160V/10-15min（150V/7min） 在UV下观察条带

胶回收：

切下目的DNA条带，放入EP管中，+400?LPC Buffer，金属浴60℃/10min

将该溶液移至预先用500?LBL Buffer平衡的CB2柱中，结合5min，离心9000rpm/1min +300?LPC Buffer，洗去多余的胶，离心12000rpm/1min，弃去滤液 2X (+600?LPW Buffer，离心12000rpm/1min，弃去滤液) 离心12000rpm/3min，金属浴62℃/10min

+30?L预热的ddH2O，结合6min后，离心12000rpm/1min 收集滤液，测DNA浓度（注意A260/280在1.65-1.85）

酶切：

Vector名 50?L体系： 10x Buffer 5?L(NEB Double Digest Finder选用两种酶在其中的活性都是100的Buffer) 酶1/酶2 各1.5?L Vector 10?L（<=2?g）；3?L（>100） (100x BSA 0.5?L) ddH2O 补齐 gene名 50?L体系： 10x Buffer 5?L 酶1/酶2 各1.5?L gene 30?L (100x BSA 0.5?L) ddH2O 补齐

置于37℃培养箱内酶切，2-12h，胶回收后连接。 （单酶切产物在胶回收1h前加入1.5?LCIP） Nede1 酶切30min， 胶回收后直接连接

连接：

Vector: Gene:

10?L体系： 10x T4 Buffer 1?L Vector 1-1.5?L------2.5?L Gene 5-7?L------6?L T4 ligase 0.5?L ddH2O 补齐 室温（或16℃），2-3h。

（最佳摩尔比vector：gene = 1:3-1:10，等质量时摩尔比vector：gene约为1/4，所以质量比vector：gene= 1:2时即可）

同源重组：

20?L反应体系： 5x CEII Buffer vector (0.02xbp)ng gene (0.04xbp)ng ExnaseII ddH2O 37℃/30min 0℃/5min 转化

4?L

50-200ng (之前取10-20?L vector酶切) 20-200ng 2?L

磷酸化（平末端连接）：

10?L体系： 10x T4 Buffer 1?L T4 PNK 0.5?L PCR产物 8.5?L

置于37℃培养箱内进行磷酸化，1h后加入0.5?LT4 ligase，室温下2-3h。

Dpn1消化0.5?L/10?L, 37℃/2-3h.

转化：

0.5?L质粒or 10?L连接产物

加入刚化冻的BL21av（用于表达）orDH5?（用于扩增）置于冰上30min 置于42℃金属浴上热激75s后置于冰上2min

加入预热至37℃的200?LLB培养液，置于37℃培养箱30min 在超净台中涂板（注意抗性） 置于37℃培养箱过夜

PCR Screen：

1）菌落名，随机挑取单克隆，加入80?LddH2O中，金属浴上100℃/10min，作为template 2）6x10?L体系： ddH2O 42?L Buffer 6?L dNTP 4.8?L Template（阴性对照） 0.5?L P1/P2 各3?L Easy Tag 0.5?L 3）执行Screen程序： 95℃：5min 95℃：30s 56℃：30s 72℃：（1Kb/1min） （循环25次） 72℃：10min 12℃：2h

接种：

菌落名

挑取单克隆，加入10mL LB培养基 +10?LAmp/5?L Kan，置于37℃摇床培养16h （Bacmid， 10?L Kan. 10?L T (10mg/mL), 1?LG）

提质粒：

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4qz6.html