质粒DNA的小量制备

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（LDNA），通称L构型。质粒DNA M r一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的M r为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管M r相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为LDNA和ocDNA。 二、实验材料与设备 1、用品与仪器

可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），移液吸头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速离心机，旋涡振荡器。 实验材料：含pUC19质粒DNA的大肠杆菌。 2、试剂

LB（Luria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，用10mol/LNaOH调pH至7.0。高温高压灭菌。

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溶液I：50mmol/L葡萄糖/25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）/10 mmol/L EDTA(pH8.0), 高温

高压灭菌(60895×104Pa)15min,贮存于4℃。

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH/1％SDS（临用时配制，可不用灭菌）。

溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAC，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O），钾

离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。高温高压灭菌。

V（酚）：V（氯仿）=1∶1：酚需在180℃重蒸，加入抗氧化剂8–羟基喹啉，终浓度为0.1﹪，并用Tris·HCI缓冲液平衡至pH＞7.6。氯仿中加入异戊醇［V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1］。

1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCI，pH8.0/1mmol/L EDTA/20μg/mL RNaseA。 无水乙醇，70％乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。 三、实验操作程序 1、 细菌的生长与收获

（1）将3~5 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长

玻璃试管中，接入一单菌落，于37℃振荡（350 r/min）培养过夜。

（2）取1.5mL细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000r/min离心2min去掉上清液，

使细菌沉淀尽可能干燥。

2、碱裂解法提取质粒DNA

（1） 将细菌沉淀重悬于100 μl预冷的溶液Ⅰ中，充分分散混悬细菌。

（2） 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离

心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，冰浴放置5min。

（3） 加入150 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物

中分散均匀，冰浴放置5min。

（4） 10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。

（5） 向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以10 000r/min离心2 min，转移上

层水相至新的Eppendorf管中。

（6） 向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心

5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。

（7） 加入1 ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空

气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。

（8） 用20~30 μl含RNaseA酶（20 μg/ml）的TE溶解沉淀，4℃贮存备用。

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3、讨论

（1）．细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。

（2）．提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。 （3）．采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提一次，已能达到实验要求。注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。

（4）． 乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（无水乙醇贮存于-20℃），沉淀条件为-20℃，1 h。因本实验为微量快速，室温下数分钟DNA即可沉淀，虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉淀下来），有利于以后的酶切及电泳结果。沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来，这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来，因此需要用70％乙醇很好地洗涤。一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。 四、结果与分析：

1、在提取过程中，溶液出现什么变化（混浊或澄清，是否分层）？有无沉淀产生？ 2、提出的质粒DNA是什么颜色？外观质量如何？

3、实验操作过程中需要注意哪些问题才能得到质量较好的质粒DNA？

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实验二 质粒DNA的酶切

一、实验原理

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端： 5'…G↓AATTC…3' 5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' 3'… CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星活力。 二、材料、试剂和仪器 1 材料：质粒DNA

2 试剂：限制性内切酶、ddH2O

3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪

实验程序：取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂，最后用双蒸水补足至10μL，小心

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混匀。37℃水浴保温1—2h，然后各小管内加入1μL的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。 I. .单酶切：

（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 ul ddH2O 3 ul 10×buffer 1 ul

限制性内切酶 1 ul（约10U） 总体积 10 ul （2）混匀，稍离心 （3）37℃水浴1~3hr

（4）70℃水浴10min，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果 II. 双酶切：

（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 ul（约1ug） ddH2O 3 ul 10×buffer 1 ul 限制性内切酶1 0.5 ul 限制性内切酶2 0.5 ul 总体积 10 ul （2）混匀，稍离心 （3）37℃水浴1~3hr

（4）70℃水浴10min，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果

注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应

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时间4-5 hr，甚至过夜。限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 三、 结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。

M1 1 2 3 4 5 6 M2

图4 重组质粒HindIII+XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳

分析： M1: λ DNA/ HindIII, M2: DL2000, 1 - 6: 重组质粒HindIII+XbaI. 重组质粒用HindIII+XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。 四、思考题

假设一种内切酶在重组质粒上有两个酶切位点，如果酶切后的电泳显示有三条带，分析可能的原因.

说明DNA限制性内切酶图谱的构建在核酸研究和遗传工程等方面的应用价值。

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实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳

一、目的要求

1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。 2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。 3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。 二、原 理

DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。

琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。

表3-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系 琼脂糖凝胶浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

可分辨的线性DNA大小范围/kb 60—5 20—1 10—0.8 7—0.5 6—0.4 4—0.2 3—0.1 7

三、试剂和器材 一）、试剂

1. 酶反应终止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚蓝）：10 μl/组 称取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100 ml。

2. 电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍

称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）。 3. 溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：1滴/组

将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 4. 1%琼脂糖 二）、器材

Eppendorf离心管（1.5ml，预先高温高压灭毒，3个/组）及其离心管架，电泳槽（1个/组），电泳仪（1个/2组），凝胶塑料托盘（1个/组），锥形瓶（100 ml×1，烘干），小烧杯（50，100，250 ml），微量注射器（2 μl×3，15 μl或20 μl×1），一次性塑料手套(64只)，胶头滴管（×3），紫外反射投射仪，防护眼镜，洗瓶2个（分别盛重蒸水和蒸馏水），大烧杯1个，胶头滴管2支，量筒（50 ml×1），卡尺（学生自备） 四、操作方法

一、1.0%琼脂糖凝胶板的制备

1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5—1mm的间隙，安置好后保持静置状态。

2. 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30 mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。

图3-1 凝胶托盘的组

装

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3. 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。

4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。 5. 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3 mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 二、加样

用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2 μl的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25 μl，因此加样量不要超过20 μl，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。 三、电泳

加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。 四、观察

小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254 nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。

注意事项

1. 溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。

2. DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制时急需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。

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3. 加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。 思考题

1. 名词解释：限制性内切酶；Marker

2. 根据实验结果，解释琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段大小的根据，聚丙烯酰胺凝胶电泳能否测定DNA分子的大小，它们的区别是什么？

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实验四、PCR技术在农业中的应用（综合性）

利用提取的几种不同农作物品种DNA样品，用3～10个RAPD或SSR引物进行分子标记分析，学会从分子水平研究不同植物扩增DNA片段的遗传多样性。熟悉和掌握PCR技术的原理和方法，并能够使用、掌握相关实验仪器的操作和使用方法。

第一部分:植物DNA的提取与分离

一、目的：

学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的原理和操作步骤。 二、原理和方法

关于植物总DNA的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二种:CTAB法及SDS法。

1、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol／L NaCl)是可溶的。采用氯仿／异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动后也于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB。用新鲜材料提取时使用2×CTAB缓冲液。

实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。与SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA和RNA。 2、SDS（十二烷基硫酸钠）法：

其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度(55～65E)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(量常用的是加 5mol／L的KAC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。

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三、材料、试剂和仪器

1、试验材料：新鲜或超低温冷冻干燥植物组织0.2g 2、试剂：

2×CTAB提取缓冲液：2g/100ml CTAB, 100mmol/L Tirs·Cl(pH=8.0), 50mmol/L EDTA(pH=8.0)，700mmol/L Nacl(pH=8.0) 无水乙醇，70％乙醇，氯仿，异戊醇。 3、仪器设备：

恒温水浴锅，冰冻离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵 四、步骤

1）取约0.2g新鲜幼嫩叶或黄化苗在含有750ul预热提取缓冲液的研钵中磨碎后转至1.5ml的离心管中，65℃水浴30min,其间轻轻颠倒几次；

2）用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约5min左右，然后18℃下10000r/min离心10min；

3）上清液用2倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇沉淀， DNA用70%乙醇洗1～2次后,干燥,然后用无离子水溶解后待用或保存在－20℃冰箱中备用。 五、结果与分析

1、DNA提取过程中需要注意哪些问题？

2、DNA提取过程中溶液出现怎样变化？有无颜色、分层和沉淀产生？DNA的颜色、形态如何？

第二部分：DNA的定量分析

一、目的

了解检验DNA定量分析的方法和原理，熟悉检验提取DNA的质量，包括浓度与纯度的具体步骤和操作过程。 二、原理和方法 1、浓度

DNA样品的浓度一般可根据其在260nm的吸收值来确定。50ug／ml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25 ug ／ml的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。

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测定时因比色杯最小的容积为0.5ml，微量制备的样品总体积不过20～100ul，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。 2、纯度

纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。若OD260／OD280大于1.8，表明样品中有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质。 三、材料、试剂和仪器

1、实验材料：提取的植物总DNA 2、试剂：超纯水（dH2O）

3、仪器设备：紫外分光光度计，石英比色杯，烧杯、洗瓶 四、步骤

（1）预热分光光度计至少20min。

（2）取两只石英比色杯，一只装入3mldH2O作为空白溶液，校正分光光度计零点和透光度至100。

（3）测定DNA的浓度与纯度：取10ulDNA待测样品，加dH2O稀释混匀至3ml ，将两只比色杯放置在分光光度计中，调整入射光波长分别为260nm、280nm的OD值。（每次用dH2O液调整零点：T＝100、OD＝0）。 （4）DNA浓度与纯度的计算：

DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000 DNA样品的纯度：OD260／OD280 = OD260 ：OD280 五、结果与分析

DNA定量分析过程中需要注意哪些问题？如何保证测得结果比较正确？

第三部分：RAPD或SSR标记技术

一、目的

学习掌握应用RAPD或SSR技术对植物进行DNA水平的遗传多样性分析。 二、原理和方法

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RAPD标记技术:以基因组 DNA为模板，以10个碱基对的核苷酸序列作引物，通过PCR扩增反应以检测DNA序列多态性

SSR标记技术: 以基因组 DNA为模板，根据微卫星两端特异核苷酸序列设计引物，通过PCR扩增基因组中的重复序列位点，以分析DNA序列多态性。 三、材料、试剂和仪器 (一) RAPD标记技术

1、实验试剂与RAPD反应混合物体系：

10×buffer 2ul 25mM MgCl2 1.6ul 2.5 mM dNTP 1.6ul 引物 3ul(60ng) Taq 酶 0.5 ul (1.25 U) DNA 2ul (80ng) DH2O 9.3 总体积 20ul 2、实验仪器：

PCR仪，移液器，高速离心机、漩涡振荡器，0.2ml、1.5ml离心管 3、反应程序：

（1） 94℃ 3min ;

（2） 94℃ 1min， 37℃ 1min ，72℃ 2min, 35个循环； （3） 72℃ 5min； （4）

4℃下保存待测。

（二）SSR标记技术

1. 实验试剂与RAPD反应混合物体系：

10×buffer 2ul 25mM MgCl2 1.6ul 2.5 mM dNTP 1.6ul 左引物1 2ul (40ng) 右引物2 2ul (40ng) Taq 酶 0.2 ul (1 U) DNA 1.6ul(80ng) DH2O 9.0 ul 总体积 20ul

2. 实验仪器：

PCR仪， 移液器，漩涡振荡器，0.2ml离心管 3. 反应程序：

（1） 94℃ 3min；

（2）

94℃ 1min， 55℃ 1min ，72℃ 2min, 35个循环；

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（3） （4） 四、步骤

72℃ 5min； 4℃下保存待测。

1. 从－20℃冰箱中拿出DNA模板以及药品MgCl2 ，Taq酶，Buffer缓慢解冻（冬季直接在空气中解冻，夏季在4℃冰箱中或冰盒上解冻）。

2. 按照RAPD或SSR反应体系与实验目的，配制缺少DNA模板或RAPD或SSR引物的反应液混合物于0.5ml离心管中（注意：Taq酶在分装前的最后才从－20℃冰箱中取出，加入反应混合液中）混匀离心。

3. 分装反应液于0.2ml离心管后，按照实验的需要加入DNA模板或者RAPD引物，然后再次混匀后离心，接着用石蜡油封盖液体以防挥发。

4. 将装有反应体系的离心管放入，PCR仪的小孔中，开始按反应程序进行PCR（链式聚合酶反应）扩增

注意：1）两次混匀、离心都很重要，能够直接影响扩增的结果。

2）反应体系覆盖石蜡油必不可少，否则反映体系混合液会在高低温循环挥过程中发殆尽。 五、结果

记录扩增样品数量，循环次数和扩增时间。

(四 ) 琼脂糖凝胶电泳检测

一、目的

学习掌握应用琼脂糖凝胶电泳的原理及操作，并对PCR的扩增结果或者DNA的质量进行检测。 二、原理和方法

由于DNA在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电泳过程中DNA通过凝胶分子筛向正极端移动。迁移率与DNA分子的构型和大小相关，与DNA分子中的碱基组成和顺序无关。电泳结束后，用溴化乙锭染色。溴化乙锭与DNA的络合物在一定波长的紫外光照射下会发出红色荧光，由此可观察到DNA在凝胶中所处的位置。 三、材料、试剂和仪器

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1×TAE电泳缓冲液，琼脂糖，EB（溴化乙锭），三角瓶，做胶托盘，电泳槽，电泳仪，微波炉，电子天平，0.25％溴酚蓝加样缓冲液，胶梳 四、步骤

1) 称取适量琼脂糖在三角瓶中，按照胶的浓度加入1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解至完全透明。

2) 待冷却至60℃左右，加入终浓度为0.5ug/ml的EB，混匀。

3) 将胶床水平放置插好梳子，倒入琼脂糖凝胶溶液，梳子插入胶中3～5mm左右，放置30～60min，待凝胶完全凝固硬化。

4) 待检验PCR扩增产物中加入， 0.25％溴酚蓝加样缓冲液1～2ul，稍微离心。 5) 小心拔出梳子，检查样品孔完整性，样品孔中加入扩增后样品。 6) 将胶床，放入电泳缓冲液中，以5V/cm电压电泳。

7) 溴酚蓝泳动至胶3/4处时停止电泳，取出凝胶，在短波紫外线（254nm）下观察。

注意：记录点样顺序。

五、结果

记录扩增样品数量、电泳时间，条带的明亮度、多态性和模式图。

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1×TAE电泳缓冲液，琼脂糖，EB（溴化乙锭），三角瓶，做胶托盘，电泳槽，电泳仪，微波炉，电子天平，0.25％溴酚蓝加样缓冲液，胶梳 四、步骤

1) 称取适量琼脂糖在三角瓶中，按照胶的浓度加入1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解至完全透明。

2) 待冷却至60℃左右，加入终浓度为0.5ug/ml的EB，混匀。

3) 将胶床水平放置插好梳子，倒入琼脂糖凝胶溶液，梳子插入胶中3～5mm左右，放置30～60min，待凝胶完全凝固硬化。

4) 待检验PCR扩增产物中加入， 0.25％溴酚蓝加样缓冲液1～2ul，稍微离心。 5) 小心拔出梳子，检查样品孔完整性，样品孔中加入扩增后样品。 6) 将胶床，放入电泳缓冲液中，以5V/cm电压电泳。

7) 溴酚蓝泳动至胶3/4处时停止电泳，取出凝胶，在短波紫外线（254nm）下观察。

注意：记录点样顺序。

五、结果

记录扩增样品数量、电泳时间，条带的明亮度、多态性和模式图。

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