环境微生物多样性观察 - 图文

环境微生物多样性观察

徐萍

（南京师范大学，教师教育学院）

摘要：本文着重于环境微生物的观察。主要从以下四步来完成：环境微生物的采集与分离、不同微生物类群菌落的比较及细菌多样性的观察与鉴定、放线菌、真菌、霉菌高等真菌形态观察、自然界中噬菌体的分离。通过以上阶段性的研究学习微生物采集、分离、菌落鉴定等基本实验室操作方法；树立无菌意识。 前言

微生物在自然界中可以说是无处不在。不管我们生活的周围环境，还是我们体内都有大量微生物的存在，微生物不光分布广，而且种类繁多，数目庞大，让我们无法想象。我们每时每刻都在与微生物打交道，所以微生物与人类的关系非常密切。到底微生物与人类有着怎样的关系?实际上微生物与人类的关系有两个方面：有对人类有益的一面，也有对人类有害的一面。 一、 微生物与人类日常生物

人类要生存，就必须有食物。我们每天吃的很多的食品的制作都离不开微生物。比如：我们每天吃的馒头、面包、泡菜等食品。我们喝的营养丰富的酸奶；各种酒类-调味品中的醋、酱油它们都是经过微生物的发酵制作出来的。还有我们吃的营养丰富的菌类，如各种蘑菇、木耳，银耳。还有药用价值的灵芝，冬虫夏草也微生物。 二、 微生物与人类健康

在人体肠道中有很多微生物，其中要有大肠杆菌，乳酸杆菌等，这些细菌生活在人的肠道中能合成核黄素，维生素k等多种维生素以及氨基酸，以供人体吸收利用。 三、 微生物与农、牧

植物生长需要大量的营养物质，腐生性微生物能将人、畜粪便、植物枯枝落叶分解，并能转换成植物能够吸收利用的养料。如果没有这些微生物，植物就会由于没有充足的营养物质而无法正常生长发育。有的微生物能将空气中的氮，转化成植物可以吸收的含氮物质。这样可以减少对农作物的施肥量。如根瘤菌。 四、 微生物与环境

近年来随着人口的剧增，工业的迅速发展，环境受到了严重的污染。其中水域的污染是非常严重的。以前清澈见底，鱼虾嬉戏的景象再也看不见了。很多河流都变成了臭气熏天的臭水河。有些水域会出现赤潮。这都是水域受到严重污染的结果。水域污染治理的方法很多，在众多的污水、废水处理方法中，生物学的处理方法具有经济方便，效果好的突出优点被广泛应用。有些微生物能将水中的含碳有机物分解成二氧化碳等气体。将含氮有机物分解成氨，硝酸等物质。将汞、砷等对人体有毒的重金属盐在水体中进行转化，以便回收或除去。在以后的污水处理。

五、 微生物与自然界的物质循环

地球上每年都有大量的动，植物死亡，腐生性微生物会把这些动植物遗体分解，并能转换成植物能吸收和利用的养料从而促进了自然界的

物质循环。试想，自然界中如果没有这些微生物，那么地球上的动植物遗体早就堆积如山了。那么我们人类将会由于没有生存空间而无法在地球上生存、繁衍。[1]

微生物无处不在，也与我们人类密切相关，所以我们有什么理由不去研究微生物呢？让我们一起走进微生物奇妙王国吧！ 1环境微生物的采集与分离 1.1实验目的

了解环境与微生物的关系及其多样性；学习环境微生物（土壤、水体、人体等）采样的基本方法；初步掌握观察微生物的实验方法；了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使用方法； 了解并熟悉微生物的稀释涂布分离方法与技术；树立严格的无菌意识和掌握正确的无菌操作方法。 1.2实验内容与方法

天然环境微生物样品的采集、分离、培养 1.2.1环境微生物样品采集（分组采集）

空气中微生物采集：牛肉膏蛋白胨平板和马铃薯培养基，打开皿盖在空气中暴露5min后盖上皿盖（全班室外和室内各一个）。 土壤微生物采集：五点对角法取样，混匀，称取1 g土壤放入含9 ml无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），振荡分散。

水体微生物采集与稀释：用灭菌三角瓶分别取污水和水库水约100 ml。 1. 2.2样品稀释

土壤样品的稀释：称量2 g土壤放入含18 ml无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），混匀后用移液枪和枪头在离心管中进行10倍比逐级稀释成10-2,10-3的梯度样品。

水体微生物样品的稀释：将污水和洁净水, 分别稀释成10-1,10-2, 10-3等系列。

土壤加入水后已稀释了10倍!0.1ml 样品＋0.9ml 无菌水逐级稀释的样品要混匀！

1.2.3样品的平板稀释涂布取100μl稀释液于固体培养基平板表面中央，用无菌的玻璃涂棒将样品液滴均匀涂布分散在平板表面。 土壤样品：10-2,10-3样液（单号组10-2，双号组10-3） 1块 牛肉膏蛋白胨培养基 1块 高氏一号培养基 1块 马铃薯培养基

水体样品：库水:10-1，10-2, 污水:10-2,10-3样液（单号组库水，双号组污水）

2块 牛肉膏蛋白胨培养基

涂布时要涂至培养基表面略干为止！ 1.2.4培养

将平板倒置放入培养箱内进行培养。 牛肉膏蛋白胨培养基： 30℃ 24 h 高氏一号培养基： 28℃ 1 week 马铃薯培养基上： 28℃ 1 week

下周每个班提前一天课前半小时转接斜面, 培养。 无菌操作

使用灭菌器材取水和土样； 使用酒精灯灼烧实验器材；

使用酒精灯火焰制造局部无菌环境，甚至使用超净工作台。 1.3口腔微生物的观察

1.3．1取样：用无菌棉签在口腔内反复擦拭几遍，然后将棉签涂布于载玻片上(事先放1/3滴水)。

1.3.2制片(单染色法)

涂片→固定→沙黄染色2分钟→水洗至无色流液→吸去残留水→酒精灯干燥。

1.3.3显微镜油镜观察：按照低倍-高倍-油镜的顺序进行观察。

油镜：擦镜纸擦去镜头上的油，擦镜纸沾取二甲苯擦拭镜头，干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。 总结

.移液枪的正确使用

二.养成良好的无菌操作的意识

1.涉及到的实验材料要灭菌(水、枪头、涂棒、接种环等) 2.手要用75%的酒精擦拭

3.尽量靠近在酒精灯边操作 三.稀释涂布操作

1.涂棒灭菌和冷却 2.涂布要均匀 四.人体微生物的采集和观察

1.涂片要薄而均匀 2.固定温度不能高，以免影响细胞形态 3.染色后水洗要轻

五.显微镜的使用，油镜正确使用 六.菌种的转接 1.4实验结果

口腔微生物观察 2不同微生物类群菌落的比较及细菌多样性观察与鉴定 2.1实验目的

1.学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及 培养特征

2.了解革兰氏染色原理，掌握革兰氏染色技术 3.熟悉细菌芽孢和荚膜的染色方法

4.初步掌握平板菌落转接平板及固体斜面的菌种纯化方法

5.初步学习平板菌落计数以及活菌检测的方法 2.2实验材料

1.光学显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，无菌盖玻片； 2.结晶紫，沙黄，无水酒精，碘液，蒸馏水；

3.实验一分离培养的各种细菌平板、放线菌平板和真菌平板； 4.牛肉膏蛋白胨固体斜面，高氏一号和马铃薯培养基平板。 2.3实验材料

1. 大肠杆菌Escherichia coli (标准的G-细菌)

2.金黄色葡萄球菌Staphyloccus aureus (标准的G+细菌) 3.硅酸盐细菌 （供荚膜染色对照用） 4.自己转接未知菌株 2.4实验方法

(一)细菌平板菌落的斜面转接：提前24小时实验

用无菌接种环挑取实验一从环境中分离得到的平板单个菌落划线接种于牛肉膏蛋白胨的试管斜面上，每组挑取2个菌落（被挑选的菌落在转接前用记号笔在平板底部作好标记，以防混淆。被接种的细菌斜面做好标记，放置37℃培养箱内培养，供第二天细菌染色及形态学观察。

(二) 细菌染色及显微镜观察与鉴定

1.细菌的革兰氏染色

1)制片：在一块干净载玻片上的三个区域各滴加一小滴蒸馏水，分别挑取前一天细菌分离平板上单个菌落转接培养的斜面培养物，和两支革兰氏染色标准细菌斜面的菌苔与上述水滴混匀，制作成薄薄的细菌涂片。将此细菌涂片在酒精灯上方通过5-6次，以使干燥的细菌样品能够被固定在载玻片上。

标准革兰氏染色制样示意图标准G+待检菌标准G-

2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色（进行细菌芽孢的观察）。

3）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1min，后水洗。

4）脱色：除去残水后，滴加95%乙醇进行脱色到留下的乙醇无紫色为止（约20~30s），后立即用流水冲洗。

5）复染：滴加番红染色液，染3~5 min，水洗后用吸水纸吸干。 6）镜检：遵循低倍-高倍-油镜的顺序依次观察显微镜视野中的细菌样品和实验标准细菌的颜色(蓝紫色为革兰氏阳性细菌，红色为革兰氏阴性细菌)。观察染色结果并绘图 (拍照)。

2.细菌的芽孢染色（在革兰氏染色时观察）

1) 制片：细菌制片方法与革兰氏染色实验相同，分别挑取实验 一细菌分离平板上的单个细菌斜面的菌苔与上述水滴混匀，制作成薄薄的细菌涂片。将此细菌涂片在酒精灯上方通过5-6次，以使干燥的细菌样品能够被固定在载玻片上。

2)染色：使用沙黄或结晶紫对细菌样品染色2分钟，水洗去除染 液，吸水纸轻轻擦拭水滴，然后在酒精灯上方进行干燥。 3)镜检：分别用高倍镜和油镜观察，可以看到菌体显示蓝紫色

或红色，而细胞里面的芽孢则显示为无色透明。 (三)细菌、放线菌与真菌的平板菌落特征观察

微生物类别菌落特征形态特征相互关系单细胞微生物细菌小而均匀、个别有芽孢酵母菌大而分化菌丝状微生物放线菌细而均匀丝状交织霉菌粗而分化丝状交织主要特征细胞单个分散或按一定方式排列很湿或较湿小而突起或大而平坦透明或稍透明不结合多样相同一般很快一般有臭味单个分散或假丝状较湿大而突起稍透明不结合单调相同较快多带酒香菌落含水情况外观特征菌落透明度干燥或较干燥小而紧密不透明牢固结合十分多样一般不同慢常有泥腥味干燥大而疏松或大而致密不透明较牢固结合十分多样一般不同一般较快霉味菌落与培养基结合度参考特征菌落的颜色菌落正反面颜色差别细胞生长速度气味

2.3实验结果

阳性菌 金黄色葡萄球菌

芽孢荚膜

放线菌菌落 霉菌菌落插片培养 3 放线菌、霉菌的形态多样性观察及酵母细胞的显微测量和直接计数 3.1实验目的

放线菌、丝状真菌以及酵母菌显微结构的观察 了解丝状细菌和真菌的群落特征与细胞结构上的区别； 掌握测定微生物细胞大小的测微技术； 掌握对单细胞微生物进行显微直接计数的方法 3.2实验材料

实验二插片培养的放线菌平板与霉菌平板；

实验标准菌种：曲霉，青霉，根霉示范片；酿酒酵母菌悬液。 显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精灯、镊子等。 镜台测微尺、目镜测微尺、血球计数板 3.3酵母菌显微直接计数

方法：活菌计数法——平板菌落计数法；总菌计数法——血球计数板或霍瑟细菌计数板

取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。

取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，

计数室内不得有气泡。

用10×镜观察并将计数室移至视野中央。

在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。

注意事项：计上不计下，计左不计右。出芽计一半 3.3实验结果 青霉菌丝 黑曲霉菌丝 霉菌根丝 放线菌菌丝 黑曲霉菌丝 黑根霉孢子梗

4自然界中噬菌体的分离 4.1实验目的

1. 了解从环境污水中分离噬菌体的普通原理；

2.熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验方法；

3. 通过实验学习区分CFU（菌落形成单位）与PFU（噬斑形成单位）的概念。 4.2实验器材

1. 培养基：液体牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体上层培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂固体底层培养基； 2. 实验菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)；

大肠杆菌计数 黑根霉孢子囊 校准 3. 噬菌体样品：取自阴沟的环境污水

4. 实验仪器和用品：细菌过滤器，普通离心机。

实验结果 未出现噬菌斑 原因1分离噬菌体不纯 2学姐拿来的琼脂有问题 3琼脂温度过高

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