基因工程期末复习材料

名词解释

1. 基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，

通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

2. 基因克隆：指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，目的在于获得大量的基因拷贝 3. 载体：将外源基因引入宿主细胞进行复制或表达的运载工具。

4. 受体细胞 ：能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细

胞。

5. 限制性内切核酸酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA

分子进行切割的一种酶。

6. 黏性末端:指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结

构。

7. 平末端:限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端。 8. 同裂酶： 指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。

9. 同尾酶：指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同黏性末端的限制

性内切核酸酶。

10. 酶的星号活性：当条件改变时，许多限制酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的

非特异性的现象。

11. DNA连接酶：是一种能够催化双链DNA上彼此相邻的3’-OH和5’-P形成磷酸二酯键

的核酸酶。

12. DNA聚合酶：是指在引物和模板的存在下，将dNTP连续地加到双链DNA分子引物链的

3’-OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。

13. 反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶(RNA指导的DNA聚合酶)

14. 克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。

15. 表达载体：可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。 16. 穿梭载体 ：可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达的载体

17. 质粒：是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA 分子，可自主复制和表

达。

18. 质粒的拷贝数

19. 质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中细胞不能共存的现象。

20. α-互补：lacZ基因产物分为α链和β链两部分，只有当两者都存在时，才会表现出

酶活性，该作用称之为α-互补作用。

21. 插入失活：在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象。 22. 多克隆位点 （MCS）：包含多个单一限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。 23. 琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖为支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技

术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。

24. Southern杂交 ：是先将分布在琼脂糖凝胶上大小不同的变性DNA片段转移到滤膜上，

之后通过碱基互补配对，将滤膜与探针杂交，显色鉴定。

25. 探针：指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。聚合酶

链式反应 ：是以DNA为模板，在引物指导下由DNA聚合酶催化的对特定基因片断进行的体外扩增反应。

26. 引物：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。

1

27. 简并引物：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个

可能的编码序列，称之为简并序列。相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物。 28. 目的基因：是基因工程中克隆的目标DNA分子，是一段特定序列的DNA片段，而并不一

定是具有基因完整功能区的分子。 29. 基因文库 ：又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体

外重组后，转化宿主细胞，并通过筛选获得大量的阳性菌落(或噬菌斑)，所有菌落或噬菌斑的集合即为该生物的基因文库。

30. 基因组文库：是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总

称，包含了这一生物的全部遗传信息。 31. cDNA文库：是将生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克

隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。 32. 衔接物 ：用化学方法合成的一段8-12nt的含有一个或数个特定限制酶识别位点序列的

平端双链。

33. 转化：指以质粒为载体，将外源DNA导入处于感受态的E. coli等原核宿主细胞，并使

其获得新表型的过程。

34. 感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子生理状态的细胞

35. 感染 ：将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒感染受体菌的过程；

由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导(transduction)。

36. 转染：即转化与感染相结合，以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用

DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。 37. 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 38. 筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为

克隆子的筛选。

39. 阅读框架：是基因的编码区，包含从起始密码子至终止密码子之间的cDNA序列。 40. 启动子：是RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。 41. 增强子：是远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列。 42. 终止子：是为转录提供终止信号的一段DNA序列。

43. 沉默子：是远距离调节启动子以降低转录速率的一段DNA序列。 44. 操纵子：由数个功能相关的结构基因及其调控区 (操纵基因、启动子及其它有调控功能

的单位)组成。

45. 复制子：是一段包含复制起始位点和反式因子作用区在内的DNA区段。

46. 植物转化受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它途径，能高效、稳定

地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。

47. 胚胎干细胞:是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体和发育全能性

的细胞。

48. 细胞核移植技术:是将一个体细胞核移植到另一个体的卵细胞中去，最终产生一个与供

体细胞个体遗传性状一致的动物个体的技术。 P223-224

49. 基因治疗:是指向目的细胞引入正常功能的可表达的基因，从而修正由于基因缺陷所造

成的遗传性疾病。 50. 分子标记：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，表

现为核苷酸序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异。

问答及填空：

1. 基因工程的技术流程:

? 目的基因克隆

2

? 载体的准备

? 目的基因与载体的连接 ? 重组DNA转化/转染/转导 ? 重组体的筛选与鉴定

? 重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用

2. 基因工程的基本条件:目的基因、载体、工具酶、受体细胞（宿主细胞） 3. 基因工程的技术策略: (1). 强化基因的表达，改善生物性状 (2). 关闭特定基因的表达，改善生物性状 (3). 基因的异源表达赋予生物新的功能 4. II型限制性核酸内切酶命名原则：

1. 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；

流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。

2. 若该菌有不同的变种或品系，再加上变种或品系的第一个字母，如EcoRⅠ。

3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。

4. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)

5. 产生星活性的原因及影响其酶活性的因素

? 导致星号活性发生的因素

? 高甘油含量(>5%，V/V)；

? 限制酶用量过大(>100U/μg DNA)； ? 低离子强度(<25mmol/L)； ? 高pH(>pH8.0)；

? 含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；

2+2+2+2+2+

? Mn、Cu、Co、Zn等非Mg的二价阳离子存在。

? 抑制星号活性的方法

? 尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油

浓度；

? 尽量避免有机溶剂的污染； ? 将离子浓度提高到100-150mM； ? 将反应缓冲液的pH值降到7.0 ；

2+

? 二价离子用Mg。

6. DNA连接酶的种类及作用特点

种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、嗜热菌DNA连接酶 DNA连接酶催化的连接反应特点

? 连接反应发生在一条DNA链的3’-OH端和另一条DNA链的5’-P端之间；

+2+

? 连接反应需要ATP或NAD和Mg作为辅助因子与激活因子；

? DNA连接酶不能催化两单链DNA分子或环化单链DNA分子的连接；

? 只能连接双链DNA分子的单链缺口(nick)，不能连接双链中的裂口(gap)。 7. 常见工具酶的用途如： DNA聚合酶：

? 补齐5’-突起端

3

? 合成第二条cDNA

? 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） ? 切口移位制备探针

反转录酶：

? 以mRNA为模板合成其互补的DNA(cDNA)，用于构建cDNA和基因克隆； ? 对具5’端突出的DNA片段的3’凹端进行补平和标记，制备杂交探针； ? 代替Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。

碱性磷酸酶：

? DNA或RNA分子片段5’末端的去磷酸化，防止自身连接；在5’端标记之前，

去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团。P31-32

末端转移酶：

? 用于克隆DNA片段，给载体和外源DNA 3’末端分别加上互补的同聚物尾巴，

以便二者在体外连接。

32

? 用于DNA片段3’末端标记，催化[α-P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的

3’末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端。 ? 按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。

多核苷酸激酶：

? DNA 5’端磷酸化

? 标记DNA或RNA的5’端

8. 质粒的基本性质：

自主复制性、不相容性、转移性、携带特殊的遗传标记 9. 理想质粒载体的必备条件和质粒载体人工构建的策略 理想质粒载体的必备条件：

? 具有较小的分子质量和较高的拷贝数； ? 具有尽可能多限制酶的单一酶切位点； ? 具有两种以上的选择标记基因； ? 缺失mob基因；

? 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 质粒人工构建的策略P39-40

? 加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择； ? 增加或减少合适的酶切位点，便于重组；

? 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量； ? 改变复制子, 变严谨为松弛, 变少拷贝为多拷贝； ? 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。 10. λ和M13噬菌体的性质 λ噬菌体的性质

? 是E.coli的温和型噬菌体。

? λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性dsDNA分子，两端各有12个碱基

(5’-GGGCGGCGACCT-3’)的5’凸出黏性末端是互补的。进入细菌细胞的λDNA通过两端的黏性末端配对形成环状的dsDNA，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点(cohesive end site)。

? 含有60多个基因，整个基因组分为三部分

11. λ噬菌体载体的构建与类型、各种载体承载量的大小。

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噬菌体载体的构建：

? 缩短长度，提高装载量；

? 删除重复的酶切位点，增加一些单一的酶切位点； ? 加装选择标记(免疫功能类标记和颜色反应类标记)； ? 构建琥珀密码子的突变体。 噬菌体载体的类型：P44-45

插入型载体：载体长度37kb，插入片段大小0-14kb（51-37） 置换型载体：载体长度26kb，最小装载长度10kb（36-26），最大装载长度25kb（51-26） 12. 提取和纯化DNA的步骤主要有： ? 细胞裂解和DNA的溶解与保护；

? 去除与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质； ? DNA的沉淀和纯化。

13. 如何检测、评价提取的DNA质量：

(一)紫外分光光度法测定DNA、RNA的浓度和纯度

? DNA或RNA链上碱基的苯环结构在260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收强度不仅与它们

总含量有关，还与它们的分子形状、单双链有关。 ? 可用OD260/OD280值衡量DNA/RNA的纯度

? 纯DNA的OD260/OD280应为1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质

或酚污染；同时OD260/OD230应大于2.0，小于2.0表明溶液中有残存的多糖、盐和小分子杂质等。

? 纯RNA的OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，小于1.7说明有蛋白质或酚的污染，大

于2.0表明有异硫氰酸胍残存；同样OD260/OD230应大于2.0，小于2.0表明有小分子及盐和多糖存在。

? (二)琼脂糖凝胶电泳鉴定 ? (三)核酸的保存

14. DNA电泳的影响因素：

? DNA分子大小：分子越大，泳动越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 ? DNA分子构型：超螺旋环状＞线状＞切口环状。

? 凝胶浓度：浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，浓度高的胶对小分子

DNA呈较好的线性关系。

? 电场强度：强度高，电泳速度快，但分辨率低。 ? 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭(EB)：插入dsDNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。

对超螺旋的DNA分子影响较大。

15. 分子杂交的主要技术的原理、步骤及用途，探针的制备方法 分子杂交的基本原理：

? 具有互补特定核苷酸序列的ssDNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双

链结构。

? 把一段已知基因(DNA或RNA)的核酸序列用合适的标记物予以标记，当作探针(probe)，

与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。

? 再用合适方法把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。 探针制备的方法：

1. 均匀标记：(1)切口平移法标记、(2)随机引物法(6核苷酸引物标记法)、(3) PCR扩增标记

2. 末端标记：5’末端标记法、3’末端标记法、T4聚合酶替代法。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/8dqf.html