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天山雪莲质体果糖1，6-二磷酸醛缩酶家族基因在植物低温光合适应中的生理机制研究

果糖1,6-二磷酸醛缩酶在植物多个碳代谢过程中都起到重要作用。从前期雪莲低温转录组中发现，雪莲叶绿体中存在多达7个FBA基因的转录本，远超已知的其它植物。推测它可能以不同低温特性的混合同工酶形式应对雪莲生境中巨大的日温差变化。为了研究它们在雪莲低温光适应中的功能，本项目通过敲除质体FBA基因的雪莲突变体和过表达雪莲FBA基因的冷敏感植物番茄，采用气体交换技术对比分析它们在光合最适温度的响应。通过对转基因番茄碳同化过程中主要关键酶的活性、中间代谢产物和碳水化合物含量的动态变化检测，关联分析雪莲的FBAasec基因对不同低温下Calvin循环运转效率的影响。通过叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其对不同温度下的光合碳流量的控制效率。最后，通过转基因番茄间的两两互交，检验同工酶之间的协同效应和作用模式。

天山雪莲；果糖1,6-二磷酸醛缩酶；同工酶；低温光适应；生理机制

2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）

2.1 项目的研究目的

为了研究天山雪莲叶绿体定位的果糖1，6-二磷酸醛缩酶家族（sikFBAs）同工酶的多样性在应对高山生境日周期巨大温差变化中的生理机制，本项目通过CRISPR/Cas9技术，创建敲除雪莲叶绿体定位的sikFBAs的雪莲突变体和CaMV 35 S启动子或雪莲自身启动子驱动的sikFBAs基因在冷敏感的番茄中表达。采用气体交换技术比较它们在光合最适温度的响应（shift the optimum temperature of photosynthesis) 。通过检测转基因番茄碳同化过程中起重要调控作用的关键酶的活性、Calvin循环中的中间代谢产物和光合产物淀粉和蔗糖含量的动态变化，关联分析不同低温条件下，单个的雪莲sikFBAase酶对Calvin循环运行效率的影响。通过对叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其在不同温度下的光合碳流量的控制效率。在此基础上，通过转基因番茄的两两互交，检验雪莲sikFBAase同工酶间的协同效应和工作模式。本项目的研究对于揭示天山雪莲低温光合的生理机制和改良冷敏感作物的低温光合性能都具有重要的研究意义。

2.2 项目的研究内容

2.2.1 天山雪莲质体sikFBAs不同基因在低温光适应中表达模式分析

2.2.1.1 在不同温光组合和不同时间处理下，对天山雪莲幼苗叶片sikFBAs基因进行研究，确定sikFBAs不同基因间的表达变化特性。

2.2.1.2 根据sikFBAs基因非保守核酸区段，用双子叶植物的pP1C.1、pP1C.5的 CRISPR/Cas9载体配套载体，构建特异性的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体。

2.2.1.3 利用构建的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体，转化天山雪莲，利用PCR对转基因植株进行靶基因敲除检测，筛选已敲除目的基因的转基因突变植株，进行表型分析。

2.2.2 天山雪莲质体sikFBAs基因启动子的克隆和组织表达分析

2.2.2.1 通过反向PCR技术，克隆sikFBAs家族基因的启动子，利用生物信息学软件分析启动子序列。

2.2.2.2 用克隆的sikFBAs基因的启动子，构建sikFBAs基因启动子驱动GUS报告基因表达的融合植物表达载体。

2.2.2.3 用真空渗透法转化拟南芥，研究不同低温和不同时间处理下，拟南芥转基因株系PsikFBAs-GUS基因的温光响应和时空表达特性。 2.2.3 天山雪莲质位sikFBAs基因亚细胞定位分析和转基因植株的获得 2.2.3.1 构建组成型（CaMV 35S 启动子）驱动sikFBAs-GFP融合植物表达载体，用基因枪轰击洋葱表皮，激光共聚焦观察基因的表达。

2.2.3.1构建组成型（CaMV 35S 启动子）驱动sikFBAs基因植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化法，转化番茄，获得过表达目的基因的转基因植株。

2.2.3.2 用克隆的sikFBAs基因启动子和sikFBAs基因，构建自身启动子驱动的植物表达载体，根癌农杆菌介导转化番茄，获得可表达目标基因的转基因植株。 2.2.4 天山雪莲msikFBAs突变体蛋白质表达检测和最适低温光合温度的变化分析

2.2.4.1 根据sikFBAs蛋白氨基酸序列的可变区，寻找具有抗原表位的短肽，用于多肽抗体的制备并测定效价。构建sikFBAs基因的表达载体，制备并纯化

sikFBAs蛋白，利用Western blot检测免疫蛋白的特异性。

2.2.4.2 对获得不同msikFBAs敲除的雪莲突变体和正常雪莲，用不同温度和光照进行处理，提取蛋白进行表达量Western blot分析，确定不同的sikFBAase含量变化，同时对不同温度sikFBAase的总体酶活和总体比活性进行测定。

2.2.4.3 通过对正常雪莲和突变体雪莲气体交换参数的测定，研究光合指标与温度、光照因子的相关性，确定最适低温光合温度变化与酶活性变化间的协同性。

2.2.5 不同表达模式的转sikFBAs基因番茄在不同温光处理的表达分析

2.2.5.1在长期温度培养不同光照处理下，对组成型和诱导型表达sikFBAs基因的转基因番功茄叶片进行在转录水平和蛋白水平进行表达检测，分析基因和蛋白质的表达变化。

2.2.5.2 在长期温度培养不同光照处理下，对转基因番茄叶片表达sikFBAs基因的植株的酶活性和比活性进行分析，确定sikFBAs基因的转录、蛋白含量与酶活性变化的一致性分析。

2.2.5.3 测定转基因番茄叶片在不同温度气体交换参数、光合参数和叶绿素荧光参数，确定转基因番茄低温光合响应，分析最适温度变化与sikFBAs关联性。 2.2.6 转sikFBAs基因番茄对主要碳同化酶活性、代谢中间产物和光合产物积累的影响

2.2.6.1 通过不同温光处理，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄的Rubisco、Rubisco活化酶，SBPase， FBPase，TKLase以及蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性和比活性。

2.2.6.2 通过不同温光处理，采用HLPC，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄的Glc6P， Fru6P，Glc1P，3PGA，ATP，NDAPH和Pi含量。

2.2.6.2 利用C3植物的光合数学模型，对不同光温下的转基因番茄碳流量控制系数进行估算，并对单个sikFBAase贡献率进行综合分析。 2.2.7 sikFBAs间的协同作用分析和杂交基因番茄低温生长性能评价

2.2.7.1 通过不同温光处理，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄营养和生

殖生长特性、生长动态及生长节律，研究不同构建的转基因番茄的生物产量并对

其进行评价。

2.2.7.2 利用不同构建的转sikFBAs基因的番茄，通过不同低温处理，对抗寒生理指标进行测定，关联分析光吸收、光合电子传递、碳同化间的能量分配，分析其与抗寒性的关系。

2.2.7.3 利用获得具有抗寒功能的转基因番茄，进行两两互交，对sikFBAs基因间的协同作用效果进行综合评价，并在自然低温条件下进行低温光合的适应性分析。

3. 拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

3.1 研究方法

3.1.1 天山雪莲幼苗质体sikFBA基因低温表达模式分析

3.1.1.1 利用本实验室组织培养的新疆雪莲试管苗，生根移载至光照培养箱。以莲座叶伸展至5叶期（下同）的雪莲幼苗为对照，按20℃、15℃、10℃、5℃的顺序进行长期培养，每次处理0,2h, 6h 12h,18h,24h。不同温度处理下，测定天山雪莲幼苗的生长量。

采用大连宝生生物公司的植物RNA提取试剂盒提取各处理幼苗的总RNA。以新疆雪莲―管家‖基因GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）为内参、采用实时定量PCR技术对sikFBAs基因进行表达分析。

3.1.1.2 植物CRISPR/Cas9敲除载体的构建

用双子叶植物的pP1C.1、pP1C.5 CRISPR/Cas9载体配套载体（Genloci公司购置），根据定位于质体的天山雪莲sikFBAs家族基因，通过Blast核酸序列比对，选择非保守区设计一对20bp左右的oligo DNA引物，引物设计通过在线设计：ttp://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR。引物送华大基因公司合成，纯化级别为PAGE。使用Bbs I酶切pP1C.5（氨苄霉素抗性）载体，回收大片的片段；将正负链oligos（100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.5载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。 使用EcoRI、XbaI双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收目标片段；目标片

段与酶切纯化后的pP1C.1进行T4 DNA连接酶，连接，转化大肠杆菌， 得到重组载体pP1C.1。构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体，经测序验证。 3.1.1.3 天山雪莲突变体植株的获得

构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体，转化农杆菌 GV3101，叶盘法介导雪莲转化，经抗生素筛选获得再生植株，进行标记基因的PCR阳性筛选，同时检测目标基因是否敲除，获得有效的雪莲突变体植株，经组培扩繁，持续提供试验用苗。形成转基因株系在人工可控的人工培养箱内光周期12/12h生长，培养至5叶期，用于后续实验。（雪莲的转化参照本实验室方法，管岩岩，等.2010） 3.1.2 天山雪莲质体sikFBAs基因启动子的克隆和组织表达分析

3.1.2.1 根据天山雪莲sikFBAs基因序列，利用primer premier 5.0引物设计软件，在基因的近5’端设计2条反向引物，通过大连宝生物公司的Genome Walking kit克隆sikFBAs基因的启动子。利用基因启动子序列在线分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter)、(http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq -tools/promoter.pl)和(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/ proscan)，对启动子序列和可能结合的转录因子的基序位点进行分析。

针对启动子生物信息学分析结果，利用pBI211和pBI121质粒构建带有GUS基因的植物表达载体。转化根癌农杆菌GV3101，参照（Bechtold N，et al.1993.， Clough SJ and Bent AF，1998）方法，利用拟南芥真空渗透法转化拟南芥（Col-0），在温度和光照可控的植物生长室培育植株至结实，收获成熟种子。

参照王关林和方宏筠(1998)年的方法进行组织化学定位染色。根据拟南芥不同的发育时期（营养生长期与生殖生长期），在GUS表达活性最高的温度处理下，利用低温冷冻制片机，制备根、茎、叶、花、果实组织切片，用X-Gluc染色固定法，借助光学显微镜观察组织染色情况。

3.1.3天山雪莲质位sikFBAs基因亚细胞定位分析和转基因植株的获得 3.1.3.1 按照pAT7-EGFP植物表达的中间载体克隆位点（ 美国Arizona大学朱建康教授惠赠），根据天山雪莲sikFBAs基因序列，将其融合到pAT7-EGFP载体的EGFP的5’ 端，构建融合表达载体。然后将植物表达框构建到植物表达载体pCAMBIA 2300上，用于转化农杆菌GV3101。用基因枪轰击洋葱表皮，用

激光扫描共聚焦显微镜(LSM 5 PASCAL)观察叶肉原生体细胞中EGFP的表达，观察物镜放大倍数为40倍，激发光波长为488 nm，带通BP 505-530 nm，长通LP 560 nm。确定EGFP是否是叶绿体定位。

3.1.3.2 在已构建的含有sikFBAs基因启动子的pBI121植物表达载体上，用酶切出GUS，用对应的sikFBAs基因替代，构建自身启动子驱的的植物表达载体，农杆菌介导番茄的转化，转基因再生苗，经PCR筛选阳性植株，获得可表达目标基因的转基因植株，用于后续实验。同样原方法，构建组成型（CaMV 35 S启动子）驱动sikFBAs基因表达的植物表达载体，并获得转基因番茄植株，组培快繁扩大株系，用于后续实验（下同）。

3.1.4 天山雪莲msikFBAs突变体蛋白质表达检测和最适低温光合温度的变化分析

3.1.4.1 根据sikFBAs蛋白氨基酸序列的可变区，寻找具有抗原表位的短肽，送百奇生物（ABGENT）公司合成15个左右的多肽，与蛋白偶联，免疫新西兰白兔，制备抗血清并测定效价。利用Western Blot检测目标蛋白的特异性。按照 Bradford（1976）的方法进行蛋白质定量分析。Western Blot按照标准方法操作（Sambrook 等，1989）。膜蛋白在 12%分离胶的 SDS-PAGE 分离，电转蛋白至硝酸纤维素膜，丽春红染色检验转膜效果。在5％的脱脂奶粉中封闭至少1 h，与sikFBAs1;5和sikFBAs2;7的抗血清（1 : 500）杂交2 h，然后与碱性磷酸酶交联的羊抗兔二抗（华美生物工程公司）（1 :1000）杂交1h，用 BCIP/NBT底物显色。

3.1.4.2 对获得不同msikFBAs敲除的雪莲突变体和正常雪莲，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下进行处理，提取蛋白进行表达量WB分析，确定不同的sikFBAase含量变化，同时对不同温度sikFBAase的总体酶活和总体比活性进行测定。

3.1.4.3 根据下面Gas-Exchange Measurements测定和分析方法，对雪莲和突变体的雪莲气体交换参数的测定，研究光合指标与温度、光照因子的相关性，确定最适低温光合温度变化与sikFBAase活性变化间的协同性。

3.1.5 不同表达模式的转sikFBAs基因番茄在不同光温处理的表达分析 3.1.5.1 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，对组成型和诱导型表达sikFBAs基因的转基因番茄叶片，提取总RNA，利用实时定量的方法进行表达分析。提取叶片的叶绿体蛋白，利用制备的特性抗体，采用Western Blot技术和ELISA技术，对目标蛋白水平进行表达检测。

3.1.5.2 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，提取叶片叶绿素和蛋白质，参照下面FBAase酶活的测定方法。确定sikFBAs基因的转录、蛋白含量。分析该基因在转录水平上是否与蛋白含量和酶活性变化相一致。

3.1.5.3 按照下面光合参数测定方法，测定转基因番茄叶片的不同温度气体交换参数、光合参数和叶绿素荧光参数，确定转基因番茄低温光合响应的模式，建立净光合速率光响应、CO2、室温响应曲线，SPSS软件进行三维拟合数据，分析最适温度变化与sikFBAase酶比活性的关联性。

3.1.6 转sikFBAs基因番茄对主要碳同化 酶活性、代谢中间产物和光合产物积累的影响

3.1.6.1 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，提取叶片叶绿素，提取蛋白，采用下面酶活测定方法测定Rubisco、Rubisco活化酶，SBPase， FBPase，TKLase以及蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性和比活性测定。

3.1.6.2对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，采用下面HLPC测定方法进行中间产物的Glc6P, Fru6P, Glc1P，3PGA，ATP，NDAPH和Pi含量的测定。 3.1.6.3利用C3植物的光合数学模型(参考 Medlyn 等.2002a.2002b和 Bernacchi 等.2003)，对不同温度下的转基因番茄碳流量控制系数进行估算(参照Volker ，2002）并对单个sikFBAase碳流量的控制系数。

3.1.7 天山雪莲sikFBAs基因协同作用分析和杂交番茄的低温生长性能评价 3.1.7.1在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下，对表达不同sikFBAs基因的转基因番茄在不同发育时期的株高，叶数、叶

长、叶宽、鲜重及干重比、根茎比、生长速率等进行测定，分析sikFBAs对番茄生长特性的影响。

3.1.7.2 在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下，测定转基因番茄的相对电导率、丙二醛和脯氨酸(参照下面生理指标测定）、，测定绿素荧光参数、光合响应参数和气体交换参数（参照下光合参数测定方法），关联分析光吸收、光合电子传递、碳同化间能量分配(参照康华靖，等 2011），分析逆境下碳同化能提高与抗寒性的关系。

3.1.7.3 将获得具有抗寒作用转基因番茄，筛选抗寒性转基因株系进行两两互交，对T1代进行协同作用分析，并在冷凉的自然低温条件下进行低温光合的田间适应性分析。

3.1.8 叶片光合相光参数测定（气体交换-P700-叶绿素荧光同步测量系统（德国）带有Dual-PAM气体交换叶室——3010-DUAL）

3.1.8.1 光响应曲线的测定（Pn-PAR）

按照设定的2 000,1 800,1 600,1 400,1 000, 800, 600, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 0 μmol·m-2·s-1光照梯度序列，测定新疆雪莲叶片净光合速率的大小，自动完成（Pn-PAR）光响应曲线。测定设置3次重复，依据方程(4)计算最大净光合速率(Pmax)，并确定其光补偿点(LCP)和光饱和点(LSP)(Bassmanet al.,1991)：Pn=Pmax(1- C0e?PPFD/Pmax ), (4)式中：?为弱光下光化学量子效率， C0为度量弱光下净光合速率趋于0的指标，通过适合性检验,拟和效果良好。测定时的空气温度，空气中CO2，相对湿度,根据测定气孔导度(Gs,mol·m-2·s-1) ，叶温下蒸汽压亏缺(Vpdl)等光合生理特性指标。根据参数计算气孔限制值Ls和水分利用效率WUE，叶片的光能利用率(PE)(Berryet al.,1982)，其公式分别为:Ls= 1-(Ci/Ca)、WUE=Pn /Tr。表观量子效率AQY＝dPn/dPFD。200,100,50,20,10,0Lμmol·m-2·s-1光照梯度下的净光合速率值,进行回归所得曲线的初始斜率为表观光量子效率(AQY)。与净光合速率所在的轴相交的截距为暗呼吸速率(Rd)。 3.1.8.2 CO2响应曲线（A-Ci）

将由光曲线所确定的光饱和点作为最适光照强度,利用CO2注入系统,按照设定的400, 300, 200, 100, 50, 0, 400, 400, 600, 800, 1 000, 1 200, 1 400, 1 800, 2 000 μL.L?1的CO2浓度梯度序列,测定天山雪莲叶片净光合速率的大小，自动完成A-Ci

曲线。确定CO2补偿点(CCP)和CO2饱和点(CSP)。在CO2浓度低于200Lmol·mol-1以下时测定的净光合速率值,进行回归后所得直线方程的斜率为羧化效率(CE)。与净光合速率所在的轴相交的截距为光呼吸速率(Rp)。 3.1.8.3 叶绿素荧光参数

同步测定叶素素荧光参数。 PS II参数：Fo, Fm, F, Fm’, Fv/Fm, Y(II)=△F/Fm’, Fo’, qP, qL, qN, NPQ, Y(NPQ), Y(NO)和ETR(II)等。PS I参数：P700, Pm, Pm’, P700red, Y(I), Y(ND), Y(NA)和ETR(I)等各参数意义及计算公式如下：光化学猝灭系数qP =(Fm’- Fs)/( Fm’-F0’) (van Kooten 和Snel 1990)；PS Ⅱ反应中心光能捕获效率Fv’/Fm’ =( Fm’- F0’) / Fm’(Demmig-Adams 和Adams 1996)； 实际光化学效率ΦPS Ⅱ = qP×(Fv’/Fm’) =(Fm’-Fs)/ Fm’(Genty 等1989)。有效荧光产量（△ Fv’/Fm’）=（Fm’-Ft）/ Fm；非光化学荧光淬灭系数（NPQ）=（Fm-Fm’）/ Fm’；电子传递速率(ETR)ETR=Fm’-Fs/Fm’×光合光子通量密度PPFD ×0.5×a,a为叶片光吸系数( Miyake C，et al.,2000)。各符号的意义如下：Fo’为光适应后的初始荧光；Fm’为光适应后的最大荧光；Fv’为光适应后的最大可变荧光；Fs 为光适应后稳态荧光。

3.1.8.4气体交换参数（Gas-Exchange Measurements）

参比室和样品室的CO2绝对值（CO2abs，CO2sam），参比室和样品室的H2O绝对值（H2Oabs，H2Osam），流速（gas flow），环境气压（Pamb），叶室温度（Tcuv），叶片温度（Tleaf），环境温度（Tamb），环境PAR（PARamb），叶室内叶片正面PAR（PARtop），叶室内叶片背面PAR（PARbot），叶室相对湿度（rH），蒸腾速率（E），水气压饱和亏（VPD），叶片气孔导度（GH2O），净光合速率（A），胞间CO2浓度（Ci），环境CO2浓度（Ca），植物水分利用效率，CO2响应曲线，光响应曲线等。

光合速率的温度响应曲线（A-Ta）与温度相关的暗呼吸速率（ Rd） 和光合速率（ A ）在光密度 1,500 μmol m?2 s?1 条件下，在20℃ 、15℃、10℃到5℃范围内，对的新的雪莲完全展开叶，参照(Yamori et al., 2005). 蒸气压亏缺小于 1.0 kPa 在10℃ 到30℃ ，光合速率和呼吸速率的温度响应曲线。在各温度点测定CO2响应曲线（50, 100, 150, 200, 360, and 1,500μL L?1 ）。利用统计软件（SPSS）对立方曲线光合参数进行数据拟合，计算光合最适温度（optimum temperature）。 3.1.8.5环境因子的相关性分析

气体交换指标与环境因子的相关性分析，天山雪莲净光合速率与叶温和大气温度的关系,定量分析温度对Pn的影响。同时，分别以Pn,Tr,Gs为因变量，用SPSS 13分析其与环境因子PAR,Ta,Tl, Ca和空气相对湿度(RH,%)等为自变量的各因子间的相关性；以及与Pn相关的各气体交换指标间的相关性。 3.1.9 抗性相关生理指标

3.1.9.1 相对电导率、丙二醛和脯氨酸的测定

按照赵世杰（1998）的方法，使用电导仪测定叶片电导率。其中相对电导率（%）=（初电导-空白）×100/（终电导-空白）；伤害度=（处理相对电导率-空白相对电导率）/（100-空白相对电导率）。参考赵世杰等（1994）的方法进行丙二醛（MDA）含量的测定。酸性茚三酮比色法测定脯氨酸含量(Bates等,1973)。

3.1.9.2 可溶性糖和叶片淀粉的测定（蒽酮比色法）

约100 mg鲜重的叶片提取用1 ml 80%乙醇在80 ℃浸提30 min，然后用1 ml 50%乙醇在 90 ℃ 浸提 30min，再用 1 ml H2O 在 95℃ 浸提30 min，合并后的上清用于葡萄糖，果糖和蔗糖H测定，方法参照（Stitt et al. (1989)。

叶片淀粉的测定方法参照(Smith and Zeeman, 2006)。

用酒精提取可溶性糖，反复提取直至提取液中无明显可检出可溶性糖，取提取后的残渣0.5g，放入三角烧瓶中，加2%HCl 25mL，盖上，在沸水浴锅中沸腾3.5h，用碱中和至中性过滤,测定其葡萄糖含量。 3.1.10 中间代谢物定量分析（Uematsu.2012）

3.1.10.1 叶片光照12 h后取样，处理后，立即被放入液氮速冻，–80℃储存，直到使用。光合碳同化的中间产物的定量制备方法采用 (Hasunuma et al.,2010) 和分析采用LC-MS/MS。所有分析都使用4000 QTRAP LC-MS/MS system (AB SCIEX, Tokyo, Japan) 设备，带高性能的 HPLC系统 (Shimadzu, Kyoto, Japan) 和涡轮增压的离子源 (AB SCIEX)。分离采用反向离子对液相色谱，其液相色谱柱(5 lm, 150 mm34.6 mm, Shimadzu)。数据的获得和分析使用机带软件。 3.1.10.2 ATP含量的测定：采用生物发光法测定ATP含量。用丙酮浸提样本，以荧光素酶-2荧光素为发光试剂，用FG2300 发光光度计测定ATP含量（樊广华等，2005）

3.1.10.3 无机磷（Pi)测定：采用钒钼黄比色法（参照姚祖江，2010），待测液中的正磷酸与偏钒酸和钼酸能生成黄色的三元杂多酸，溶液黄色的深浅与磷酸含量成正比，生成物在440nm波长有吸收峰，故此可用比色法测定无机磷的含量。此法的优点是黄色稳定，对显色条件要求不十分严格，操作简便，干扰物少，灵敏度较低，作用范围随选用的吸收波长而异。 3.1.11 可溶性蛋白的测定和酶活的测定

3.1.11.1 叶绿体的制备

准备好试样，去除叶柄和中脉，同时用剪刀剪碎，准确称取4.17g，置于事先用液氮处理过的研钵，加入10ml预冷的STN缓冲液，迅速研磨或捣碎，使之成为匀浆，以四层纱布过滤去粗渣，滤液于低温（0～2℃）下，1500×g离心约5min。去除上清液，加入少许（0.3ml）STN（pH7.8）于沉淀中配成叶绿体悬浮液，待用。

3.1.11.2 可溶性蛋白的测定

按Bradford法进行测定：由300 μL已知浓度的BSA溶液与3mL考马司亮蓝G-250染液混匀，测吸光度 A595，从而绘制样品蛋白浓度与 A595值之间的标准曲线，并由此得到一个线性方程。取适量蛋白粗提液（上清液）稀释到 300 μL 与 3 mL 考马司亮蓝 G-250 染液反应后测得的A595值代入线性方程，即可计算出样品中可溶性蛋白的含量。

3.1.11.3 光合相关酶活性的测定 (1) FBAase酶活和比活性的测定：

在测酶活反应体系中加入已知浓度的果糖 1,6-二磷酸，5-25℃温育 1 分钟立即加入 875 μL 30%盐酸和 125 μL 的间苯二酚-硫脲试剂使终体积为 1.25 mL，80℃保温10 min，自然冷却至室温，测定 A520，绘制标准曲线。在测酶活反应体系中加入 上清液（反应起始），5-25℃温育， 1min立即终止反应，以零时反应（未反应就加盐酸终止反应）的反应体系作空白。测 A520的值。根据果糖 1,6-二磷酸的标准曲线计算出每分钟生成的 FBP 量，即为酶活性。FBA 酶的比活力：一定体积样品中的 FBA 总酶活性与可溶性蛋白总量、酶促反应时间相除，即 FBA 酶的比活力。

(2) SBPase 活性的测定（参考 Harrison 等，1998）的方法）：

取 0.1 g 叶片液氮研磨，加提取液，取 20 μL 上清液，加入80 μL 反应液 [2 mM SBP]，25 ℃反应5 min。加 50 μL 1.0 M 的高氯酸终止反应， 4 ℃ 离心取上清液 50μL加入 钼酸铵溶液， 25 ℃下反应10 min。再加入150 μL 孔雀绿溶液，25 ℃下显色30 min。620 nm比色，以 μmol·g -1 FW·s-1表示酶活性。

(3) Rubisco活性的和Rubisco活化酶活性测定：

Rubisco含量测定: 采用Yamori et al. (2005)方法。测定气体交换后，叶片被冰冻并贮存在?80 ℃，用于生化分析。冰冻叶片用液氮处理后，均质化后用提取液包括100 mM 磷酸缓冲液（PH 7.0）， 1.0% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮，0.1% (v/v) Triton X-100，1 mM 苯甲基磺酰化氟和1.0% β-巯基乙醇提取。采有Elisa方法测定Rubisco含量。鲜叶中Rubisco含量/mg·g-1由标准曲线计算的Rubisco浓度×稀释倍数/叶片鲜重。Rubisco活性测定采用C14标记法测定(李立人等，1986)。

(4) Rubisco活化酶活性测定：

FBPase( EC 3. 1. 3. 11) 酶活性测定:采用紫外分光光度计法。参照李合生(2000)，取40 μL 酶提取液加入 752 μL 预保温 30 ℃ 的反应液中，反应液组成为: 30 mmol·L-1酸钾( Hepes-KOH) 缓冲液( pH 8. 2) 、5 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1DTT、0. 5 mmol.L-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADP) 、2 U·mL－1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( G6PD) ( EC 1. 1. 1. 49) 和 2 U·mL－1磷酸葡萄糖异构酶( PGI) ( EC 5. 3. 1. 9) ; 加入 8 μL 300mmol·L－1果糖-6-磷酸( FBP) 启动反应． 用 UV-2450紫外分光光度计测定 340 nm 下 1 min 内吸光度值的变化，以此来计算 FBPase 的活性．(参照 Rao 和 Terry,1989) (5) TKL酶的测定：

根据Zrenner et al.（1993）; 100mMHEPES -KOH ，pH7.7 ， 12mM MgCl2， 200 μM硫胺素焦磷酸 ，0.8 mM木酮糖-5-磷酸， 0.8 mM赤藓糖-4-磷酸， 150 μM NADH，5U磷酸丙糖异构酶，2U甘油-3-磷酸脱氢酶，UGP酶。

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3. 拟解决的关键问题

确定一个酶活最佳的反应温度，最好的办法是直接提取和纯化这个酶，在体外通过不同影响因子研究其最好的酶催化反应条件。但是，从已有的文献分析，到目前为止，通过原核表达提取的酶几乎都没有活性，原因可能是定位于叶绿体的FBAase基因以同源四聚体的方式行使催化功能，对环境还是比较敏感的。 我们采用的策略是通过转基因方式来增强该基因表达或抑制该基因功能来间接评价它的酶学温度响应的动力学特性。生长于温带和寒带的许多植物，都有一种能够随着环境温度的变化，调节他们的最适光合能力，以提高光合生产效率。我们推测雪莲众多的FBAase同工酶在此可能起到重要作用。因为，预先存在不同温度适应的同工酶群体，能够在很宽的温度范围内发挥作用。如果敲除一个同工酶的基因，可能在某个温区会影响整个碳同化的整体运转。相反，如果将某个基因转化到冷敏感的植物中，就有可能增强在某个温区的光合效率。

因此，我们通过CRISPR/Cas9技术，敲除雪莲FBAase同工酶的其中一个基因，再通过不同温度处理，通过光合参数的测定，能够发现由于基因的缺陷而使雪莲在光合适应方面存在的温度敏感区。然后，再在这个温区内，通过过表达强启动子增加该基因的表达，就有可能在这个温区内增强番茄的光合能力。因为，

冷敏感植物缺乏这种光合温度的调节能力。那么，可以肯定这个温区就是这个同工酶温度适应区。

通过这种研究方法，我们就可以对所有定位于叶绿体的FBAase同工酶进行温度的敏感性分析，确定每个同工酶温度适应的有效范围，然后再通过转基因番茄互交，确定它们的协作模式，揭示它们工作的生理机制。 4. 可行性分析

植物在长期的适应性进化中，已经演化出许多抗逆的生理生化机制，以抵御不利的环境影响。起源于温带或寒冷地带的植物通常具有冷驯化和冻驯化的能力，来增强植物对低温的抗性。其中，耐冷性的植物能够调节最适光合温度，来提高它们的光合效率。对于光合系统而言，碳同化的过程受温度的影响最大，因为，低温对酶的活性影响最为直接。大多数植物可能通过增加酶的表达量，以弥补酶活的损失。但是，还有另一种方式，表达一种新的同工酶，以弥补低温对酶活性的影响。同工酶在植物中普遍存在，这种多样性的存在，能够增加生命系统的稳定性，增强植物对环境的适应能力。高海拔地区日温差的变化较大，这就需要很强的光合调节能力以适应温度的变化。采用同工酶多样性的形式，应该是一种很有效的调节方式。

果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物的碳同化、糖酵解、糖的异生等许多代谢过程中起重要作用。已有的研究已经证明，果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物的抗逆中也能发挥重要作用。我们认为，这与FBAase能够调节碳的流向有关。因为它的反应底物磷酸丙糖能够在细胞质和叶绿体内相互转运，直接联系卡尔文循环与糖酵解两个重要生化代谢过程。当RuBP再生受限时，可临时调节胞质中的磷酸丙糖，用于RuBP的再生，起到调节库的作用。已有的研究已经证明，它在很多的情况下，FBAase能够在碳流量的控制中起重要作用，尤其是在光合系统RuBP的再生受到限制时。转基因的研究也已经证明，当环境CO2提高时，它能极大的促进植物的生长。

因此，保证果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物中的正常功能，对于植物的生存非常重要。新疆雪莲是在高山环境中生长比较快的植物，它的分布区从海拔2400-3500m范围内都有分布，也与它的这种光合适应特性有关。新疆雪莲采用这种增加果糖1，6-二磷酸醛缩酶同工酶方式，对它的光合温度的适应性是有利

的。

天山雪莲要保持这种光合温度适应能力，就需要保证碳同化过程的碳流量的正常运转。目前，基因操纵已成为生理学家用来研究特定生物学过程中的代谢物或代谢途径的有力工具。这些通过反义植物技术，降低酶表达的响应可以揭示这个酶被除去多少能够影响代谢流量，从而能够估测流量控制系数。因而，我们可以采用敲除雪莲同工酶的方法和在冷敏感植物过表达雪莲同工酶的方法阻断或加强这个碳流量过程。然后，通过建立光合速率-温度响应曲线，在短时间内，通过分析温度响应曲线的波动，长时间内可用植物的最适光合温度适应性变化来评估这个同工酶在控制光合碳流量中作用。采用这个方法，我们可以对全部的同工酶进行分析，从而可以揭示雪莲质体定位的同工酶在雪莲低温光适应中生理机制。这种转基因技术在我们实验室已经很成熟，已有多年的技术积累，雪莲和番茄的转化体系已经很完备。

因此，本项目从理论上和技术上都是可行的。

的。

天山雪莲要保持这种光合温度适应能力，就需要保证碳同化过程的碳流量的正常运转。目前，基因操纵已成为生理学家用来研究特定生物学过程中的代谢物或代谢途径的有力工具。这些通过反义植物技术，降低酶表达的响应可以揭示这个酶被除去多少能够影响代谢流量，从而能够估测流量控制系数。因而，我们可以采用敲除雪莲同工酶的方法和在冷敏感植物过表达雪莲同工酶的方法阻断或加强这个碳流量过程。然后，通过建立光合速率-温度响应曲线，在短时间内，通过分析温度响应曲线的波动，长时间内可用植物的最适光合温度适应性变化来评估这个同工酶在控制光合碳流量中作用。采用这个方法，我们可以对全部的同工酶进行分析，从而可以揭示雪莲质体定位的同工酶在雪莲低温光适应中生理机制。这种转基因技术在我们实验室已经很成熟，已有多年的技术积累，雪莲和番茄的转化体系已经很完备。

因此，本项目从理论上和技术上都是可行的。

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