微生物学实验

微生物学实验

实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查 实验二 油镜的使用和细菌的简单染色 实验三 细菌的革兰氏染色和芽孢染色

实验四 微生物大小的测定和酵母菌死活细胞的鉴定 实验五 培养基的配制与消毒灭菌 实验六 土壤微生物的分离纯化与鉴定 实验七 食品微生物检验 (一)细菌总数测定 实验八 食品微生物检验 （二）大肠菌群数测定 实验九 大肠杆菌生长曲线的测定 实验十 IMViC与硫化氢试验

实验一、实验室环境和人体表微生物的检查

1. 一、目的：

1. 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量与类型； 2. 观察不同类型微生物的菌落形态特征； 3. 体会无菌操作的重要性。

2. 二、原理：

1. 微生物无孔不入，无处不在。

2. 微生物→营养琼脂平板→菌落或菌苔。（37 ℃倒置培养24 h） 3. 描述：菌落的大小、表面光滑或粗糙、干燥或湿润、隆起或扁平、

边缘整齐或锯齿状、菌落透明或不透明、颜色以及质地均匀与否、疏松或紧密等，以便检查环境中细菌的类?秃褪俊?

4. 细胞、放线菌、酵母菌和霉菌四大类型都可能存在，本实验重点观

察细菌。

3. 三、器材：

1. 培养基：营养琼脂平板（牛肉膏蛋白胨培养基）

2. 器具：无菌水、灭菌棉签、接种环（针）、酒精灯等。

4. 四、步骤：

1. 标记。组号/姓名、日期、样品来源。 2. 接种。

3. 倒置培养，37℃ 24 h 4. 观察结果。

5. 五、结果

6.

样品来菌落数 菌落特征描写 源 类型

本实验 室（流动空气30 min）

1 2 3

大小

形态

干湿

扁/隆 透明度 颜色

边缘

接种室 （不流动空气 30 min） 洗手前 洗手后 头发屑

指甲垢

实验台

门把

1. 六、思考题：

1. 人多的实验室与少人走动的实验室比较，平板上的菌落数和菌落类

型有区别吗？试解释。 2. 通过本实验，在防止培养物的污染和防止细菌的扩散方面，你有何

体会？ 3. 4.

实验二 油镜的使用和细菌的简单染色 一、实验目的

1、学习和掌握油镜的原理和使用技术。

2、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

二、实验原理

1．油镜使用原理：光镜的几种物镜中以油镜的放大倍数最大，尤其适用于微生物学研究。 2．由于油镜在使用时利用了与玻璃的拆射率相近的镜油作为载玻片与镜头之间的介质，因此，提高了油镜头的分辨力和增加了照明度。 3．细菌单染法：

常用碱性染料进行单染。因为在中性、碱性或弱酸性溶液中细菌细胞常带负电荷，而碱性染料在电离时其分子的染色部分带正电荷，很容易与细菌结合使细菌着色。 常用的单染染料：美蓝、结晶紫、碱性复红。

如果细菌分解糖类产酸，pH降低，细菌带正电荷，则可与伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 三、仪器、材料

菌种：枯草杆菌（培养时间、温度的要求，避免出芽孢） 染料：草酸铵结晶紫、石炭酸复红、美蓝、番红 四、步骤

（一）油镜的使用方法。

1、先用低倍镜和高倍镜找到最适宜的观察目标。 2、上升镜筒（约2cm），滴加镜油。

3、从侧面注视，将镜筒慢慢下降，使油镜头浸在镜油中，直至油圈不再扩大为止。（注意：勿使油镜头与载玻片接触！）

4、从目镜观察，上升镜筒调焦（注意：此时只准向上而不能向下转动粗聚焦器！）直至视野出现清晰物像。

5、观察完毕，须将镜筒上升，才能取下玻片，并将镜头上的油用擦镜纸擦去，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。 6、收镜。

观察顺序：低倍镜→高倍镜→油镜。初学者不能省缺高倍镜这步。根据同焦现象，在低倍下已清晰聚焦后转到高倍观察时，只移动物镜转换器，不上下移动镜筒，因为同焦现象将基本保持准焦状态，保证了使用高倍镜和油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，避免使用粗调节器可能带来的误操作。 （二）细菌的简单染色

涂片（接种环、生理盐水一滴、涂片，要求载片无油污、取菌不宜多、涂片要均匀、不宜厚。） ↓

干燥（风干、可用点吹风的冷风） ↓

固定（热固定的温度不宜过高，只2－3下过火） ↓

染色（染料刚好覆盖涂片薄膜为宜） ↓

水洗（不宜直接水冲涂面，应使细细流水从一端流下，不宜过急过大） ↓

干燥（风干、自然干、吸干） ↓

镜检（涂片要完全干燥下才能油镜观察） 五、绘图：

绘出油镜下观察到的枯草芽孢杆菌的形态图。 六、思考题：

1. 用油镜观察时应注意哪些问题？用何镜油？起?裁醋饔茫? 2. 物镜的同焦现象在显微镜观察中有何意义？

3. 涂片未经热固定会出现什么问题？若温度过高时间过长情况又怎么样？

4.

实验三 革兰氏染色和芽孢染色 一、实验目的

1、初步掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。 2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。 3、巩固微生物无菌操作、涂片和染色的基本技术。 二、实验原理

1．革兰氏染色原理：看实验指导书。

2．芽孢染色法：用着色力强的染料（石炭酸复红、孔雀绿等）加热条件下染色，染料进入菌体并进入芽孢内，水洗使菌体的着色褪去而芽孢不退色。再用复染剂复染时，菌体和芽孢囊染成复染剂的颜色，而芽孢仍保留初染的颜色，从而使芽孢和菌体分开。 三、仪器、材料 油镜

菌种：大肠杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌等。 染料：革兰氏染色液：结晶紫、碘液、95％乙醇、番红 芽孢染液：7.6％孔雀绿 废报纸垫台

四、步骤

（一）细菌的革兰氏染色法。 1、涂片、干燥、固定。 2、染色。

①草酸铵结晶紫1—2滴，初染1分钟、水洗。 ②路哥氏碘液1—2滴、媒染1分钟，水洗。 ③95%酒精脱色，约半分钟，水洗。 ④番红染色液1—2滴，复染1分钟，水洗。 3、干燥。 4、镜检。

（二）细菌的芽孢染色。 制片（涂片、干燥、热固定） ↓

染色（7.6％孔雀绿水溶液、加热至出现蒸汽，保持4－5 min,冷却后水冲至不再褪色为止。番红复染。 ↓

镜检。（油镜下芽孢绿色，菌体红色。）

五、绘图：

1．绘出在油镜下观察到的大肠杆菌、葡萄球菌形态图，并注明它们各染成何色？是革兰氏阴性菌？还是革兰氏阳性菌？ 2．绘出带芽孢的枯草杆菌形态图。 六、思考题：

1. 革兰氏染色影响其成败的关键一步是哪一步？

2. 为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及其营养体能染成不同颜色？

3. 4.

实验四 微生物大小的测定和酵母菌死活细胞鉴定 一、实验目的

1、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2、学习区分酵母的死活细胞的方法。 二、实验原理

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