使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的

更新时间:2023-03-29 13:51:01 阅读量: 建筑文档 文档下载

说明:文章内容仅供预览,部分内容可能不全。下载后的文档,内容与下面显示的完全一致。下载之前请确认下面内容是否您想要的,是否完整无缺。

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的区别

Frank 20120715

miRNA是一类大小约为22个碱基的小RNA分子。它们在转录后阶段对基因表达进行调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA互补序列结合,抑制蛋白质的 翻译或降低mRNA的稳

定性,从而抑制靶基因的表达。科研人员已逐步认识到miRNA在细胞的发育,分化,生长等生命活动中起着非常重要的调控作用,因此越来越多的科研人员把目光聚焦到这一领域,并期待能一窥miRNA的科学奥妙。

成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从几百到几千个碱基不等,带有5‘帽子和3’polyA尾巴,以及1到数个发夹径环结构。Pri-miRNA经剪切产生约70个碱基的miRNA前体,即pre-miRNA。 pre-miRNA为单一发夹结构,5‘带有磷酸基团,3’有两个突出碱基,并带有3’

羟基。pre-miRNA经进一步剪切,形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。

由于当前市场上的miRNA产品类型有诸多不同,因此对于初入此领域的科研人员来说,选择哪种形式的miRNA进行科研试验往往成为困惑。除了构建miRNA表达载体外,市场上人工合成的miRNA产品主要有siRNA, miRNA mimic,pre-miRNA等几种设计类型,实际上不同的类型各有优缺点,科研人员应该根据试验的不同要求来进行选择,从而得到最想要得到的结果。

一般来说,采用miRNA表达载体能获得稳定表达miRNA的细胞株,但也存在质粒的转染效率要低于RNA oligo,无法定量转染,过表达影响细胞内非靶基因/功能等缺点,因此目前很多

研究miRNA的科研人员都选择直接转染物美价廉的人工合成miRNA产品。miRNA产品中的siRNA,miRNA mimic都是基于内源性pre-miRNA的成熟形式设

来,从而使其具备miRNA生物学功能

并应用于miRNA的功能分析研究,但这些设计也会不同程度的影响细胞或体内的非靶基因/功

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

能。为尽可能降低上述脱靶效应,miRNA mimic往往还对核苷酸进行特定修饰,从而筛选出最接近pre-miRNA生物学功能的序列设计,但是通常情况下其功能性及特异性仍稍逊于pre-miRNA。pre-miRNA虽然具备独特的优势,但是因为当前RNA的合成工艺一直无法有效突破50个碱基左右的瓶颈,所以其价格成本较高。

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。Richard I. Gregory等在体外将pre-let-7和let-7 duplex 分别与Dicer-TRBP-Ago2共孵育,然后加入靶RNA进行反应。结果表明pre-miRNA对靶RNA的剪切活性明显优于miRNA duplex。Daniela Castanotto等用siRNA、shRNA、pre-miRNA分别或联合转染细胞研究表明,pre-miRNA不仅与外源siRNA/shRNA存在的竞争性抑制最小,而且对内源性其它miRNA的影响也最小。其原因可能是shRNA/siRNA挤占细胞内有限的RISC资源,而pre-miRNA具备高特异性序列结构避免过度侵占细胞内部资源。

由于miRNA为内源单链RNA,对依赖双链RNA的蛋白激酶(PKR)和寡腺甙酸合成酶(2',5'- oligoadenylate synthetase,2-5A)干扰素诱生系统不敏感,PKR和2-5A系统只能特异地与双链RNA结合,不能与单链或RNA-DNA杂交链结合,因此pre-miRNA在in vitro/in vovo水平上能一定程度的避免细胞毒性,进而减少细胞凋亡。

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

Carol A. Sledz等研究表明短链dsRNA也会诱导产生干扰素效应,虽然这种效应有时候比较弱,但是其具有普遍性且呈剂量依赖性。M Bauer等则通过模拟内源pre-miR-30序列结构设计出amiRNA(artificial miRNA),其有效降低了shRNA的干扰素效应,干扰素相关基因Oas1及凋亡蛋白caspase 3均得到下调。

鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

Reference:

1.Yoshinobu Shiba,et al,Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2’-O-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 10 3287–3296.

2.David Brown et al,Metheds and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules,patent:US 8,058,250.

3.Daniela Castanotto et al, Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC Nucleic Acids Research, 2007, (35), 5154–5164.

4.Kazuya Terasawa et al,Synthetic Pre-miRNA-Based shRNA as Potent RNAi Triggers Journal of Nucleic Acids

(2011), 1-6。

5.Dirk Grimm et al, Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways Nature 2006( 441),537-541.

6.Richard I. Gregory,et al,Human RISC Couples MicroRNA Biogenesis and Posttranscriptional Gene Silencing Cell, Vol. 123, 631–640, November 18, 2005.

7.M Bauer et al,Prevention of interferon-stimulated gene expression using microRNA-designed hairpins Gene Therapy (2009) 16, 142–147.

8. Onsam Sin et al,Gene Silencing Efficiency and INF-b Induction Effects of Splicing miRNA 155-Based Artificial miRNA with Pre-miRNA Stem-Loop Structures, Biochem Genet (2012) 50:112–121.

9. Carol A. Sledz et al Activation of the interferon system by short-interfering RNA, Nature Cell Biology 2003(9)

834-839.

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/ojyl.html

Top