《分子生物学》实验指导书

《分子生物学》实验指导书

实验学时：32学时 适用专业：生物科学、生物技术

实验目录

实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定…………..…..1 实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段………………..….3 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化…4 实验四 植物基因组DNA提取及电泳………………………6 实验五植物基因组RNA提取及电泳……………7

实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定

实验项目类型：综合性 一、实验目的

1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。 2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 ，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。 二、实验原理

碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。 三、实验仪器与材料

1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。 2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。

3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、 涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。

1

四、操作步骤

质粒DNA的提取步骤：

1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2. 将1.5 ml菌液倒入EP管中，7,000 rpm离心2 min。

3. 去掉上清液，沉淀悬于100 μl Solution I 中,室温放置10 min。 4. 加入200 μl Solution II, 混匀，冰浴5 min。

5. 加入150 μl Solution III（冰上预冷）, 混匀，冰浴5 min。 6. 12,000 rpm离心10min，将上清转至另一离心管中。

7. 向上清中加入等体积氯仿（去蛋白），反复混匀，12,000 rpm离心5min，将上清转移到另一个离心管中。

8. 向上清液中加入预冷的2体积无水乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12,000 rpm离心5min，倒去上清，把离心管倒扣在吸收纸上，吸干液体。

9. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，倒去上清，空气中干燥。 10. 加20μl TE缓冲液, 使DNA完全溶解，-20℃保存。

11.电泳检测质粒,在10 μl反应体系中加入8μl质粒DNA，2 μl 10×Loading Buffer, 1%琼脂糖电泳 (5V/cm) 检测。

酶切： 配制如下体系，37℃酶切质粒3 h后，电泳检测酶切结果。 10×K 1μL 质粒DNA 1μL EcoRⅠ/BamHⅠ1μL 无菌水 7μL 五、实验报告

绘出质粒DNA电泳图、酶切电泳图 六、思考题

酶液中甘油的用途是什么？

实验二 聚合酶链式反应扩增DNA片段

一、实验目的

通过实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二、实验原理

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 三、实验仪器与材料

1. 材料： 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相对分子质量标准物等。

2

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。

四、操作步骤

1. 在0.2ml RCR管内配制25ul反应体系：

质粒DNA 1μl 10×buffer 2.5 μl MgCI2 1.5μl dNTP 2μl 引物1 1μl 引物2 1μl Taq酶1μl 无菌水15μl。 2. 在下列条件下进行扩大增 （1） 94℃变性3min （2） 94℃变性30S （3） 55 ℃退火30S （4） 72 ℃延伸30S （5） 重复2-4共25次 （6） 72 ℃延伸10min

3. 扩增后，电泳检测PCR结果 五、实验报告 绘出PCR电泳图 六、思考题

PCR的原理是什么？

实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化

一、实验目的

1. 学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2. 学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

二、实验原理

将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 三、实验仪器与材料

1. 材料： 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相对分子质量标准物等。

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。

四、操作步骤

1. 从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37度振荡培养过夜。

2. 取0.5ml菌液转接到一个含有50mL LB 液体培养基锥形瓶中，37度振荡培养2-3小时。

3

3. 将菌液转移到1.5 mLEP 中，冰上放置10min。 4. 离心10min（4000r/min），回收细胞。

5. 倒出培养液，将管倒置1min,使培养液流尽。

6.用冰冷的0.1mol/LCaCl2 300μL悬浮沉淀，立即放在冰上保温30 Min。 7.离心10min（4000r/min），回收细胞。

8. 用冰冷的0.1mol/LCaCl2 50μL悬浮细胞（放在冰上）。

9. 取50μL新配制的感受态细胞，加入质粒DNA 2μL混匀，冰上放置30Min。

同时做两个对照：

受体菌对照：50μL感受态细胞+2μL无菌水

质粒对照：50μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA 10. 将管放到42度循环水浴1-2min。 11. 冰浴2min。

12. 每管加200μL LB 液体培养基，37度培养45min。 13. 将250μL转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素（100μg/mL）的培养皿中。

14. 倒置平皿37度培养12~16H，出现菌落。 五、实验报告

绘出质粒DNA分子转化结果图 六、思考题

1． 感受态细胞的制备原理？

2．

影响转化率的因素有哪些？

实验四 植物基因组DNA提取及电泳

一、实验目的

1．熟悉常用仪器。

2．学习、掌握植物基因组DNA提取原理、方法和DNA质量检测技术。 二、实验原理

用液氮研磨植物组织，从而破碎细胞；细胞提取液中的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并使蛋白质变性沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚和氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液用乙醇沉淀。 三、实验仪器与材料

1. 材料： Tris,EDTA,KCl,SDS,NaCl,EB，酚，氯仿，异丙醇，β巯基乙醇，乙醇，琼脂糖，50ml离心管，研钵、研杵，吸头，液氮，一次性手套，棉手套等。

2. 溶液或试剂：细胞提取液，5 mol/L KCl，TE等。

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高低温离心机，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温金属浴等。

四、操作步骤

1. 取2g新鲜菠菜叶片，在液氮中研磨成粉末状(越细越好)。将粉末移到50 ml离心管中。

2. 加入16 mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。

4

3. 从水浴锅中取出离心管，加入5 mL 5 mol/L的KCl溶液，混匀水浴20min。 4. 4000rpm/min离心20 min。（以上每小组做一管，以下步骤中每人做一小管）

5. 将上清液转移到1.5 mL的离心管中。

6. 加入等体积酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5 min，取上清。 7. 加入等体积氯仿混匀，12000 r/min离心5 min，取上清。 8. 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。

9. 离心，去上清，获得沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀3次，风干沉淀。 10. 加入500 uL TE缓冲液，溶解DNA。

11. 取3 uL 上清液，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。 五、实验报告

绘出琼脂糖凝胶电泳检测DNA图

六、思考题

1. SDS、液氮、异丙醇、氯仿等分别有什么作用？

实验五 植物RNA的提取及电泳

一、实验目的

1. 学习植物总RNA的提取方法和RNA的琼脂糖凝胶检测。 2. 掌握RNA提取原理、方法和RNA质量检测技术。

二、实验原理

用液氮研磨植物组织，高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶。细胞裂解后，DNA、蛋白质和细胞碎片等可通过酚、氯仿等去除，得到总RNA。 三、实验仪器与材料

1. 材料： DEPC，NaAc,LiCl,MOPS,EDTA,异硫氰酸胍，氯仿，酚，乙醇，琼脂糖，50ml离心管，研钵、研杵，吸头，液氮，一次性手套，棉手套，甲醛等。

2. 溶液或试剂：4mol/L异硫氰酸胍；2mol/L NaAc（pH4.8）；4mol/L LiCl；3mol/L NaAc（pH5.0）；以上溶液用DEPC处理过的水配制。0.1% DEPC水；5×电泳缓冲液；变性琼脂糖凝等。

3. 其他用具：低温离心机，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，制冰机，水浴锅，灭菌锅等。

四、操作步骤

1. 取2g新鲜菠菜叶片，在液氮中研磨成粉末状，将粉末移到50 ml离心管中。

2. 依次加入以下溶液，混匀： 异硫氰酸胍溶液 4 mL 苯酚 3mL NaAc（pH4.8） 0.3mL 氯仿 0.6 mL

3. 冰浴30min后，8000rpm离心13 min。（以上每小组做一管，以下步骤中每人做一小管）

4. 弃沉淀，将上清液400 uL转移到1.5 mL的离心管中。 5. 加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1h。 6. 4℃，8000 r/min离心13 min，弃上清。

5

7. 在沉淀中加入1mL LiCl溶液，使溶解，冰浴2h。 8. 13000 r/min离心15 min，弃上清。

9. 在沉淀中加入400 uL DEPC-H2O，再加入400 uL氯仿，混匀（去蛋白）。 10. 13000 r/min离心6 min，取上清，加入0.1倍体积NaAc（pH5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置0.5h。

11. 13000 r/min离心13 min，弃上清。

12. 将沉淀RNA 用70％乙醇洗涤3次，风干沉淀。 13. 加入100 uL DEPC水溶解RNA。 14. 用琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 五、实验报告

绘出琼脂糖凝胶电泳检测RNA图 六、思考题

1. 异硫氰酸胍、LiCl和DEPC等分别有什么作用？

6

7. 在沉淀中加入1mL LiCl溶液，使溶解，冰浴2h。 8. 13000 r/min离心15 min，弃上清。

9. 在沉淀中加入400 uL DEPC-H2O，再加入400 uL氯仿，混匀（去蛋白）。 10. 13000 r/min离心6 min，取上清，加入0.1倍体积NaAc（pH5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置0.5h。

11. 13000 r/min离心13 min，弃上清。

12. 将沉淀RNA 用70％乙醇洗涤3次，风干沉淀。 13. 加入100 uL DEPC水溶解RNA。 14. 用琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 五、实验报告

绘出琼脂糖凝胶电泳检测RNA图 六、思考题

1. 异硫氰酸胍、LiCl和DEPC等分别有什么作用？

6

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/y4kr.html