感受态细胞的制备

一、电转化感受态细胞的制备

1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）

2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 二、连接产物纯化

1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10μl of ddH2O

2μl of 3M NaAC（PH5.2）

50μl of 无水乙醇

轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟；

3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5.4℃，top Speed离心5分钟；

6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用； 三、电转化

1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。 3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部； 6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20μl转化产物加160μlSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 四、电击杯清洗流程 1.用清水将电击杯稍冲一下。

2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4.加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。 5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。 注：1．不同样品使用的电机杯应分开； 2．每周用1%酒精浸泡30分钟。

各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态细胞里面的菌体全都死了？是为什么呢？有人有遇到这种情况的吗？还望各位网友多多指教，感激不尽哈！急急急！！！ chenchuan24891(站内联系TA) 你应该自己好好去按文献的方法检查一下，大多数情况下是自己的失误造成的。如果还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。 clx@6016(站内联系TA) 1楼: Originally posted by clx@6016 at 2011-11-21 1134:

各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态 ... 先把新鲜划好的菌接到含有Amp的3mlSOB试管中，30度过夜培养，第二天以1:50的接种量转接到50ml含有Amp的SOB中(转接之前加入MgCl2)，30度摇菌2小时，OD600为0.1左右，然后加入L-阿拉伯糖诱导35分钟，OD600为0.3-0.4左右。5000转，4度离心10分钟，收菌。然后用10%甘油重悬3次，5000转，4度离心10分钟。最后将菌体浓缩500到800倍后保存在10%甘油中。然后立刻电转！如果有什么问题，还请各位前辈多多指教哈！

clx@6016(站内联系TA) 3楼: Originally posted by chenchuan24891 at 2011-11-27 0956:

你应该自己好好去按文献的方法检查一下，大多数情况下是自己的失误造成的。如果还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。 恩，谢谢哈！ dnaxxx(站内联系TA) 电转的话应该按照电转仪的说明来制备感受态吧，我们买的仪器有很多菌的protocol和建议电转条件

大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

发布时间：2011年03月07日 点击次数：：次

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的

作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/μg DNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。 （2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。 （4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化

为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。 （1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。

（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。特别注意，不同的电转化

杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。

（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。

（4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

（5）37℃，220～250 rpm复苏40min。 （6）按照钙转步骤进行涂板培养。 【电击杯清洗流程】

（1）用清水将电击杯稍冲一下。 （2）向电击杯中加入75%酒精浸泡2h。

（3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

（4）加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。 （5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。 （6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。

【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。

高效感受态的制备----方法、技术要点总结 转自螺旋讲堂

标签: 讲堂 螺旋 感受态 要点 制备 2010-11-24 16:10

大肠杆菌感受态细胞的制备

体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。

对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。其中，电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。其转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。而对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。

一、CaCl2感受态细胞的制备

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；

2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

以上是基本步骤，基本同“分子克隆指南”，具体的体积（一次制作感受态细胞的量）由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。提高感受态效率的关键如下述――

注意事项：

1.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板；

2.菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6；

3.低温处理的时间，做完后冰上保存12到24h后分装，并保存于－80℃；

4.试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，

要确保干净，CaCl2溶液要过滤除菌，不要高压灭菌。

二、电转感受态细胞的制备

1、 -80℃冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；

2、次晨，挑选单克隆感至内含1ml SOB液体培养基的试管中，37℃，300rpm，6 hr； 3、然后转接到含400ml SOB液体培养基的2L摇瓶中（按1:500的量转接），300rpm，4hr，然后每隔2 min测一次OD600，至OD600=0.76；

4、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来；

5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，2000 g，10 min；

6、弃上清后，用预冷的水（灭菌的重蒸水）洗：先加少量水悬浮菌体（具体办法：在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮），菌体悬浮后再把水加满，2200 g，10 min，弃上清；

7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400 g，10 min；

8、最后一次倒尽甘油后（尽量去干净），用残存在管底的甘油悬浮细胞，每120μl分装到1.5 mL Ep管（EP管要-70度预冷），用-70℃的乙醇迅速冰冻； 9、保存在-80℃冰箱中备用。

以DH10B为例说明：

步骤1：每次做感受态都要新鲜划菌，不要使用保存于4℃或室温的平板；尽量使用原代菌，最好不要用多次传代的菌；LB平板也可以，但效率可能会降低；SOB使用GIBCO公司的试剂配制，效果最好；但若电转的连接子为一般性载体，使用普通的试剂配制培养基即可； 步骤2：该步骤与步骤3中出现的数字存在相关性，条件允许的话尽量按照要求做，不允许的话则按照实验室实际情况稍做修改，确保菌体生长良好；

步骤3：确保OD达到要求，宁可低一点，也不要高一点，建议在达到0.5后过2-3 min就测一次OD值；

步骤4：一定要在冰水混合物中快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来，不要静置于冰水混合物中，摇动大约10 min；

步骤5：建议使用离心杯，因为其底是平的，并且灭菌时里面要装上双蒸水,利于步骤6，7与8中的悬浮操作；

步骤6：悬浮菌体时不要使用移液枪，开始时加入的水量要少，避免过多，等菌体重悬起来以后再加满。用手摇动时保证培养基液面低于冰面，重悬过程中注意悬浮的菌团出现，需将其全部分散开； 步骤7：同上

步骤8：尽量倒尽甘油，使感受态更浓，每400ml培养物制备1-1.5mL感受态为益；关于EP管预冷与-70℃的乙醇迅速冰冻的具体办法：在菌种保藏盒内加入适量的乙醇，再把空的EP管盖上帽子后放入其中，置于-70度冰箱（或-80℃冰箱）预冷，分装感受态的时候将其取出（连带保藏盒），在超净台分装，分装时使用灭菌并剪去尖头的枪头，尽量使用1ml蓝色大枪头。完成后置于- 80℃冰箱；

步骤9：关于保存感受态的温度，- 70℃、- 80℃皆可，建议实验室现有的温度最低的冰箱； 以上方法适用于很多E.coli菌株，例如：XL1-Blue，DH10B，DH5α，Top10，JM109，BL21等做电转感受态，可能不同的菌株生长速度有差异，方案中的培养时间与最佳OD值可能有变化，不妨用此方案尝试一下，如果效率不够高的话可以对所用的菌株进一步进行优化。 注意：

1.所用的摇瓶和离心管要洗的特别干净，禁用任何洗涤剂，用NaOH溶液洗数次；2.重悬菌体用手振荡，不用振荡器；

3.用枪吸打要轻，枪头需要剪去尖头； 4.如果做的效果好，效率可以达到10*10以上。

对于E.coli感受态制备，以上实验方案都要特别注意：所有的容器要用新的，不用洗涤剂，用手洗且保证彻底干净；相应的器材要作为制备感受态细胞专用，不做其他用途；试剂要选用最好的，尽量过滤除菌，不用高压灭菌等等。因为电转化效率更高，对要求转化率的实验，建议采用电转化的方法。

下面奉送大家晶美公司和小木虫总结的有关高效感受态制备的方法，供参考：

附件1. 晶美公司高效感受态细胞制作方法： 版权归晶美公司所有，仅供大家参考！ 方法一

A液：1M，MnCl2：

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时， 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。

根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。

1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。

2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，

肯定效率不低。

4、培养后的OD值。其实这并非一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。 8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。 方法二

1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.

2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.

3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度. 4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟 5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体

6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟

7.再次离心回收菌体

8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟 9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上. 10.在液氮或-80度保存.

附件2. 小木虫 发布的高效感受态细胞的制作 小木虫网站所有，供大家参考。 作者: noah 方法一

A液：1M，MnCl2：

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时， 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建

议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。 方法二

1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.

2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.

3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度. 4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟 5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体

6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟 7.再次离心回收菌体

8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟 9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上. 10.在液氮或-80度保存. 方法三

（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。

（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。 （3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （5）重复第4步操作。

（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 （7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。 本法效率极高,建议大家采纳 方法四

1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)

2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min 3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min

建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 方法五

E.coli感受态细胞制备方法:

单菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600=0.2-0.4 离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.

转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42℃ 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml, 37℃ 1小时后铺抗生素平板。 TSS:

7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML dmso

0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化

以枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）为例 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法

1.准备新鲜的168单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37?C培养箱培养12 h；

2.转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB培养基中，37?C，250 r/min培养过夜； 3.第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37?C，250 r/min培养至对数生长末期(168约4-5 h)；

4.取0.2 ml生长至对数期末的培养液至2 ml SPII培养基中，37 ?C，100 r/min培养90分钟；

5.在上述SPII培养基的菌体中加入20 ?l 10mmol/L EGTA，再于37?C，100 r/min培养10分钟；

6.将上述处理后的菌液分装成0.5 ml每管，各加入5 ?l DNA（DNA量不能过高，不超过5?g），再于37 ?C，250 r/min培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。

相关试剂配方如下： SP盐：

0.2%( NH4 )2SO4, 1.4% K2HPO4, 0.6% KH2PO4, 0.02% MgSO4?7H2O, 0.1% 柠檬酸钠;

CAYE (100?)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。

SPI培养基： SP盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100?CAYE溶液； SPII培养基：SPI培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2溶液。

? 试剂

SP－A Salts Solution：（500 ml Solution）

0.4％ (NH4)2SO4 2g 2.8% K2HPO4?3H2O 14g

1.2% KH2PO4 6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g 121℃灭菌20min

SP－B Salts Solution：（500 ml Solution）

0.04% MgSO4?7H2O 0.2g 121℃灭菌20min

100× CAYE Solution：（100 ml Solution）

2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃灭菌20min

SPI Medium：（20 mL）

9.8mL SP－A Salts Solution 9.8mL SP－B Salts Solution

200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min） 200µL （1％V）100× CAYE

SPII Medium：（6 mL） 5.88mL SPI Medium

60µL （1％V）50mM CaCl2 60µL （1％V）250mM MgCl2

100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 注意：

1. 注意仪器用品的干净和无菌；

2. 8ml SPI培养基要放于50ml离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用玻璃试管；

3. 注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期； 4. 保证菌体的浓度，可以提高转化率。

感受态制备关键点

1.甘油的质量，水的质量，最好是miniQ的，如果要求完美，洗瓶不要有洗涤剂残留，先将瓶装满miniQ水高压，再弃去，再配置10%甘油。收菌以半对数期合适，一般OD 0.5收菌，过则不佳，直接取-80度菌种摇，次日转种，从盘上菌落摇的要差，33-34℃摇菌结果更理想。在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗涤时一定低温，重悬时应轻震荡，弃洗涤液应

倒干静，那怕损掉部分细菌。最后大概500ml能做3-4ml感受态，液氮中冻10min转-80度冰箱，快一点，免的EP管爆了，也可不冷冻，直接用来转化。感受态应以标准浓度质粒电转记算效率，一般大于109/mg，操做以1ng/ul质粒1ul加40ul感受态置0.1杯，电转后以最快的速度加入1ml SOC复活，100-150转摇1hl，取1/1000铺盘应大于1000个菌生长。这样用于建库工作才行。电转时质粒或连接物尽可能少，以减少离子，实际上离子高，电流直接通过，没有场强，质粒是进不去的。 注：

1.任和有关东西都要干净，保证没有离子， 2.从接触甘油开始就保持恒温，0℃， 3.电击后复活要快。

关于载体连接的讨论

相信凡是做过分子生物学的人应该都对载体构建有所了解，而载体构建中基因片段同载体的连接是一个关键所在，现就同载体连接相关内容讨论如下：

1.连接的反应温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，分子布朗运动速度过快，连接后末端的氢键结合变的很不稳定，致使刚连接后的片段又大量的解离，所以连接反应不能在过高的温度中进行；但是，随着温度的降低，连接酶的活性降低，故为保证连接的效率，采取折衷方法是16℃过夜，这样能够保证获得最佳的连接效果。当然，也不是所有的连接反应都是在16℃下最好，也可以采用12℃过夜，或者37℃下反应30min然后4℃过夜等等，这需要根据实际情况调整；

2.限制性内切酶在反应中是不需要外部提供能量的，但是T4 DNA连接酶需要在外部提供能量的情况下才能完成连接反应，因此，能量ATP的充分供给将是连接反应成败的另一关键因素。对于商业化的DNA连接酶来说，一般ATP都是在提供缓冲buffer中的，而ATP是不稳定的，随着时间的延长，ATP会大量的消耗，为了解决能量即ATP的问题，建议对于难以连接的片段，不妨采用下面的方法试试：先以正常的体系连接（10μl体系中含1μl 酶、1μbuffer、片段、载体）（16℃）连接4-6h，然后在该体系中再加入1μl buffer以提供充足的ATP，而此时可以不用考虑反应体系中盐离子浓度等，因为此时能量是更为重要的问题。

当然，连接反应还有其他许多因素，比如载体和片段的比例、片段末端形态等等这些都在此暂不讨论，只提供以上两点供参考。

个人见解，仅供参考！请广大螺友斧正，并欢迎大家提出意见和见解！ 联系方式：

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Lofeel 2008.3.25

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 来源：小木虫论坛 2006-11-21 23:33:00 访问量：8229 评论（0）分享 这都是我几年来经验总结啊,觉得有用一定要顶 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 方法一 [试剂准备]

A液： 1M ， MnCl2：

B液： 1M ， HEPES ， pH=6.2-6.8 ，用无菌水配，配后不需灭菌； C液称取 CaCl2 0.10g ， KCl 1.18g ，全部转入细口试剂瓶，然后加入 46ml 三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅 121 ℃高压灭菌备用。 [操作方法]

1. 取 1 管 B 液（ 0.6ml ），全部加入 C 液 (46ml) 中，混匀后，再用 1ml 移液器加入 3.3ml A 液，混匀冰浴即可使用。

2. 划线得到单菌落，37 ℃培养箱培养约 17 小时，挑取 2-4 个形态饱满的单菌落接种于装有 100ml SOB 培养基的三角瓶 ,37 ℃剧烈振荡（ 300 rpms ）培养 3-4 小时，将培养温度调至 18℃剧烈振荡（ 3280 rpms ）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入 4ml TB 缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入 280ml DMSO （可用国产分析纯），混匀后分装入 1.5ml EP 管，冰上静置 15 分钟。用纱布将所有装有感受态的 EP 管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置 12 小时以上。取出感受态放入 -70℃超低温冰箱备用。 此法效率非常高，一般可到 108，好时可到 109，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将 LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP 管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到 1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于 1990 年《gene》上刊登的由 Inoue H. 等提出的高效感受态的制备与转化方法。 [注意事项]

1 、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。离心力要注意不要超过 2500g，建议 1500-2000g 5min 。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴 2 小时以上的板。涂完后建议空气晾干（ 20-30 分钟）这样会减少卫星菌落出现。

2. 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置 1min ，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液。

3. 培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积 / 三角瓶容量 =100ml/500ml ， 50ml/250ml 。

4. 培养基的 pH 值。这是讲的 pH 值并非单指配置或灭菌后的 pH 值，而且还包括整个摇瓶结束后的 pH 值。一般来说，接种前的 pH 值在 6.8-7.2 ，等菌摇好后，可以测一下 pH 值，不要低于 6.0 ，最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。

5. 培养后的 OD 值。其实这并一个非常重要的参数，只是当 OD 值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调 OD 不得大于 0.6， 0.8 等等。同时， OD 值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在 OD 值的两方面影响中找一个平衡点。

6. 培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的 Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用 20mM MgCl2 做为培养基的添加物，在感受态收获之前 20-30 分钟加入，会收到很好的效果。 7. 培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

8. 此外文献报道，在保存感受态时， DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

9. 液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。 方法二

1. 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌 *E.COLI DH5，JM109，HB101 等，在 LB 平板上划线，37 度过夜至长出单菌落。

2. 挑直径 1-3 毫米的单菌落 * 可多个，接种到 250 毫升 /3 升锥形瓶或 80 毫升 /1 升锥形瓶的 SOB 培养基，培养基量不可再多, 会影响效率。 3. 在 18 度 150-250RPM 培养 19-50 小时 * 没有冷却摇床的可在室温 , 但不可高于 37 度 .

4. OD600 约 0.4-0.8 时停止培养，放在冰水中冷却 10 分钟

5. 4 度，300RPM 离心

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