western blot步骤

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析

Western Blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western Blot应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。

Western Blot 流程：蛋白样品的制备，制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗杂交，二抗杂交，底物显色。 （一）蛋白样品的制备：

提取总蛋白:所有操作在冰上进行,且所有操作要对着容器壁操作，防治将细胞吹落；操作前先用PBS将细胞洗2变。

1.将原瓶/皿中放入5ml生理盐水或PBS，根据细胞团块大小加入100-300μl RIPA裂解液，吹匀后，4℃摇床30min。

2. 4℃，12000×g 15min，离心后取上清，测浓度。

BCA蛋白浓度测定方法： 原理

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在570nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 特点

1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1-20微升。

2. 在50-2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

步骤(标准品为BSA，标准品稀释液为生理盐水)

① 50体积BCA试剂A（碧云天）加1体积BCA试剂B（碧云天）（50:1）配制适量BCA

工作液，充分混匀；

②完全溶解蛋白标准品(即BSA)，取10微升稀释至100微升(生理盐水稀释) ，使终浓度为0.5mg/ml；

③将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升(此时浓度分别为0 0.5 1 2 4 6 8 10);

④加适当体积样品(1微升)到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升; ⑤各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟;

⑥测定570nm处的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

完全溶解蛋白标准品（即BSA），取10微升稀释至100微升（生理盐水稀释），使终浓度为0.5mg/ml 标准蛋白（μl） 生理盐水（μl） 0 20 1 19 200 1 19 2 18 200 1 19 4 16 200 1 19 8 12 200 1 19 12 8 200 1 19 16 4 200 1 19 20 0 200 1 19 BCA工作200 液（μl） 样品（μl） 生理盐水（μl）

1 19 （二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.1mlRIPA裂解液：0.5M Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1% NP40，0.5% 去氧胆酸钠，0.1%SDS)加入10μl PMSF(配成0.1M的甲醇溶液)

1. 30%丙烯酰胺: 丙烯酰胺(Arcylamide)29.2g，N，N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis-Acry)0.8g/100 ml(丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关)

2. 10％SDS: 10gSDS溶解于100 ml的ddH2O(阳离子去污剂:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠)

3. 上层胶缓冲液(upper gel buffer): 6.055gTris-HCL/100ml，PH 6.8 4. 下层胶缓冲液(low gel buffer): 18.2 gTris-HCL/100ml，PH 8.8 5. TEMED(催化剂)

6. 10%过硫酸铵(AP): 0.1g溶于1ml消毒后的ddH2O (促凝剂)

7. 1* Running buffer: 3.03g Tris-base，14.4g甘氨酸/1L，1L加10％SDS 10ml（现配现用） 8. Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 1*Running buffer ，10%SDS

9. 转移液（转膜用，一张膜）用:10%甲醇+20*Transfer Buffer12.5ml+ddH2O=250ml 10. 6*SDS凝胶加样缓冲液: 300mmol/L Tris-HCL(6.8)，600 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，12%SDS， 0.6%溴酚蓝，60%甘油

11. 10*TBS 缓冲液:24.2g Tris-base，80g NaCL/1LddH2O，PH 7.6 12. 1*TBST（洗膜用）：1*TBS，0.1% Tween20（1L加1ml）

1）制备SDS－PAGE： 下层胶 双蒸水（ml） Gel buffer（ml） BIS（丙烯酰胺）（ml） 10%SDS（μl） 10%AP（μl） TEMED（μl）

标准蛋白（μl） 生理盐水（μl） 0 20 1 19 200 1 19 2 18 200 1 19 4 16 200 1 19 8 12 200 1 19 12 8 200 1 19 16 4 200 1 19 20 0 200 1 19 上层胶 12.5% 2.7 2.0 3.3 90 60 6 *2 5.4 4.0 6.6 180 120 12 *3 8.1 6.0 9.9 270 180 18 15% *2 *4 5% 2.3 1.0 *2 4.6 2.0 *3 6.9 3.0 *4 9.2 4.0 2.0 4.0 8.0 2.0 4.0 8.0 7.5% *2 *3 10% *2 *3 9.9 6.0 8.1 270.0 180.0 18.0 4.0 8.0 12.0 3.3 6.6 2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 2.0 4.0 6.0 2.7 5.4 90 60 6 180 270 120 180 12 18 90 60 6 180 120 12 4.0 8.0 16.0 0.67 1.34 2.01 2.68 90 60 6 180 360 120 240 12 24 40 20 8 80 40 16 120 60 24 160 80 32 BCA工作200 液（μl） 样品（μl） 生理盐水（μl） 1 19 2）蛋白质样品的处理： 加样配制：总体积：20μl ①β-巯基乙醇（β-me）2μ l ②6×SDS样品缓冲液3μl

③蛋白取量:取一组蛋白中，蛋白浓度最低为基础，取15μl,其余的以15*(基础浓度/其余样品浓度)

④剩余的体积用双蒸水ddH2O补齐

⑤混和后100℃煮沸5 min。分装后4℃保存，可以减少反复冻溶蛋白降解。在电泳槽内加入电泳缓冲液，检查胶漏不漏，加样：每泳道加样量70-80μg(15孔≤30μl，10孔≤50μl)，且每泳道样品蛋白总量相等。若样品和Marker总数(5μl)不足泳道总数，剩余的泳道可用补齐液补齐（配制与样品一致，蛋白部分用ddH2O补），接通电极，上层胶80V，30-45min，下层胶110V，溴酚蓝指示剂迁移到分离胶下游边缘时，停止电泳。 3）转膜：湿法(需在冰中进行)

将适当大小的PVDF膜（8.3cm×5.2cm，经甲醇预浸泡60秒）和下层凝胶浸入转移缓冲液平衡15-30min，按照夹心法由下至上依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵顺序放好，细心赶去膜和胶夹心内气泡，擦干周围水。 恒压转膜（30V,1小时45分钟）

4）封闭：1*TBST+ 5%（5g/100ml质量体积比，下同）脱脂奶粉，将硝酸纤维素膜放入封闭液中，置于摇床上，室温封闭1-2h。PBST(TBST)洗涤5min×5次(2—3次即可) 5）按照分子量的大小剪取需要的膜条段 6）一抗封闭：

用1*TBST+5%脱脂奶粉稀释一抗1：1000置于摇床上，60次/ min，4℃过夜。 PBST(TBST)洗涤5min×5次（2次即可） 7）二抗封闭

用1*TBST+5%脱脂奶粉稀释二抗1：1000 羊抗兔IgG-HRP或者羊抗小鼠IgG-HRP 置于摇床上，60次/ min，室温孵育1-2h。PBST(TBST)洗涤5min×10次 8）底物显色

显影液immobilon western 1:1配制，一张5.2×8.3cm膜共用400μl。将显影液均匀涂于膜上，把膜盖上1min后曝光

已曝光的膜进行洗脱

① 1×TBST洗两遍，每次5min ②洗脱液洗一遍，20min

③ 1×TBST洗两遍，每次5min

④牛奶封闭1h以上，封闭非特异性表位

Western blot常见问题分析 (一) SDS-PAGE电泳 1.胶不平？凝胶漏液？ . 胶板洗刷干净

. 加入AP和TEMED的量要合适

. 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀

. 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 . 两块玻璃板底部要对齐

2.条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？ . 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 . 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲

. 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 . 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适

（二）转膜及抗体检测

1.凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？ . 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min . 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸

. 确保膜和胶块之间没有气泡

. 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 2.转移到膜上的蛋白很少？ . 蛋白分子量< 10KD . 蛋白的等电点< 9 . SDS浓度不合适 . 凝胶太厚 对策：

. 蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 . 更换高pH值Buffer

. 在阴极buffer中加入0.005 – 0.01% SDS 可提高转膜效率 . 延长转膜时间 3.背景太高？ . 膜没有均匀浸湿 . 膜或者缓冲液污染 . 封闭不充分

. 抗体与封闭剂出现交叉反应 . 抗体浓度过高 对策：

.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿

. 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 . 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 . 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 4.杂交信号很弱？ . 抗体保存不当 . 抗原不充足 . 膜的漂洗过度 对策；

. 抗体长期保存应在-70℃，使用前做效价检测

. 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 . 减少漂洗的时间和次数 5.出现非特异带？ . 一抗不是唯一特异的 . 二抗出现非特异结合 对策：

. 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点

. 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6mc3.html