western blot原理,操作

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

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蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

WB概述: 检测原

理:

A 蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，

总体原则和注意事项：

1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）

2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）

3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）

4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）

5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解

裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位 推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞 NP-40 or RIPA（附录1） 全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白） Tris-HCl（附录1） 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不Tris-Triton（附录1） 蛋白分级抽提试剂盒 溶蛋白） 细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜 NP-40 or RIPA（附录1） 膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法：

1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）

2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask).

3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，

细胞核 线粒体 RIPA（附录1） RIPA（附录1）

4 4℃摇动30 min

5 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.

A-1-2 组织裂解

1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，

2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，

3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,

A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂

推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：

备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下： 所有步聚均需在通风橱中进行： 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0

3. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至 9.0 6. 再煮沸至无色

7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积

9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.

A-3 蛋白定量

Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果

裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方法或产品比较列表如下：

方法 Lowry法 原理 灵敏性 蛋白质在碱性溶液中较高约5μg/ml 肽键与Cu2+螯合，形成Folin－酚蛋白质一铜复合物，对可达试剂法 还原酚磷钼酸产生蓝1-1500μg/ml 色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性 关系 干扰因素 应用 适用于脂类含量耗费时间长较高的样品测定，40～60分也能耐受相当浓钟；操作要度的去垢剂如严格计时；SDS。 颜色深浅随不同蛋白质受硫酸铵；Tris变化; 标准缓冲液；甘氨酸；曲线不是严各种硫醇干扰 格的直线形式，且专一性差 Bradford法 考马斯亮蓝G-250与高约1～5μg/ml, 易受强碱性缓冲快速5～15蛋白质结合呈蓝色，液，TritonX-100，分钟，颜色微孔法测定范围为SDS等去污剂的稳定；深浅在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋1-25μg/ml 影响 随不同蛋白白质的含量呈线性关质变化; 标试管法测定范围为系 准曲线有轻100-1500μg/ml 微的非线性 BCA法 BCA法基于双缩脲原很高0.5-20μg/ml 不易受一般浓度较快40分钟理，碱性条件下蛋白去污剂的干扰 内，较好的2+ 试管法可测范围 质将Cu还原成 方法；抗干20–2,000 可受螯合剂；略高扰能力强 Cu1+ ，BCA浓度的还原剂的（Bicinchoninic μg/ml 影响 酸）螯合Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色微孔法为 0.5～并在562 nm有吸收峰10μg/ml 单价Cu1+与蛋白呈剂量相关性， BCA测定方法如下: A． 酶标板操作

1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂 孔号 蛋白标准溶液（μL） 去离子水（μL） 对应蛋白含量（μg） 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 4 8 12 16 20 20 19 18 16 12 8 4 0 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 3. 各孔加入200μL BCA工作液；

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 B． 分光光度计测定

1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂

孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液0 5 10 20 40 60 80 100 （μL） 去离子水（μL） 100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 （μg） 2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 3. 各管加入1000μL BCA工作液；

4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 A-4 电泳上样样品的准备

A-4-1 变性、还原蛋白样本

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，

蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸 5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加热 5-10分钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本！：！混合后变性上样即可： 2X Laemmli buffer 4% SDS

10% 2-mercaptoethanol 20% glycerol

0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl

Check the pH and bring it to pH 6.8.

SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。

A-4-2天然和非还原样本

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。

某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些cysteine基的氧化态，因此loading buffer和电泳液中不加入?-mercaptoethanol and DTT 蛋白状态 还原—变性 凝胶状态 还原和变性 loading buffer 有 ?-mercaptoethanol 或DTT 和SDS 还原和非变性 有?-mercaptoethanol 或DTT ，无SDS 非还原和变性 无?-mercaptoethanol 或DTT ，有SDS 非还原和天然 无?-mercaptoethanol 或DTT ，无SDS 电泳缓冲液 有SDS 还原—天然 无SDS 氧化-变性 有SDS 氧化-还原 无SDS 注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳 B 电泳

B-1 PAGE胶的制备

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的 %C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。 蛋白分子量 (kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶浓度 (%) 20 15 12.5 10 8 不同浓度的凝胶的配制方法见附录2 首先配制各组分贮备液，然后分别配制浓缩胶和分离胶。

B-2 蛋白分子量Marker

预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪

商业化产品：

非预染Marker (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa) 预染Marke r (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)

B- 3 阳性对照

目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。 B-4 内参对照

管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。

内参Beta-actin 抗体 at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate.

B-5 上样与电泳

每孔上样量为20-40 μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，

标准电泳缓冲液：1X Tris-glycine： 25 mM Tris base 190 mM glycine 0.1% SDS 调 pH;8.3.

电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,(1小时或过夜，取决于电压大小），当染料到达胶的底部，关电源停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。

C 转膜与显色（Western Blot） C-1 胶中蛋白的检测

电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。

铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。

考马斯蓝法：用40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。

C-2 蛋白转膜

蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。 湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。

标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS使之终浓度为0。1%。

半干式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，

SuperSignal? West SuperSignal? West SuperSignal? West Pico化学发光底物 Femto超灵敏型底物 Femto增强型底物 与ECL? 系统相比减延长的信号持续时间

适用于HRP检测的最灵

主要优点 半的价格、双倍的信使这种底物用于今天

敏的化学发光底物

号 的成像设备最为理想

检测下限 10-12g 10-15g 10-14g 信号持续

6-8小时 8小时 24小时

时间 首选检测

X胶片 成像设备或X胶片 成像设备或X胶片

方法 建议一抗

1:1000-1:5000 1:5,000-1:100,000 1:1000-1:50,000

稀释度 建议二抗

1:20,000-1:100,000 1:100,000-1:500,000 1:50,000-1:250,000

稀释度 产品保存

室温1年 4℃1年或室温6个月 室温1年

期

建议印迹

硝化纤维

膜

硝化纤维或PVDF 硝化纤维或PVDF

X-ray 胶片：传统上使用手工曝光的方法，可控制X-ray 胶片在曝光和在定影剂的时间调节。而全自动X-ray 胶片曝光器也广泛使用并操作简便。

注意不能过度曝光，特别不适于检测相对蛋白量，过度曝光导致全暗的背景没有反差和/或产生大量的非特异性条带。

数字图像显影：新一代的胶片显色方法是使用数码相机在暗室中拍摄膜上的化学发光，将其转成数字信号，再通过仪器自带的软件进行分析。 有些新一代商品化的数字成像仪器已不再检测HRP连接的抗体（如：ECL chemiluminescence），如STORM分析仪只检测荧光标记的抗体。 D 常见问题分析与解决方案 问题 可能原因 封闭不充分 一抗浓度过高 抗体孵育温度过高 二抗非特异性结合 背景高 或与封闭剂交叉反应 一抗或二抗与封闭剂 有交叉反应 洗膜不充分 膜不合适 膜干燥 一抗、二抗等不匹配 没有阳性条带 一抗或/和二抗浓度低 封闭剂与一抗或二抗有交或很弱 叉反应 一抗不识别目的物种的靶蛋白 样本中无靶蛋白或靶蛋白验证或解决办法 延长封闭时间， 更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）增加一抗稀释倍数, 4℃孵育 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 在孵育和洗涤液中加入Tween-20 以减少交叉反应. 增加洗涤次数 NC膜比PVDF膜背景低 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。 增加抗体浓度，延长孵育时间 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶 检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没含量过低（抗原无效） 转膜不充分,或洗膜过度 过度封闭 一抗失效 二抗受叠氮钠抑制 酶和底物失效 曝光时间过短 细胞传代次数过多，使其蛋使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 白表达模式的分化 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰化、磷查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的酸化、甲基化、烷基化、糖大小 基化等 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 多非特异性条蛋白样本降解 带 新蛋白或同族蛋白的分享查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报同种表位的不同剪接方式 导的细胞株或组织 或条带位置不一抗浓度过高 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 对 二抗浓度过高 降低抗体浓度，增加二抗对照 产生非特异性结合 抗体未纯化 蛋白存在二聚体或多聚体 以增强蛋白质解聚变性 转膜时有气泡或抗体分布背景有白色/黑不均 色斑点 抗体与封闭剂结合 暗片现白条带 一抗或二抗加入过多 目的条带过低/SDS-PAGE胶浓度选择不合过高 适 迁移过快 “微笑”条带 电泳温度过高 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白。 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜 使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物. 延长曝光时间 选择特异性更强，只针对重链的二抗 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min， 过滤封闭剂 稀释抗体的浓度 调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶 降低电泳速度，低温电泳（冷室） 膜没有完全均匀湿透 靶蛋白分子量小于10,000 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 转膜不充分 使用100% methanol浸透膜 选择小孔径的膜，缩短转移时间 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑甲醇浓度过高 制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时转移时间不够Thick gel 间

O

ptimization of secondary antibody dilution for immunodetection of ERK 1 with Immobilon Western

Chemilumin-escent HRP Substrate. Two-fold dilutions of rat liver lysate samples were applied to each gel.

Electroblotted proteins were probed with rabbit anti-ERK 1 antibody (1:1,000 dilution) and HRPconjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000, 1:20,000 and 1:100,000dilutions, left to right).

附录1 WB实验试剂配方

1 Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 (或Triton X-100 )

50 mM Tris, pH 8.0

2 RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate

0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 50 mM Tris, pH 8.0

注：The 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) must be protected from light.

3 Tris-HCl buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5

4 Tris-Triton buffer 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1% Triton X-100 10% glycerol 0.1% SDS

0.5% deoxycholate

All four of these buffers will keep at 4oC for several weeks or for up to a year aliquotted and stored at -20oC.

5 TBS 10x (concentrated TBS) 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl

Mix in 800 ml ultra pure water. pH to 7.6 with pure HCl. Top up to 1 L. TBST

For 1 L: 100 ml of TBS 10x + 900 ml ultra pure water + 1ml Tween20

6 PBS: 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4

附录2 SDS-PAGE胶的配制

一 30% (W/V) Acrylamide 的配制

1称量Acrylamide290g，Bis10 g下列试剂，置于1 L烧杯中 2向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/iw97.html