分子与基因工程-生物技术-复习题讲义

1、简述rRNA在肽链合成中的作用？

功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，形成肽链 2、分别说出5种以上RNA的功能？

mRNA：信使RNA是转录产物，可翻译成多肽链。 tRNA：转运RNA，是用来翻译过程中运输氨基酸。 rRNA:核糖体RNA，构建核糖体的成分。

hRNA：小发卡结构RNA，是生成mRNA的前体RNA，也是在DNA干扰中起作用。 micRNA:反义RNA,对基因的表达起调节作用。

3、基因工程载体的必备条件是什么，列举三种以上的常用载体。

必备条件：a具有对受体细胞的可转移性b具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点c具有较高的外源DNA的装载能力d具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点e具有合适的筛选标记 常用载体：噬菌体，质粒，病毒DNA，噬菌粒

4、什么是报告基因，举例说明报告基因在分子生物学研究中的二种以上的用途？

报告基因: 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

应用：① β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。②cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点。

5、请列举三种以上检测基因表达的方法? 抗药性筛选、营养缺陷型筛选、显色筛选

6、以色氨酸操纵元为例说明衰减子如何控制基因转录？

在trp mRNA 5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区,研究发现,当mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录.因为转录终止发生在这一区域,并且这种终止是被调节的,这个区域就被称为弱化子.

Trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。当培养基中色氨酸的浓度很低时,负载有色氨酸的tRNATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处）,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,所以转录可继续进行,直到将trp操纵子中的结构基因全部转录

7、Southern blotting 和Northern blotting 的实验原理、目的及主要实验步骤。

S：目的：是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。原理：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单练DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。步骤：待测核酸样品的制备→待测DNA样品的电泳分离→凝胶中核酸的（碱）变性→southern印迹→southern杂交→杂交结果检测

N：目的：主要用于分析检测特异性RNA。原理：Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。步骤：RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳→分离得到的RNA转膜→与放射性标记的探针杂交 →结果分析。

8、 “生物进化过程中，最早出现的生物大分子是RNA，而不是DNA和蛋白质，即在进化某个阶段有一个RNA世界”这一观点已被普遍接受，谈谈对这一观点的认识。

最早出现的简单生命体中的生物大分子，应是既具有信息载体功能又具有酶的催化功能，因此，最早的生物大分子。进化之初是\的世界\，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此仅有RNA也足以把早期的进化引向新的阶段。

9、为实现外源基因在原核生物中高效表达，应考虑哪些因素？ 启动子（启动子要有可控性，用启动能力强的启动子） 终止子（用终止作用强的终止子）

核糖体结合位点（用含有与启动子来源相同的核糖体序列结合位点） 密码子（解决密码子的偏爱性）

质粒拷贝数（重组质粒的扩增要可控） 10. 描述DNA滚环复制过程及其特征。

环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成θ样中间物，故又称\θ\型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。但有些环状DNA采用另个一种方式，即滚环复制。例如许多病毒DNA的复制、F因子在接合(conufgation)转移时其DNA的复制，以及许多基因扩增时都采用这种方式。

在以这种机制进行的复制中，亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。这样，DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环复制。由于只有一条DNA链是完整的，因而在DNA解链时不会产生拓扑学上的问题，即未解链的双螺旋区不会产生超螺旋。当5'-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶Ⅲ催化合成冈崎片段。这个过程与前述的DNA滞后链的合成一样。最后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物，并填充间隙构成完整的DNA链。5'端所以能从环上不断解链，主要是由于DNA聚合酶Ⅲ及引发体构成的复制体中的螺旋酶不停的向前移动所致。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态 特点

(1)以亲本链（+链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1； (2)以成环滚环复制产生多个子代RF；

(3)以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。 11．一个基因如何产生两种不同类型的 mRNA分子？

一个基因可以有两种方式产生一种以上的mRNA.第一种是：一个转录初级产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，就能产生一种以上的具有不同3’末端mRNA。第二种是：如果一个初级产物含有几个外显子，发生不同的剪接就会产生多种mRNA.。

12．在一个克隆基因的分析中发现：一个含有转录位点上游3.8kb DNA的克隆，其 mRNA直接转录活性比仅含有3.1kb上游 DNA克隆的转录活性大50倍。这表明了什么？ 在转录位点上游3.8—3.1kb之间有一个增强子。 13.列举原核生物同真核生物转录的差异。

真核生物中编码蛋白质的基因通常是间断的、不连续的,由于转录时内含子和外显子是一起转录的,因而转录产生的信使RNA必须经过加工,将内含子转录部分剪切掉,将外显子转录部分拼接起来,才能成为有功能的成熟的信使RNA.而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子,因此,转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程.

原核生物基因的转录和翻译通常是在同一时间同一地点进行的,即在转录未完成之前翻译便开始进行.如

大肠杆菌乳糖分解代谢过程中,三个结构基因的转录和翻译就是同时在细胞质中进行的.真核生物由于有细胞核,核膜将核质与细胞质分隔开来,因此,转录是在细胞核中进行的,翻译则是在细胞质中进行的.可见,真核生物基因的转录和翻译具有时间和空间上的分隔.上述真核生物基因转录后的剪切、拼接和转移等过程,都需要有调控序列的调控,这种调控作用是原核生物所没有的. 14．简述乳糖操纵子的结构和功能。

①乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.

②阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时,I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处,乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶.所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控.

③CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操④纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶.协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,互相协调、互相制约. 15. 简述遗传密码的兼并性和摆动假设。

遗传密码普遍存在与生物界中，由一种以上的密码子编码同一个氨基酸的现象称为遗传密码的兼并性。 遗传密码的摆动性，密码子与反密码子配对，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。这一现象更常见于密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，二者虽不严格互补，也能相互辨认。tRNA分子组成的特点是有较多稀有碱基，其中次黄嘌呤(inosine, I)常出现于反密码子第一位，也是最常见的摆动现象。

16. 何谓真核生物断裂基因？说明其结构并论述其转录表达的过程及调控。

真核生物的断裂基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。能编码蛋白质的基因称为外显子，不能编码蛋白质的基因称为内含子。 转录表达的过程：

第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；

第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。 第三布核糖体结合到mRNA上，由tRNA携带氨基酸合成多肽链 调控：

转录水平调控：顺式作用元件与反式作用因子相结合进行调控

转录后调控：5端加帽子，3端加PolyA尾。mRNA的选择剪接。RNA干扰现象 翻译水平调控：5端帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控

17. 试述DNA克隆的基本流程，并列举两种阳性克隆筛选的方法。

过程：一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。 筛选方法：1蓝白斑筛选

野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，使菌落呈现蓝色。重组后的大肠杆菌不能产生β-半乳糖苷酶，因此不会产生5-溴-4-靛蓝，菌落成白色。

2抗药性筛选:将抗药性基因与目的基因一同接入到载体中，然后转入受体细胞。在培养基中加入相应的药性物质，能生长的菌株就是含有目的基因的菌落，不含目的基因的菌株不能生长。 18. 简述位点特异性重组的机理

位点特异性重组（site-specific recombination）是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec 系统而是int 等，如噬菌体l 的定点插入。重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上（插入重组）。 19. 简述乳糖操纵子中各种结构元件及其所起的作用。 调节基因，产生阻遏蛋白

启动子，使RNA聚合酶结合到DNA链上并且完成起始反应 操纵基因，控制一个邻近基因或基因群的表达

结构基因y，z，a。分别编码产生β-半乳糖苷酶，半乳糖苷透过酶，半乳糖甘转乙酰酶 20. 简述鸟枪法测序的基本原理和过程。

原理：将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来。 过程：(1).使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段。 (2).再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。

(3).如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。 21. 作为载体应该具备哪些基本条件？

作为运载体必须具有三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于进行筛选。 22. 简述哺乳动物外源基因转入受体细胞的方法。

磷酸钙共沉淀法，电击转化法，脂质体介导法，显微注射法，血影细胞介导法 23. 试论述现阶段生产人胰岛素的方法 答：基因工程法制人的胰岛素 1 A链和B链分别表达法 2 A连和B链同时表达法 3 人胰岛素原表达法

4 分泌型重组人胰岛素表达法

5 以酵母为受体分泌表达人胰岛素，胰岛素基因前端可加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素分泌到周围的培养基中，简化了纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。（P375 基因工程+讲义）

24. 试述细菌适应于外界营养环境的分子调控机制？

答：1 如乳糖操纵子的CＡＭＰ＿ＣＲＰ的正调节，当环境中葡萄糖存在时，细菌直接利用葡萄糖，细菌的ｃＡＭＰ水平低，且CAP以二聚体形式存在；当环境中葡萄糖缺乏时，CAMP升高结合CAP，其CAP－CAMP复合物乳糖启动子上游，诱导DNA90度弯曲，增强RNA聚合酶结合启动子的能力，使转录增强５０倍从而分泌酶加速乳糖分解为葡萄糖，供细胞进行利用。

2 如色氨酸操纵子的阻遏系统，若外界色氨酸量充足，则它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区的DNA紧密结合，使色氨酸表达受阻；若外界的色氨酸供应不足时，则辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区解离，色氨酸操纵子去阻遏，开始表达色氨酸。（P264） 25. 试说明基因组DNA产生重复序列的可能机制。

答：1 复制滑动扩增2 滚环扩增3 不等交换 4 碱基置换突变等 26. 简述原核生物的RNA聚合酶各亚基的功能。

答：σ亚基与RNA聚合酶的四聚体核心(α2ββ')的形成有关;β亚基含有核苷三磷酸的结合位点;β'亚基含有与DNA模板的结合位点;而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，σ因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶(core enzyme)催化。

27. 简述色氨酸衰减子结构及其调控方式。

答：阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始，但阻遏蛋白的DNA结合活性受trp调控，再有高浓度trp存在时，阻遏蛋白色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录。trp生物合成途径被激活。??弱化作用：trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的，大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不行成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子再4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对，行成终止结构，转录停止 28. 简述影响翻译水平高低的因素有哪些？ 答：1、SD序列（核糖体结合位点）被封闭

2、小RNA作用于目标mRNA,使其降解或不能翻译 3、缺少某种氨基酸时,tRNA空载 4、密码子偏爱性

29. 简述原核生物反式作用因子的结构域特征。第六章ppt 反式作用因子含有两种不同的结构域

a.dna结合结构域1螺旋-反转-螺旋2锌指3基域（通常以二聚体结合于dna上0、） b.转录激活结构域（功能域）1酸性激活域2谷酰胺丰富域3脯氨酸丰富域 阻遏域：专一性的直接阻遏的结构域

30. 简述Ⅱ型限制性内切酶的命名方式及特征。ppt11章 属名+种名+株名

Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是： 一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列； 大多数识别序列具有回文结构； 没有甲基化修饰酶功能。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种： 切割产生 5 ' 突出的粘性末端； 切割产生 3 ' 突出的粘性末端； 切割产生平头末端

31.试述利用原核表达载体进行外源基因表达的基本思路及方法步骤。(百度百科) 获得目的基因，

（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

（2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 构建重组表达载体

（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体 获得含重组表达质粒的表达菌种

（1） 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3） 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 32. 试述真核生物基因表达调控的多层次性。ppt第七章

b.滚环形 噬菌体中常见。以亲本链(+链)为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1;以成环滚环复制产生多个子代RF;以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。

c.环（D-loop）型 单向复制的特殊方式。双螺旋的两条链并不同时进行复制，重链先开始复制，稍后轻链再开始复制，当复制沿轻链开始时，重链上产生了D环，随环形轻链复制的进行，D环增大，轻链后亦开始复制，最后两条链完成复制形成两条新的DNA双螺旋。

56. 葡萄糖是如何影响涉及糖代谢的操纵子（葡萄糖敏感型操纵子）的表达？

在缺乏葡萄糖时，cAMP的水平升高，CAP蛋白同每一个葡萄糖敏感操纵子中启动子内的CAP位点结合，转录作用协同起始。如果有葡萄糖，cAMP的．水平下降，CAP蛋白不再结合，转录的速率协同下降。 57. 构建基因表达载体常用的组件有哪些？

启动子（RNA聚合酶的识别部位和结合部位），终止子（终止基因转录过程），以及遗传标记基因（检测受体细胞中是否含有目的基因）、结构基因（负责编码目标蛋白） 、复制原点（保证目的基因在受体细胞中自我复制遗传及表达）

58. 简述原核生物中反式作用因子的结构域特征。 反式作用因子含有两种不同的结构域： 1.DNA结合域：

a.螺旋-转角-螺旋b.锌指结构c.亮氨酸拉链d.螺旋-突环-螺旋 2.转录激活域：

a、酸性激活域b、谷酰胺丰富域c、脯氨酸丰富域

59. 哺乳动物中，从母亲与父亲遗传而来的基因是差异表达的，这种现象的理论基础是什么？

答：在精子或卵子发生过程中一些基因被关闭或者甲基化。IGF-II在卵母细胞中被甲基化，因此遗传于母本的等位基因在后代中不表达。来源于父本的等位基因没有甲基化，客观存在能够表达。其他一些基因只在精母细胞中被甲基化，对这种基因而言，来源于母本的等位基因能表达。 60. 简述基因工程中获取目的基因的方法。

答：1、从基因文库中获取；2、PCR扩增；3、化学方法人工合成。 1、从基因文库中获取需要构建基因文库，构建的方法有： （1）构建基因组文库：直接分离法

（2）构建部分基因文库如cDNA文库：逆转录法

2、PCR扩增是针对目的基因序列未知的情况，可采用PCR扩增。 3、人工合成有两种： （1）逆转录法；

（2）化学方法人工合成；针对目的基因序列已知且较小的情况。

61. 试述如何将将所获得的目的基因插入到表达载体中，并阐述确定获得阳性重组DNA的方法。

答：1（1）先用限制性核酸内切酶切割载体，将载体环切开，然后再用DNA连接酶把所截取的目的基因连接。（2）直接选择法:抗药性标记选择，标志补救，分子杂交法。免疫学方法：化学分析法，酶联免疫检测分析

62. 试述人类基因组计划的科学意义。

答：1． 确定了人类基因组中约2．5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，以及研究基因的产物及其功能。 2． 了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。 3． 从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组成，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

4． 研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。

5． 发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。

6． 研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。 7． 确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。

8． 研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。 63. 简述原核生物DNA复制的基本过程。

DNA的复制分为三个阶段，即复制的起始，延伸和终止。

DNA复制时需要在特定的位点起始，即复制的起始位点，在原核生物中，复制的起始位点通常只有一个。 DNA复制的起始包括预引发和引发两个阶段。在预引发阶段，DNA解旋解链，形成复制叉，引发体组装，引发阶段，在引发酶的催化下以DNA链为模板合成一段短的RNA引物。

复制时DNA链的延伸由DNA聚合酶催化，以亲代DNA链为模板，引发体移动，从5’——3’方向聚合子代DNA链。

当子链延伸达到终止位点时，DNA复制就终止了，切除RNA引物，填补缺口，在DNA连接酶的催化下将相邻的冈崎片段连接起来形成完整的DNA长链。

64. 列出真核生物 m RNA与原核生物m RNA的区别。

1真核生物的mRNA前体在细胞核内合成，合成后需经加工后才成熟为mRNA，从细胞核输入胞浆，起始蛋白质合成；原核生物的mRNA常在合成尚未结束时已开始翻译。

2真核生物mRNA含有m7Gppp形式的“帽子”，有由poly(A)形成的“尾巴”，为单顺反子，只含一条多肽链的遗传信息，合成蛋白质时只有一个合成的启动点，一个合成的终点，而原核生物的mRNA为多顺反子，含有蛋白质合成多个启动点和终止点，且不带有类似“帽子”和“尾巴”的结构， 3在5端方向启动信号的上游存在富含嘌呤的SD区段。真核生物的mRNA则无此区段。

4真核生物的mRNA代谢较慢，哺乳类动物的mRNA的半衰期为4~6h,而细菌的mRNA半衰期仅在1~3min 此外，真核生物的mRNA前体常含有插入序列，即内含子，需要在加工时切除。

65. 简述真核生物DNA水平上的基因表达调控．

DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括基因的丢失、扩增、重排和易位等形式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变他们的活性。

通过形成开放型活性染色质，DNA容易与RNA聚合酶和其他转录调控因子相结合，启动基因的转录。两栖类动物卵母细胞中的灯刷型染色质是染色体充分伸展，活跃转录的状态。

基因扩增是某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因活性调控的一种方式，

基因重排是指将一个基因 从远离启动子的地方移动到距它很近的位点从而启动转录，是调节基因活性的一种方式。

66. 真核生物中端粒的结构特征及其生物学意义?

端粒是真核生物线性染色体末端重要的DNA-蛋白质复合结构，由TTAGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组

成。主要是由六个端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1TIN2、TPP1和Rap1组成的复合体起着保护端粒的作用，被称为是遮蔽蛋白。其中端粒重复序列结合因子TRF1和TRF2是两个主要的端粒结合蛋白，它们通过相互作用来维持端粒的正常结构和功能。

端粒的功能：1、保护染色体末端：真核生物的端粒DNA-蛋白复合物，如帽子一般，保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用。改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡。

2、防止染色体复制时末端丢失：细胞分裂、染色体进行半保留复制时，存在染色体末端丢失的问题。随着细胞的不断分裂，DNA丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式。端粒的存在可以起到缓冲保护的作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构。

3、决定细胞的寿命：染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。 4、固定染色体位置：染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质。 67. 简述基因工程操作过程中所涉及的酶有哪些。

限制性内切酶，DNA连接酶，逆转录酶，DNA聚合酶，DNA解旋酶。 68. 论述RT-PCR反应的原理、过程及应用。 原理

RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 反应过程

1.从细胞或特定组织中提取总RNA； 2.逆转录实验；

3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。 应用

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

69. 请以获得重组人胰岛素为目标，设计一套完整的实施方案。 重组人胰岛素的大肠杆菌工程 1.A链和B链分别表达法：

①基因工程菌的构建策略：化学合成A链和B链的编码序列②表达后处理

2.人胰岛素原表达法：表达产物后处理路线一端第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折叠的原因对胰蛋白酶不敏感

3.A链和B链同时表达法

4.分泌型重组人胰岛素表达法

70请列举可以在线性染色体的末端建立线性复制的三种方式。 1.染色体末端的短重复序列使端粒酶引发非精确复制

2.末端蛋白与模板链的5'端共价结合提供核苷酸游离的3'端 3.通过滚环复制，DNA双链环化后被切开，产生延伸的3'-OH端 71. 解释什么是“套索结构”，在内含子套索中的磷酸二酯键有什么特别之处？

当RNA分子的一端自身回折成环并与其自身的核苷酸形成共价结合时，便形成了一个套索结构。在内含子的套索结构中的磷酸二酯键很少见。因为它是由核苷酸的5’和2’上的碳原子连接起来的。而磷酸二酯

键通常是靠相邻的两个核苷酸的5’和3’ 的碳原子连接起来的。

72．CAP蛋白如何作为乳糖操纵子的正调节物起作用？

AP蛋白如何作为乳糖操纵子的正调节物起作用？答：CAP即cCAM活化蛋白，结合cCAM的CAP可进一步与乳糖操纵子的调控区结合，使RNA聚合酶对该DNA的转录增强。

73.设有一个基因的5’和3’端部分序列如下：ACTGATGCGAGATGCAATGAC????.CTAGTTGAGACCTAGTTC,请设计一对引物，写出其序列，使其扩增产物的5`端加上EcoRI（GAATTC），3`端加上XhoI（CTCGAG）位点，以便用于将其插入到某质粒的对应位点。 5＇—gcgGAATTC ACTGATGCGAGAGATGCAATGAC—3＇ 5＇—cgcCTCGAG GAACTAGGTCTCAACTAG—3＇ 74.简述乳糖操纵子的结构和功能。

一）结构基因 lacZ编码半乳糖苷酶，催化乳糖水解产生半乳糖 化葡萄糖 lacY编码透过酶，将乳糖透过细菌的细胞壁和细胞膜 lacA编码硫代半乳糖苷转乙酰酶，解除过多的半乳糖毒害作用 控制元件 调节基因

75.简述基因工程的基本条件 1、要有用于核酸操作的工具酶 有用于基因工程的载体

3、有用于基因转移的受体菌或细胞

76.论述PCR反应的原理、过程及应用。

PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术,是一种在体外（试管、切片?）扩增核酸的技术.该技术模拟体内天然DNA的复制过程.其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应.每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应.每一循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次,介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）.PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性. PCR技术广泛的应用于遗传性疾病的诊断,传染病病原体的检测、法医学,考古学和分子生物学的各个领域. 77.论述E.coli和真核表达体系各自的优、缺点。

E.col:优点 培养方法简单，迅速，经济而又适合大规模生产工艺，开发较早，经验丰富 缺点：1）缺乏转录后加工机制

2）缺乏适当的翻译后加工机制 3）表达的产物活性不高

真核生物：优点：与E.col的缺点向反

缺点：表达系统操作难，成本高，外源基因导入真核细胞的效率低，染色体上DNA整合的位置及拷贝数不易控制

78.描述Meselson-Stahl实验，说明这一实验加深我们对遗传理解的重要性。 l）实验过程：实验分为两组，

①对照组：将大肠杆菌一直培养在含14N的培养基上生长。这样繁殖出的大肠杆菌DNA分子的碱基中的N都是14N。

②实验组：先将大肠杆菌培养在含15N同位素的培养基上生长。使大肠杆菌DNA分子中的N都成为15N。把含15N的大肠杆菌收集起来，洗去菌体外面的15N，并把它们转移到14N的培养基上生长，繁殖四次。

从实验组的五代大肠杆菌中分别提取DNA，在每分钟四万至五万转的速度下进行密度梯度离心二至三天后，不同重量的DNA分布在离心管中的位置不同

2） （1）双螺旋 复制起点数多（2）大肠杆菌复制一次和复制两次后形成的DNA分子（3）DNA复制是双向的

79.哪些转录因子含有TBP？为什么它们被称为定位因子？请用一个模型解释为什么所有三种RNA聚合酶都能与TBP发生作用？

TBP是聚合酶I因子SL1、聚合酶II因子TFIID和聚合酶III因子TFIIIB的组成成分。所以这些蛋白都能帮组RNA聚合酶定位于起始位点的附近。TBP可能与这三种聚合酶都具有的一个亚基相互作用。 80.简述DNA修复的几种模式 1光修复；通过光修复酶完成

2切除修复 ； 是细胞内最主要的修复方式,主要依赖的俩个重要的酶；DNA聚合酶1和连接酶 3 重组修复:此过程也叫复制后修复。对于DNA双链断裂损伤，细胞必须利用双链断裂修复，即重组修复，通过与姐妹染色单体正常拷贝的同源重组来恢复正确的遗传信息。

4错配修复:可校正DNA复制和重组过程中非同源染色体偶尔出现的DNA碱基错配，错配的碱基可被错配修复酶识别后进行修复

5SOS修复:指DNA受到严重损伤时细胞做出的应激反应。DNA分子严重损伤时，正常的复制和修复系统无法完成DNA的复制，此时会启动应急反应，在无模板DNA 情况下合成酶的诱导修复，故又称为为错误倾向修复。

81. 论述基因工程基本操作程序 (1)目的基因的获取

（2）基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的产物的检测与鉴定 82.简述PCR的用途有哪些？ 1、核酸的基础研究：基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达

8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学 83.简述用于高等哺乳动物细胞基因转移的方法

i)磷酸钙转染技术；(ii)DEAE-葡聚糖转染技术；(iii)聚阳离子-DSMO转染技术；(iv)电穿孔技术；(v)显微注射技术；(Vi)原生质体融合技术。

84. 论述真核细胞和原核细胞在基因转录、翻译及DNA空间结构上存在哪些差异？ 一.转录

1.RNA聚合酶

原核生物的RNA聚合酶是一种多聚体蛋白质（α2ββ'σ）；真核生物的RNA聚合酶有三种（RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），分别转录不同种类的RNA。（你这个题目太大，不展开论述了） 2.转录过程

⑴原核生物的转录过程

转录全过程均需RNA聚合酶催化。

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