烟草丛顶病毒ORF3的功能分析 - 图文

分类号 密级 UDC 编号

硕士学位论文

烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

Functional analysis for the ORF3 of Tobacco bushy top virus

硕士研究生：左瑞娟

指 导 教 师：李 凡 教授 陈海如 教授 申请学位类别：农学硕士 专 业： 植物病理 培 养 学 院 ： 植物保护学院

二O一O年六月

Functional ananlysis for the ORF3 of Tobacco bushy top virus

A Thesis Submitted to Yunnan Agricultural University

In Special Fulfillment of the Requirement for the Master

Degree of Plant Pathology

Candidate: Zuo Ruijuan Supervisor: prof. Li Fan prof.Chen Hairu

College of Plant Protection Yunnan Agricultural University Kunming 650201, P.R. CHINA

June, 2010

烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名： 时间： 年 月 日

关于学位论文使用授权的声明

本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即：云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)

研究生签名： 时间：2010 年 6 月 7 日

导师签名： 时间： 年 月 日

烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

目 录

摘 要........................................................................................................................ 6 ABSTRACT ................................................................................................................... 7 1 引言............................................................................................................................ 9 1.1 烟草丛顶病研究进展 ......................................................................................... 9 1.1.1 烟草丛顶病发生及分布 ..................................................................................... 9 1.1.2 烟草丛顶病症状及传播途径 ............................................................................. 9 1.1.3 烟草丛顶病在中国的危害 ................................................................................. 9 1.1.4 烟草丛顶病病原物归属及其特征 ................................................................... 10 1.1.5 烟草丛顶病的综合防治 ................................................................................... 10 1.2 烟草丛顶病毒研究进展 ................................................................................... 10 1.2.1 烟草丛顶病毒国内外研究进展 ....................................................................... 10 1.2.2 烟草丛顶病毒基因组结构 ............................................................................... 11 1.3 基因功能研究方法 ........................................................................................... 11 1.3.1 基因反义技术 ................................................................................................... 12 1.3.1.1 反义寡核苷酸技术 ........................................................................................ 12 1.3.1.2 反义RNA技术 ............................................................................................. 13 1.3.1.3 核酶技术 ........................................................................................................ 13 1.3.2 RNAi（RNA interference）技术 ...................................................................... 14 1.3.3 基因敲除、嵌入技术 ....................................................................................... 14 1.4 幽影病毒基因功能研究 ...................................................................................... 15 1.4.1 幽影病毒属成员 ............................................................................................... 15 1.4.2 幽影病毒属成员基因组结构 ........................................................................... 15 1.4.3 幽影病毒的ORF1和ORF2功能研究 ........................................................... 16 1.4.4 幽影病毒的ORF3基因功能研究 ................................................................... 17 1.4.5 幽影病毒的ORF4基因功能研究 ................................................................... 18 1.5 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究 ............................................................... 18 1.5.1 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的方法 ................................................... 19

1.5.1.1 病毒载体PVX基因置换........................................................................ 19 1.5.1.2 农杆菌介导重组病毒载体pGR107-ORF3、pGR107-GFP-ORF3 ...... 20 1.5.1.3 免疫胶体金标记...................................................................................... 22 1.5.2 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的意义 ............................................. 23 2 材料与方法.............................................................................................................. 24 2.1 材料 ................................................................................................................... 24

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2.1.1 病毒来源 ........................................................................................................ 24 2.1.2 抗血清 ............................................................................................................ 24 2.1.3 植物材料 ........................................................................................................ 24 2.1.4 菌种及载体 .................................................................................................... 24 2.1 方法 ................................................................................................................... 25 2.2.1 烟草丛顶病毒ORF3基因的克隆及测序 ....................................................... 26

2.2.1.1 烟草丛顶病毒ORF3引物设计和合成 .................................................. 26 2.2.1.2 烟草丛顶病病叶总RNA的提取（MRCgene公司的Tri Reagent） ........ 26 2.2.1.3 RT(cDNA合成)（20μL反应体系）（Promega 公司的M-MLV Reverse Transcriptase） ........................................................................................................... 27 2.2.1.4 PCR（25μL反应体系）（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶） .................... 27 2.2.1.5 PCR产物割胶回收（Axygen公司割胶回收试剂盒） .............................. 27 2.2.1.6 克隆载体pMD18-T与扩增片段ORF3连接（TaKaRa公司的T4连接酶） ..................................................................................................................................... 28 2.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等，2002） ................ 28 2.2.1.8 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等，2002） ............................................ 28 2.2.1.9 重组质粒pMD18-ORF3提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒） ... 28 2.2.1.10 重组质粒pMD18-ORF3的PCR鉴定 ...................................................... 29 2.2.1.11 重组质粒序列测定 ...................................................................................... 29 2.2.1.12 TBTV ORF3序列分析 ................................................................................ 29 2.2.2 pGR107-ORF3载体构建 .................................................................................. 29 2.2.2.1 克隆载体pMD18-T-ORF3及双元载体pGR107 Sal I/Spe I酶切（反应体系20μL）（TaKaRa公司的Sal I/Spe I） ................................................................. 29

2.2.2.2 分别割胶回收目的片段ORF3及缺失cp基因的pGR107载体（Axygen公司割胶回收试剂盒）....................................................................................... 30 2.2.2.3 缺失cp基因的pGR107载体与目的片段ORF3连接 ........................ 30 2.2.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999) ............................... 30 2.2.2.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999) ....................................................... 30 2.2.2.6 pGR107-ORF3质粒提取 ......................................................................... 30 2.2.2.7 PCR检测pGR107-ORF3质粒目的片段 ............................................... 30 2.2.2.8 含重组质粒pGR107-ORF3农杆菌GV3101注射接种本氏烟 ........... 31 2.2.2.9 PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片（R Li et al，2008）............................................................................................................................... 31 2.2.2.10 RT-PCR检测分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)

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植株系统叶片....................................................................................................... 32 2.2.2.11 电镜检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片 ...................... 32 2.2.2.12 Western blot检测检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片总蛋白....................................................................................................................... 32 2.2.2.13 ELISA检测 ............................................................................................ 34 2.2.3 gfp基因的克隆 ........................................................................................... 34 2.2.3.1 gfp基因的扩增 ........................................................................................ 34 2.2.3.2 PCR扩增pGR208载体上的gfp基因（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶）............................................................................................................................... 34 2.2.3.3 PCR产物割胶回收gfp基因（Axygen公司割胶回收试剂盒） ......... 34 2.2.3.4 克隆载体pMD18-T与gfp基因连接（TaKaRa公司的T4连接酶） 35 2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等译，2002） ...... 35 2.2.3.6 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等译，2002）.................................. 35 2.2.3.7 重组质粒pMD18-GFP提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒） 35 2.2.3.8 重组质粒pMD18-GFP的PCR鉴定 ..................................................... 35 2.2.3.9 重组质粒序列测定.................................................................................. 35 2.2.3.10 gfp基因序列分析 .................................................................................. 35 2.2.4 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP载体构建 ............................................. 35

2.2.4.1 pGR107-ORF3、pGR107及pMD18-GFP载体的Sal I/Cla I酶切（Takara的Sal I/Cla I酶切体系） .................................................................................... 35 2.2.4.2 分别割胶回收目的片段gfp及pGR107-ORF3、pGR107酶切后载体片段（Axygen公司割胶回收试剂盒） ................................................................. 36 2.2.4.3 pGR107-ORF3、pGR107载体与gfp基因的T4连接(TaKaRa公司) . 36 2.2.4.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999) ............................... 36 2.2.4.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999) ....................................................... 36 2.2.4.6 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）....................................................................................................... 36 2.2.4.7 PCR检测pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒的gfp基因片段36 2.2.4.8 含重组质粒pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP的农杆菌GV3101注射接种本氏烟....................................................................................................... 36 2.2.4.9 免疫荧光显微镜检测接种pGR107-GFP-ORF3、pGR107-GFP的本氏烟各部位............................................................................................................... 36 2.2.5 免疫胶体金检测烟草丛顶病毒 ....................................................................... 37 2.2.5.1 样品的低温包埋 ............................................................................................ 37

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2.2.5.2 胶体金间接标记（在28℃下进行）..................................................... 37 2.2.5.3 电镜观察免疫胶体金颗粒...................................................................... 37 3 结果与分析.............................................................................................................. 38 3.1 烟草丛顶病毒ORF3的克隆及序列分析 ....................................................... 38 3.1.1 烟草丛顶病毒ORF3的RT-PCR扩增结果 ................................................... 38 3.1.2 TBTV ORF3 RT-PCR割胶回收产物............................................................. 38 3.1.3 重组载体pMD18-ORF3的筛选及鉴定 ...................................................... 39 3.1.4 重组载体pMD18-ORF3序列测定及TBTV ORF3序列分析 ...................... 40 3.2 pGR107-ORF3载体构建及检测 ...................................................................... 40 3.2.1 克隆载体pMD18-ORF3及双元载体pGR107 Sal I/Spe I酶切结果 ............ 41 3.2.2 重组载体pGR107-ORF3的PCR鉴定 .......................................................... 42 3.2.3接种pGR107-ORF3植株系统叶片的PCR检测 ........................................... 44 3.2.4 GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107) 接种植株系统叶片的RT-PCR检测 .............................................................................................................. 45 3.2.5 接种pGR107-ORF3本氏烟发病症状 ............................................................ 45 3.2.6 GV3101(pGR107-ORF3) 接种植株系统叶的电镜检测 ................................ 46 3.2.7pGR107-ORF3接种本氏烟系统叶片总蛋白的Western blot检测 ................. 47 3.2.8 ELISA检测 ....................................................................................................... 50 3.3 gfp基因的克隆及测序 ...................................................................................... 51 3.3.1 PCR扩增pGR208载体上的gfp基因 ............................................................ 52 3.3.2 PCR扩增gfp基因割胶回收 ............................................................................ 52 3.3.3 重组载体pMD18-GFP序列测定及gfp序列分析 ........................................ 53 3.4 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP载体构建 ............................................. 54 3.4.1 双元载体pGR107-ORF3、pGR107与克隆载体pMD18-GFP的 Sal I/Cal I双酶切结果 ................................................................................................................. 55 3.4.2 重组载体pGR107-GFP-ORF3、pGR107-GFP的gfp基因PCR鉴定 ........ 56 3.4.3 菌株GV3101（pGR107-GFP-ORF3）、GV3101(pGR107-GFP)挤压接种本氏烟 ............................................................................................................................. 58 3.5接种GV3101(pGR107-GFP-ORF3)、GV3101（pGR107-GFP）本氏烟的荧光显微镜检测 .............................................................................................................. 58 3.6 TBTV ORF3及ORF4编码蛋白在染病烟株细胞中的免疫胶电镜检测 ...... 62 4 讨论.......................................................................................................................... 66 4.1 病毒载体pGR107-ORF3侵染本氏烟检测 .................................................... 66 4.1.1 GV3101(pGR107-ORF3)接种后的PCR及RT-PCR检测 ............................. 66

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4.1.2 接种GV3101(pGR107-ORF3)本氏烟发病症状 ............................................ 66 4.1.3 电镜检测接种GV3101(pGR107-ORF3)本氏烟系统叶片 ............................ 67 4.1.4 Western blot检测 .............................................................................................. 67 4.1.5 ELISA检测 ....................................................................................................... 68 4.2 病毒载体pGR107-GFP-ORF3侵染本氏烟荧光显微镜检测 ........................ 68 4.3 免疫胶体金检测 ............................................................................................... 68 4.3.1 免疫胶体金的ORF3检测 ............................................................................... 69 4.3.2 免疫胶体金的ORF4检测 ............................................................................... 69 5 结论.......................................................................................................................... 71 5.1 病毒载体pGR107-ORF3侵染本氏烟检测结论 ............................................ 71 5.2 病毒载体pGR107-GFP-ORF3侵染本氏烟荧光显微镜检测结论 ................ 71 5.3 烟草丛顶病发病烟株免疫胶体金检测结论 ................................................... 71 5.4 小结 ................................................................................................................... 71 参考文献...................................................................................................................... 72 附录A：常用化学试剂和分子生物学试剂 .............................................................. 80 附录B： 常用缓冲液的配制及常用仪器设备 ........................................................ 81 致 谢........................................................................................................................ 84

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

摘 要

本文主要对烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus，TBTV）ORF3的功能进行分析，力图探明TBTV ORF3的功能，为TBTV的分子生物学研究及烟草丛顶病的防治提供理论基础。

通过从保山龙陵的烟草丛顶病烟株中提取TBTV RNA，用特异引物RT-PCR扩增TBTV ORF3，克隆测序后，将ORF3连接到双酶切后缺失cp基因的pGR107病毒载体，获得重组病毒pGR107-ORF3。通过农杆菌介导病毒侵染法，将重组病毒pGR107-ORF3转入本氏烟中，运用生物学观察、PCR、RT-PCR、电镜镜检、western blot检测、ELISA检测等手段,综合分析TBTV ORF3的功能。结果发现，pGR107-ORF3侵染本氏烟后表现为斑驳症状，PCR、RT-PCR均可检测到716bp的ORF3片段；而电镜下观察不到pGR107-ORF3病毒粒子，western blot能检测到预期的35KDa蛋白。表明TBTV ORF3可以在接种植物中正常表达，且TBTV ORF3可替代cp基因完成病毒的系统侵染，但ORF3蛋白不具备包裹病毒核酸的功能。

为了进一步观察ORF3在接种本氏烟组织中的分布，在构建好的重组病毒pGR107-ORF3上的多克隆位点插入gfp基因，进一步得到重组病毒pGR107-GFP-ORF3。利用农杆菌介导病毒侵染法，将重组病毒pGR107-GFP-ORF3转入本氏烟，运用荧光电镜观察本氏烟接种叶、系统叶及植株其他部位，可观察到荧光主要分布在叶片、茎部的维管束组织中，从而确定pGR107-GFP-ORF3主要分布在接种本氏烟的维管束组织中，即ORF3与病毒在维管束组织的运输有关，具有帮助病毒进行长距离运输的功能。

通过免疫胶体金标记TBTV ORF3、ORF4抗血清，对TBTV在烟株细胞中进行定位分析。电镜检测显示ORF3、ORF4编码蛋白分布在普通细胞的细胞核、线粒体、叶绿体、细胞质中，而在胞间连丝处只检测到ORF4编码蛋白，在筛管细胞中只检测到ORF3编码蛋白。进一步说明ORF3编码蛋白与TBTV长距离运输相关，ORF4编码蛋白可能与TBTV通过胞间连丝进行胞间移动相关。

关键词：烟草丛顶病毒；ORF3；功能分析；病毒载体pGR107；GFP；Western blot；

荧光电镜检测；免疫胶体金检测

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

Functional analysis for the ORF3 of Tobacco bushy top virus

Zuo Ruijuan(Plant Pathology) Directed by Prof. Li Fan & Prof. Chen Hairu

ABSTRACT

The function of Tobacco bushy top virus (TBTV) ORF3 was analyzed in this thesis for further studies on the molecular biology and disease control.

Total nucleic acids of TBTV were extracted from diseased tobacco plants from Longling, Baoshan city. TBTV ORF3 was then amplified by RT-PCR with the specific primers, the amplified ORF3 fragment was cloned and sequenced. The cp gene of the virus vector pGR107 was replaced by TBTV ORF3 to construct the recombinant pGR107-ORF3. The Recombinant vector pGR107-ORF3 was inoculated to Nicotiana benthamiana by Agrobactertumtumefaciens, and symptomalogy, molecular biology, electron microscopy, and serology were conducted to identify the function about the ORF3 encoded protein. N. benthamiana showed mottleafter inoculated by pGR107-ORF3. The ORF3 expected 716bp band could be detected by PCR、RT-PCR from the inoculated N. benthamiana. No distinct virus virion could be observed from pGR107-ORF3 inouculated plants by electron microscope. And a 35KDa desired ORF3 protein could be detected of by western blot. The results indicated that TBTV ORF3 could complementary fulfill some function of PVX cp gene for virus systemic infection in the plant.

The distribution of ORF3 encoded protein in infected N. benthamiana was analyzed with the help of the recombinant vector of pGR107-GFP-ORF3, which was constructed by the gfp gene from pGR208 vector with pGR107-ORF3. The Recombinant virus vector of pGR107-GFP-ORF3 was inoculated to N. benthamiana by Agroinfection. The green fluorescence could be detected from vascular bundle of leaves and stem when local leaves, system leaves and other plant parts were tested by fluorescence electron microscope. The results revealed that TBTV ORF3 product distributed in vascular system of the infected plant, and it played important role for virus long distance transportation in the plant.

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The distribution of the ORF3 and ORF4 encoded proteins were attemptted to analyze by immunogold labeling with the antiserums of TBTV ORF3, ORF4 protein in the cells of tobacco bushy top diseased plants. Most of the gold particles could be detected in nucleuses, plastosome, chloroplast, cytoplasm of ordinary cells. However, only ORF4 protein located in plasmodesma and only ORF3 protein located in sieve tube cells. These further illuminated that ORF3 protein was involveed in the virus long distance transportation, and ORF4 might be relate to virus cell-to-cell movement.

Key words: TBTV; ORF3; Functional analysis; pGR107 virus vector; GFP;Western bolt; Fluorescence electron microscope; immunogold labeling technique

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1 引言

烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus，TBTV）是一种单分体线型+ssRNA（positive sense single-stranded RNA）病毒，是引起烟草丛顶病（Tobacco bushy top disease）的病原物之一（Murant A F et al，1995；Van Regenmortel M H V et al，2000；Mo X H et al，2002）。2005年ICTV（International Committee on Taxonomy of Viruses）第八次病毒分类报告已将TBTV归为幽影病毒属（Umbravirus）成员（Taliansky M E et al，2005）。

1.1 烟草丛顶病研究进展 1.1.1 烟草丛顶病发生及分布

烟草丛顶病最早发生在津巴布韦，以后在其邻国南非、马拉维、赞比亚等南部非洲国家，以及亚洲的巴基斯坦、泰国和中国的云南发现（Ndowora T，2002；杨程，2003；Blancard D et al，1999；顾刚等，1994）。1993年，烟草丛顶病首次在云南保山爆发，随后于1996年和1998年在云南金沙江、怒江、澜沧江三江流域烟区再度爆发，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉溪、红河、思茅、文山、西双版纳及怒江等州市也有烟草丛顶病零星发生（顾刚等，1994；李凡，1999；李凡等，2005）。

1.1.2 烟草丛顶病症状及传播途径

烟草丛顶病感病烟株叶色淡绿或黄化，并伴有系统坏死枯斑或坏死线纹，苗期感病烟株严重矮化、缩顶，叶片变小，而晚期感病的烟株腋芽过度增生，株型成为密生小叶、小枝的丛枝状塔型（李凡等，2005）。

烟草丛顶病可以通过汁液摩擦、菟丝子、嫁接及蚜虫传播，不经病土、病残体和种子等途径传染，摩擦接种发病的烟株不能再经蚜虫传播，自然条件下以蚜虫传播方式进行传毒（李凡等，2001；钱宁刚，2003；段玉琪等，2003）。

1.1.3 烟草丛顶病在中国的危害

1993年烟草丛顶病在云南保山发病面积达7300hm2，1996年和1998年在云南省金沙江、怒江、澜沧江三江流域烟区再度大规模流行，部分烟区造成毁灭性

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灾害。截至2001年，云南省累计发病面积达51300hm2，其中8700 hm2绝收，1400 hm2改种，直接经济损失高达2.1亿元，烟草丛顶病已成为云南省20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害（李凡等，2005；秦西云，2005）。

1.1.4 烟草丛顶病病原物归属及其特征

烟草丛顶病由幽影病毒属（Umbravirus）的烟草丛顶病毒及黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus，TVDV）复合侵染引起（Gates et al，1962；李凡等，2002；Taliansky M E et al，2005；Darcy C J et al，2005）。烟草丛顶病是中国报道的唯一一个由幽影病毒属成员引起的病害，且目前在中国仅云南有发现（李凡等，2006）。

幽影病毒基因组不含编码外壳蛋白的基因，在感病植株体内不形成病毒的粒体结构（Taliansky M E et al，2003）。黄症病毒含有cp（coat protein）基因，其外壳蛋白具有异源包裹幽影病毒RNA的能力，形成可以被蚜虫传播的杂合病毒颗粒(Waterhouse P M et al，1983；Falk B W et al，1979；Murant A F，1990；李凡等，2006)。幽影病毒可以通过机械接种传播，自然条件下单独的幽影病毒不能通过蚜虫传播，但在其辅助病毒——黄症病毒外壳蛋白包裹下可以通过蚜虫传播（李凡等，2006）。

1.1.5 烟草丛顶病的综合防治

烟草丛顶病的综合防治采取“预防为主，治(避)虫防病”为中心的措施，以防治媒介昆虫、培育无毒烟苗和控制大田流行为主，其次从保健栽培及淘汰病苗方面入手，通过控制传播源、切断传播途径和增强烟株抗病性以达到有效防治病害的目的（杨程，2003；李凡等，2006）。

1.2 烟草丛顶病毒研究进展

1.2.1 烟草丛顶病毒国内外研究进展

国外除对烟草丛顶病的发生做报道外，仅限于症状学、传播途径和病原物寄主范围的描述，并未对烟草丛顶病毒进行深入研究（李凡等，2005），而国内对烟草丛顶病毒分子生物学进行了系统的研究。

2002年，Mo等人认为云南发生的烟草丛枝型病害在症状、传播方式、寄主范围等方面与津巴布韦发生的烟草丛顶病是同一种病害（Mo X H et al，2002）。其后李凡等人又对烟草丛顶病毒的复制酶（RNA-dependent RNA polymerase，

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RdRp）基因进行了克隆及测序，确定了烟草丛顶病毒是一类与幽影病毒属相关的病毒（李凡等，2002）。2003年，Mo等人通过cDNA克隆的方法，从TBTV的dsRNA1中得到了烟草丛顶病毒中国分离物（TBTV-Ch）基因组全长序列（Mo X H et al，2003）。2005年ICTV的第八次病毒分类报告，已将TBTV归为幽影病毒属的确定成员（Taliansky et al，2005）。2006年，王钰丽对与烟草丛顶病相关的dsRNA及卫星RNA开展了研究，说明了TBTV的类似卫星RNA不同分离物间的序列同源性与地理位置有一定的联系，TBTV的类似卫星RNA可能存在4个小的开放阅读框架（Open Reading Frame，ORF），其中ORF I会形成一个由44个核苷酸组成的稳定发卡结构（王钰丽，2006）。2008年，魏薇通过重叠延伸PCR法成功的扩增到TBTV云南大理巍山和保山龙陵两个分离物的全长基因组cDNA，并构建了TBTV的全长cDNA侵染性克隆（魏薇，2008）。2009年，龙亚芹完成了烟草丛顶病毒ORF3和ORF4的原核表达并对表达产物进行了其抗血清的制备（龙亚芹，2009）。

1.2.2 烟草丛顶病毒基因组结构

2003年，Mo等人获得了TBTV中国分离物的全基因组，基因组序列长4152个核苷酸，由4个ORF组成，分别为 ORF1、ORF2、ORF3及ORF4，它的5‘端和3‘端有长度分别为10个核苷酸和645个核苷酸的非翻译区（Mo X H et al，2003）。目前未见有关烟草丛顶病毒各个ORF基因功能研究的报道。

图1-1 TBTV的基因组结构（Mo et al，2003） Fig.1-1 Genome organization and structure of TBTV

1.3 基因功能研究方法

21世纪初当人类基因组计划完成，随后后基因组时代到来。后基因组学主要研究基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制。基因的功能研究有很多方法，按研究手段可分为比较分析与实验分析两类。比较分析基因功能的方法有生物信息学技术、基因芯片技术、蛋白质组学技术等；实验分析基因功能的方法有基因反义技术、RNAi技术、基因敲除技术、基因嵌入技术等。

生物信息学技术是通过对未知基因测序，并在美国的基因库(Gene Sequence Data Bank，GenBank)、基因组序列数据库(Gene Sequence Data Bank，GSDB)、

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

欧洲的分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory，EMBL)和日本的DNA数据库(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)中获得更多相似基因序列。再将这些序列通过序列分析比较工具(如BLASTn、BLASTx)进行比较分析，与基因序列资料中各类信息进行识别和比较，并得到序列之间的进化关系，初步确定基因序列结构和功能的关系（杜玉梅等，2008）。

生物芯片(biochip)是指芯片技术在生物学领域中应用的总称。该技术是20世纪90年代初半导体技术和生物技术的结合体，是通过缩微技术根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测（郭葆玉，2001）。以基因芯片技术(gene chips) 为例，基因芯片技术是利用核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的一种高新生物技术（李新枝等，2007）。基因芯片技术的原理是将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签等)按横行纵列方式在固相支持物上有序点样。检测时，先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA作为模板，以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA，再用所得cDNA与基因芯片进行杂交（杜玉梅等，2008；赵寿元，2001），通过计算机对其结果进行判读和处理，检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平丰度的变化，这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达，哪些基因不表达；同样也可以测知哪些基因的表达水平高，哪些基因的表达水平低，研究基因功能和表达调控的相关性，最终为研究基因的功能和基因遗传网络提供有力的证据（郭葆玉，2001）。

蛋白质组学技术是运用双向电泳、生物质谱、蛋白芯片、蛋白杂交、酵母双杂交系统、生物信息学等蛋白质组学的各种实验技术研究基因组所表达的全部蛋白质，鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等（Diane G，2005；蔡冬冬等，2009）。

以下重点介绍几种植物及其病原物基因功能研究方法。

1.3.1 基因反义技术

反义技术是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段(或其修饰产物)来抑制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(Antisense oligonuclerotides，ASON)、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术（纪宗玲等，2002）。

1.3.1.1 反义寡核苷酸技术

反义寡核苷酸技术就是指人工合成能与DNA或RNA互补结合特异的寡核

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

(nuclear shuttle protein)或者ORF3蛋白与寄主植物的细胞因子共同参与了核的穿梭（Ryabov E V et al，1998）。

1.4.5 幽影病毒的ORF4基因功能研究

幽影病毒的ORF4编码产物在PEMV-2、CMoMV、GRV和TBTV间有43.4%-62.8%的相似性（Ryabov E V et al，1999；Nurkiyanova K M et al，2001；Ryabov E V et al，1999）。Taliansky等发现GRV的ORF4 基因产物的氨基酸序列同黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒的3a-MP（该蛋白31kDa，同CP一起执行CMV的细胞间运动）具有序列相似性（Taliansky M E et al，2003），故推测GRV的ORF4产物为GRV的 MP。Ryabov等发现融合了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的GRV的ORF4蛋白主要集中在侵染细胞与其附近细胞相连的胞间连丝内，同时还发现GRV的ORF4蛋白还能够代替PVX的MP行使病毒的细胞间运动（Ryabov E V et al，1998）。Ryabov等用GRV的ORF4 代替CMV的3a-MP和CP，发现重组病毒可以在侵染寄主的细胞间传播，而融合了GFP的ORF4产物集中在侵染细胞间的胞间连丝内 （Ryabov E V et al，1999)。Nurkiyanova等以GRV的ORF4分别代替TMV、PVX的MP编码区并插入GFP基因作报告基因构建了侵染性克隆表达载体，将重组病毒转入本氏烟原生质体内，发现GRV ORF4产物能够在原生质体表面形成管状结构，这一特性也是某些植物病毒MP所具有的性质；他们在大肠杆菌中表达了GRV ORF4编码的蛋白，进行RNA结合能力的测试，发现GRV ORF4编码的蛋白能够同GRV RNA相互作用形成复合体，同其它病毒MP与病毒RNA形成的复合体相比，结构较松散、复合体中蛋白比例较低（Nurkiyanova K M et al，2001）。由此证明了幽影病毒的ORF4 编码的蛋白可能是该类病毒执行病毒细胞间运动的功能蛋白。

1.5 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究

由于幽影病毒属成员基因组无编码外壳蛋白的基因这一特殊性，对基因功能研究带来了新的挑战。对幽影病毒其它成员的研究表明，幽影病毒的ORF3编码蛋白具有帮助病毒进行长距离运输(1ong—distance movement)以及延长病毒RNA稳定性的功能（Ryabov E V，1999；Ryabov E V，2001），同时ORF3蛋白还是一个细胞核的穿梭蛋白(nuclear shuttle protein)，可能在病毒RNA的复制中起一定的作用（Ryabov E V，1998）。因此，幽影病毒虽然不编码外壳蛋白，但其ORF3蛋白除了不具备结构蛋白的功能外，可能具有其它病毒CP所具有的某些相似功能（李凡等，2005）。根据幽影属中研究最为全面的花生丛簇病毒ORF3研究的启示，本论文采用了多种基因功能研究的方法相结合来研究烟草丛顶病毒ORF3基因功能。

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

1.5.1 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的方法 1.5.1.1 病毒载体PVX基因置换

利用病毒载体在植物体内表达某一外源基因，通过植株表型的变化来了解基因的功能。目前已构建多种病毒载体，常用的病毒载体有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus，TGMV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、大麦条状花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)、甘蓝曲叶病毒(Cabbage leafcurl viurs，CbLCV)、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）和雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）等(Burch-Smith T M et al，2004；王宏芝等2005)。

其中PVX是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员，其病毒粒子为易弯曲的杆状颗粒，大小约为13nm × 515nm。其寄主范围广，系统侵染的主要是茄科植物，受侵染寄主的叶片呈花叶症状。PVX基因组是单组分+ssRNA，长度约为6.4kb，包括5个ORF(Doronin S V et al，1996； Huisman M J et al，1988)。ORF1编码165kDa RNA聚合酶，是RNA合成所必需的唯一一个来源于病毒的蛋白质；ORF2-ORF4三个基因互相重叠，称为三基因区段(Triple gene block，TGB)，分别编码25kDa、12kDa、8kDa蛋白，这些蛋白与病毒在细胞间的移动有关， 称为移动蛋白(movement protein，MP)；其中25kDa蛋白已经被证明是一种转录后基因沉默的抑制因子，打破寄主植物的防御反应使病毒成功侵染(Carrington J C et al，2001)。ORF5编码PVX 的25kDa外壳蛋白(coat protein，CP)亚基，除了包装核酸外，还是病毒细胞间移动所必须的，并且在复制调节上也起重要作用(Chapman S et al，1992)。

图1 -3 PVX基因组结构(以CP株系为例)（引自曲静等，2003） Fig1-3 Genomic organization of PVXcp（from Qu Jing et al，2003）

PVX作为表达载体具有转化途径简单、可迅速得到高拷贝的外源基因等优

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

点。因此近年来无论在基础研究还是应用研究上都得到了广泛的重视。载体的构建主要采用基因插入（Chapman S et al，1992）和融合蛋白（O‘Brien G J et al，2000）的策略。采用基因插入策略时，在病毒CP强启动子之后插入外源基因，依赖于CP强启动子来指导外源基因的表达。采用融合蛋白策略时，在CP基因前插入外源基因和通读序列，利用CP能够与外源蛋白形成融合蛋白的特点，使得病毒在组装的时候，巧妙的将目的蛋白呈现在病毒粒子的表面（曲静等，2003）。

PVX作为载体的应用已经有很多成功的例子，它介导的外源基因表达可以被转基因植物中的共抑制现象所抑制，用PVX做载体进行这方面的实验有助于了解转基因沉默的机制和RNA介导的病毒抗性。例如，将gfp基因插入重复的PVX CP启动子之间，转化转gfp基因的植株，使之发生基因沉默（Thomas C L et al，2001）。PVX载体还可应用于病原物与植物的互作研究。例如，用PVX做载体将真菌的无毒基因Avr9和卵菌的无毒基因infi导入烟草中， 引起烟草对PVX 的HR反应，证明真菌或卵菌的激发子由一个不相关的病原来表达时，也能激发植物的防卫反应，从而说明基因对基因互作能转移到不同的病理体系(Kamoun S et al，1999)。

本文选用由英国John Innes Center的Baulcombe教授实验室开发的当前国内外普遍应用的PVX载体系统中的pGR107载体，其载体上CP基因前有一个强CP启动子，保证了cp基因在植物体内的表达。通过将TBTV的ORF3置换pGR107载体的cp基因，分别构建pGR107-ORF3和pGR107-GFP-ORF3重组病毒载体，根据重组病毒载体pGR107-ORF3和pGR107-GFP-ORF3及野生型pGR107病毒载体侵染植物后的表型及病毒核酸和蛋白检测结果，来研究ORF3基因的功能。

1.5.1.2 农杆菌介导重组病毒载体pGR107-ORF3、pGR107-GFP-ORF3

农杆菌(Agrobacterium)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A．rhizogenes)，能侵染植物的受伤部位，导致冠瘿瘤(Crown gal1)和毛状根的发生(李淑萍，2005)。1974年，Zeanen等从根癌农杆菌中分离出一巨型质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid)，简称Ti质粒，在发根农杆菌中则存在Ri质粒(Root-inducing plasmid) ( Zambryski P C，1992)。随后在Ti(或Ri)质粒上发现有可整合到植物基因组中的农杆菌质粒DNA片段，命名为转移DNA(Transfer DNA)，简称T-DNA。T-DNA内部有致瘤和冠瘿碱(Opines)形成等有关基因（Chilton M D et al，1977）。

Ti质粒上除含有可转移DNA (T-DNA)区，还含有毒性区(Vir区)，结合转移区(Con区)和复制起始区(Ori区)4部分，其中与冠瘿瘤生成有关的是vir区和T-DNA。T-DNA 区在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中，使其携带的基因在植物中表达，T-DNA两端是25 bp的重复序列，是转移识别的唯一信号，分为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

因。vir区用于编码T-DNA加工，转移及整合的功能蛋白，该毒性区含有多个位点，如 VirA，VirB，VirC，VirD，VirE，VirF，VirG，VirH等，每个位点包括1到11个开放阅读框。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面，随后VirA 的蛋白感受植物受伤细胞产生的信号(酚类化合物，糖类等)，自身发生磷酸化，磷酸化的VirA蛋白将磷酸基转移到VirG蛋白保守的天冬氨酸残基上，使VirG蛋白活化，从而激活其它vir基因的转录；其中，VirD基因产物对T-DNA进行剪切，产生T-DNA单链，T-DNA 单链与VirD2及VirE2结合成T链复合物，T链复合物被转移到农杆菌外，通过植物细胞壁上由VirB蛋白组成的通道进入植物细胞内，VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别，经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内，在VirD2的帮助下，T-DNA 以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上，完成T-DNA 由农杆菌向植物的转移及整合过程（徐春晖等，2002）。研究表明T-DNA 优先整合到转录活跃区，而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区，T-DNA的整合频率也比较高（Zambryski P C，1992）。

1993年瑞士科学家Rossi等以烟草幼苗为转化受体创建了农杆菌真空渗透瞬间表达体系。他们将带有重组质粒的农杆菌经诱导后，通过抽真空渗透入植物幼苗中，2-3d后即可检测到重组蛋白的瞬间表达（Raineri D M et al，1993）。Kapila等在菜豆叶片中也建立了高效的农杆菌真空渗透瞬间表达体系。同时对农杆菌渗透后的叶片组织横切面的电镜观察发现，真空渗透只使得农杆菌进入到细胞间隙内并与内层细胞紧密接触，而有利于T-DNA的转移，但它并没有破坏植物细胞壁。农杆菌T-DNA的转移还有赖于Vir区基因表达的特异性蛋白的作用（Kapila J et al，1997；Bohon G et al，1986）。在此基础上，Yang等利用针管注射法代替真空渗透，将农杆菌渗入烟草活体植株叶片上，成功进行农杆菌介导的基因瞬间表达检测(Yang Y N et al，2000)。后来，Spolaore等利用针管注射法在成熟水果中作外源蛋白的瞬间表达分析，在所实验的各种水果(苹果、梨、桃、橘子、草莓和番茄)中都成功地表达出了GUS蛋白（Spolaore S et al，2001）。现将真空渗透和针管注射两种农杆菌渗入法所进行的基因瞬间表达技术体系统称为农杆菌渗入（Agroinfihration）系统。目前已在很多植物上成功地建立Agroinfiltration系统，如烟草、拟南芥、菜豆、番茄、胡椒、长春花、柠檬、莴苣和酸樱桃等，并且已广泛应用于外源基因功能与细胞定位分析、启动子分析、基因沉默、生产重组蛋白等多个领域（于翠梅等，2007）。

在Ti质粒转化到植物体内存在两种整合方法（刘巧泉等，1998）：共整合载体(co-integrative vector)法是使用无毒的Ti质粒作供体载体，因此又称为 one-载体法。在供体载体中己经缺失的T-DNA 区段，由一段pBR322DNA所取代，供

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

体质粒的主要功能是提供Vir区的用于T-DNA转移的一些功能。外源基因必须先克隆在 pBR322 质粒或其衍生质粒上，作为中间载体，然后通过二者相同的pBR322序列发生同源重组形成质粒共合体；双元载体(binary vector)法的基本特点是由两个彼此相容的Ti质粒构成，一个是辅助质粒，包含 T-DNA 转移必需的Vir区片段，另一个是穿梭小质粒，其含有T-DNA区段。穿梭载体由于分子量小，它能够在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制，并能够从大肠杆菌转移到根癌农杆菌中，易于进行一般的遗传操作，容易将任何待研究的外源DNA插入到其T-DNA区段。双元载体系统的优点在于它不需要构建质粒共合体，系统的两个质粒不需要有同源区，为质粒的构建提供了方便。

农杆菌介导的病毒侵染(Agrobactertum-mediated virus infection，Agroinfection)方法，是指农杆菌Ti／Ri质粒载体将病毒或类病毒的核酸导入植物并形成侵染的过程(Dasgupta I et al，1991；Grimsley N H et al，1987)，它是由Grimsley建立的，其原理是农杆菌Ti／Ri质粒上的T-DNA区能将插在其中的病毒或类病毒基因组转移整合到植物细胞中并表达出来。然后通过下面的两种方法之一导致转化植物的系统感染：(1)含有一个以上完整的病毒基因组串联插入T-DNA中后，重复的病毒基因组发生同源重组产生环状和完整的病毒DNA或通过T-DNA 的复制产生完整的病毒粒子，从而在受体植株中发展成为系统侵染；(2)通过整合过程，即携带完整病毒基因的T-DNA整合到植物细胞中，转化的细胞增殖并分化形成转基因植株，其每个细胞的DNA都携带有病毒的基因，随着植物基因组的复制转录，病毒基因脱离植物基因组而产生具有活性的病毒粒子，从而完成病毒侵染植物的过程(施骏等l993)。

本文选用农杆菌GV3101（含辅助质粒pJIC Sa-rep），其中pJIC Sa-rep的作用是保证PVX及其衍生的病毒载体在农杆菌中顺利复制（王宏芝，2007）。利用pJIC Sa-rep——Ti质粒转化到植物体内的双元载体法将病毒载体pGR107在辅助质粒pJIC Sa-rep的帮助下，完成农杆菌介导病毒载体pGR107在烟草植株中的侵染。

1.5.1.3 免疫胶体金标记

1971年，Faulk和Taylor首次将胶体金用于电子显微镜作为免疫染色标记（Faulk W P et al，1971），随后免疫胶体金标记广泛应用于细胞生物学、微生物学、病毒学等领域的研究。1983年，Lin等人将胶体金技术成功地应用到植物病毒检测，他们将免疫胶体金标记在超薄切片上定位植物病毒（Lin N S et al，1983）。目前已有多种植物病毒运用了该技术进行了检测、研究。1987年，Lin等人又用免疫胶体金标记了马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus，PYDV）结构蛋白，发现染病细胞核核质中积累了大量的结构蛋白（Lin N S et al，1987）。除了结构蛋白被标记外，还有大量植物病毒的移动蛋白等被标记。

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

免疫胶体金标记的原理是病毒经兔抗血清修饰处理，再用结合有胶体金颗粒的羊抗兔IgG标记，以吸附于病毒周围的金颗粒为指示物，鉴别病毒与抗血清的反应（陈剑平等，1993）。

本文利用已制备保存的TBTV ORF3及ORF4多克隆兔抗血清及结合胶体金标记的羊抗兔IgG检测TBTV发病烟草超薄切片，通过金颗粒在TBTV发病烟草细胞中的位置，完成TBTV ORF3及ORF4的细胞定位。

1.5.2 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的意义

幽影病毒与其它植物病毒的不同之处在于，这类病毒的基因组不含编码外壳蛋白(coat protein，CP)的基因，在感病植株体内不形成病毒粒体结构。自然条件下，幽影病毒感染的植物体内常常发现有黄症病毒复合侵染，幽影病毒必须依靠黄症病毒进行蚜虫传播。幽影病毒属病毒目前在我国仅有TBTV方面的报道，由TBTV和TVDV复合侵染引起的烟草丛顶病也是目前国内报道的唯一一个由幽影病毒属成员引起的病害（李凡，2006）。

近年来，烟草丛顶病在我国云南局部地区的流行危害，给当地经济发展造成了严重损失。但由于其病原物——烟草丛顶病毒无编码外壳的基因特殊性，国外仅限于其症状学、传播途径和病原物寄主范围的描述，而对分子生物学研究尚未开展；自21世纪以来国内对烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒分子生物学的研究，已取得了很大的进展，已获得TBTV全长基因组。但TBTV 各个ORF的功能为见研究报道，对TBTV各个ORF的功能进行分析，探明TBTV的各个ORF功能及病毒在寄主体内增殖、移动以及致病的分子机理，可为TBTV的深入研究及其病害防治提供基础分子生物学依据。

虽然目前基因功能研究已成为热点，但仍存在很多困难。据幽影病毒属病毒间的序列分析及比较，推测TBTV ORF3编码蛋白具有CP基因辅助病毒粒子完成长距离运输的功能，开展对TBTV ORF3基因功能的分析，有利于明确TBTV在寄主植物体内的扩散机制，这对阻断病毒在侵染寄主后的扩散及防治能提供理论基础；对TBTV其他ORF的功能分析能提供良好的依据。

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病毒来源

烟草丛顶病样品采自云南省保山市龙陵县，由云南省烟草科学研究所的莫笑晗副研究员馈赠，通过介体蚜虫取食发病烟叶获毒后，取食健康烟叶将烟草丛顶病毒传代保存于云南农业大学温室内。

2.1.2 抗血清

TBTV ORF3及TBTV ORF4抗血清由龙亚芹制备保存。

2.1.3 植物材料

本氏烟，转GFP本氏烟由华南农业大学李华平老师馈赠。

2.1.4 菌种及载体

Escherichia Coli DH5ａ菌株为本实验室保存；GV3101(pJIC Sa-rep)由浙江大学周雪平教授惠赠；pMD18-T载体购自大连宝生物生物工程公司；pGR107载体、pGR208载体由华南农业大学李华平教授馈赠；BL21（pET28a-ORF3）菌株由本实验室龙亚芹提供。

图2-1 pMD18-T克隆载体图谱及多克隆位点序列 Fig.2-1 Map and multiple cloning sequence of pMD18-T vector

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

MCS: Smal I

ATCGATT CCCGGG TCGACCGC CGATAAG Cal I SalＩ

图2-2 pGR107双元载体图谱及多克隆位点序列 Fig2-2 Map and multiple cloning sequence of pGR107 vector

2.1 方法

pGR107-ORF3载体构建技术路线： 提取烟草丛顶病染病烟株总RNA及RT-PCR扩增ORF3序列 连接 pGR107-ORF3 25

根据TBTV全序列及pGR107载体设计带酶切位点Sal I/Spel I的ORF3特异引物 ORF3序列插入克隆载体pMD18-T pMD18-ORF3的克隆及测序 Sal I/Spe I酶切 pGR107载体 ORF3 pGR107载体 烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

pGR107-GFP及pGR107-GFP-ORF3载体构建技术路线： pGR107-GFP pGR107-GFP-ORF3 pGR107 连接 gfp 连接 pGR107-ORF3 Cal I/Sal I酶切 pGR107 pMD18-GFP的克隆及测序 pGR107-ORF3 gfp基因序列插入克隆载体pMD18-T 从pGR208载体上PCR扩增gfp基因 根据pGR208及pGR107载体设计带酶切位点Cal I/Sal I的gfp特异引物 2.2.1 烟草丛顶病毒ORF3基因的克隆及测序 2.2.1.1 烟草丛顶病毒ORF3引物设计和合成

根据Mo所登录（Mo et al，2003）的TBTV基因组全序列（AF402620）及pGR107载体cp基因两端的酶切位点Sal I/Spe I，设计TBTV ORF3带有酶切位点Sal I/Spe I的特异引物对PTB3F/ PTB3R（由上海生工合成），该引物扩增的目的条带为714bp。引物序列如下：

PTB3F：ACGCGTCGACATGTCTACGATCATAAATGT PTB3R：GACTAGTTCACCACTTGTTGGTGGT 2.2.1.2 烟草丛顶病病叶总RNA的提取（MRCgene公司的Tri Reagent）

称取50-100mg病叶加入1mL Trizol充分研磨，转入1.5mL离心管中静止

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

3-5min；加入200μL氯仿，充分混匀后静止2-3min，12,000rpm离心5min后取上清；加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，12,000rpm离心15min后弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用20-25μLDEPC处理的ddH2O充分悬浮，-20℃保存备用。

2.2.1.3 RT(cDNA合成)（20μL反应体系）（Promega 公司的M-MLV Reverse Transcriptase）

PCR管（所用试剂器皿均需作无RNA酶处理）中加入2μL RNA模板，1μL PTB3R(引物浓度20um)，10.375μL DEPC水。于70℃水浴5min，然后迅速置于冰上。在加入3μL M-MLV 5×Reaction Buffer，5μL dNTP（10mM），0.625μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，1μL M-MLVRT。42℃，60min取出后放在冰上，或-20℃备用。

2.2.1.4 PCR（25μL反应体系）（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶）

在PCR管中加入2μL 10×Buffer，0.5μL dNTP Mixture，0.5μL cDNA，0.5μL PTB3F，0.5μL PTB3R，20.25μL ddH20，0.25μL Taqmes，混匀。PCR管置于PCR仪中，设定循环体系，预变性94℃ 4min，变性94℃ 1min，退火55℃ 1min，延伸72℃ 2min，终延伸72℃ 10min，30个循环。反应结束后取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。其余样品-20℃保存备用。

2.2.1.5 PCR产物割胶回收（Axygen公司割胶回收试剂盒）

在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎、计算凝胶的重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量做为一个凝胶体积（100mg=100μL体积）；加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化；加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B混合均匀；吸取混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min弃滤液；将制备管放回离心管加入0.5mL Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；将制备管置回离心管，加入0.7mL Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液再重复此操作一次；制备管置于2mL离心管中，12000rpm离心1min；制备管置于洁净1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μL水或Eluent，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

2.2.1.6 克隆载体pMD18-T与扩增片段ORF3连接（TaKaRa公司的T4连接酶）

利用pMD18-T载体进行T/A连接，构建重组质粒。电泳确定回收产物的纯度和浓度后，按 TaKaRa公司的操作说明，其连接体系为10μL，在20μL PCR管中加入4μL回收纯化DNA，1μL pMD18-T载体，5μL Ligation solution I混和均匀后，16 ℃水浴4h。

2.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等，2002）

接种-80℃长期保存的菌株DH5α到5mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜(12 h左右)；按1：100稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37 ℃摇床培养2 h；取出菌液置冰上10 min，将冰冷的菌液1 mL管分装到1.5 mL的eppendorf管，8000 rpm离心1 min，弃上清；沉淀用200 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮，冰浴30 min后离心，8000 rpm离心1 min，弃上清，沉淀再用100 μL 0.1 mol/L CaCl2重悬浮，冰浴放置6-8 h备用，24 h内可用转化效率逐渐减小。

2.2.1.8 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等，2002）

将制备好的感受态细胞置于冰上；将10 μL连接产物加到100 μL感受态细胞中混匀；将混合物置于冰上30min，然后在42℃水浴热击90s，立即转移到冰上5min；加入890μL冰预冷的LB培养液（不含抗生素），混匀；37℃,120 rpm，培养1h 后4000rpm离心5min；吸取800μL上清液，将剩下的200μL涂在含含氨卞青霉素（50-100 μg/mL）的LB平板上，涂板时加入4μL IPTG( 200mg/mL)(异丙基-β-硫代半乳糖苷)和40μL X-Gal(20mg/mL) (5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)，放置30 min；倒置培养皿，37℃培养14-18 h；根据蓝白斑筛选，初步挑选白色的单菌落，进一步鉴定。

2.2.1.9 重组质粒pMD18-ORF3提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）

向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；取1-5mL过夜培养的菌液加入离心管中12000rpm离心1min，尽量吸除上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL已加入RNaseA的溶液P1，使用移液器彻底悬浮细菌细胞沉淀；向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀；12000rpm离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）；12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；想吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；向吸附柱CP3中加入700μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rmp离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；向吸附柱CP3中加入500μL漂洗液PW，12000rmp离心30-60sec，倒掉收集管中的废液；将吸附柱CP3放入收集管中，12000rmp离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rmp离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

2.2.1.10 重组质粒pMD18-ORF3的PCR鉴定

将重组质粒DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，选择滞后重组质粒进行PCR鉴定（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶），利用2.2.1.3中的特异引物对待检测质粒进行PCR扩增，反应体系同2.2.1.3。

2.2.1.11 重组质粒序列测定

经PCR扩增到含目的片段质粒的菌液，送上海生工进行基因测序测定，测序引物选择通用测序引物M13F，将其余菌液15%甘油-20℃保存备用。

2.2.1.12 TBTV ORF3序列分析

将上海生工测序结果与Mo所登录（Mo et al，2003）的TBTV基因组全序列（AF402620）通过DNAMAN软件进行TBTV ORF3的核苷酸及氨基酸同源性比较及分析，确定获得的TBTV ORF3序列变异在允许范畴并保证氨基酸序列能正确翻译，进行下一步实验。

2.2.2 pGR107-ORF3载体构建

2.2.2.1 克隆载体pMD18-T-ORF3及双元载体pGR107 Sal I/Spe I酶切（反应体系20μL）（TaKaRa公司的Sal I/Spe I）

在0.2mL PCR管中加入10μL pMD18-ORF3 vector，2μL 10×H Buffer，1μL Sal

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

I（20U/μl），1μL Spe I（20U/μl），6μL ddH2O充分混匀。同时在另一0.2mL PCR管中加入10μL pGR107 vector，2μL 10×H Buffer，1μL Sal I（20U/μl），1μL Spe I（20U/μl），6μL ddH2O充分混匀。将两PCR管置于37℃水浴过夜，取酶切产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.2.2 分别割胶回收目的片段ORF3及缺失cp基因的pGR107载体（Axygen公司割胶回收试剂盒）

方法同2.2.1.5。

2.2.2.3 缺失cp基因的pGR107载体与目的片段ORF3连接

将双酶切下的ORF3及缺失cp基因的pGR107片段在T4连接酶（TaKaRa公司）的作用下连接，连接体系10μL。在0.2mL PCR管中加入1 μL缺失cp基因的pGR107 vector，5μL ORF3片段，1μL T4连接酶，1μL 10×连接酶Buffer，2μL ddH2O混合均匀后，4℃连接过夜。

2.2.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999)

GV301接种于LB液体培养基中（Rifr 50μg/mL），28℃过夜振荡；取0.2mL活化的菌液接种于10 mL含Rifr的LB液体培养基中，OD600为0.4-0.5左右，振荡6-8h；将菌液冰浴30min后，转至2mL离心管中，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，用1mL 0.1moL/L的预冷CaCl2重悬沉淀。按每管200μL分装，放置（12-24h）后（4℃）备用效果更好；若感受态细胞暂时不用可加入灭菌甘油至15%-30%（v/v）混匀液氮速冻后于-70℃保存。

2.2.2.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999)

取20 μL中间载体DNA加入到200 μL感受态细胞中，轻混，冰浴30min；液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min；加入800μL LB液体培养基（不加Rifr），28℃轻摇4-6h；取80μL-100μL菌液涂布于LB（加X-gal, IPTG）(Rifr 50μg/ mL)选择平板上，28℃倒置培养12-18h；将白斑挑单菌落于液体LB (Rif

r

50μg/ mL,Kanr 50μg/ mL)中扩繁，挑选1-2个蓝斑作对照。

2.2.2.6 pGR107-ORF3质粒提取

方法同2.2.1.9。1%琼脂糖检测质粒大小，选择滞后质粒做下一步检测。

2.2.2.7 PCR检测pGR107-ORF3质粒目的片段

为确保构建的重组载体pGR107-ORF3含有pGR107载体上的CaMV35S及TBTV ORF3基因而不含有pGR107载体上CP基因，充分证明pGR107载体上

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

CP基因被TBTV ORF3基因替代，PCR检测了重组载体pGR107-ORF3及原始载体pGR107上的CaMV35S、TBTV ORF3、CP基因，所用引物表2-1所示。引物设计根据pGR107载体上序列CaMV35S、CP序列设计，TBTV ORF3检测引物同上。

表2-1检测pGR107-ORF3质粒的引物 Table2-1 Detection primers for pGR107-ORF3 vector 引物名称及引物序列 Primer name and primer sequence

Tm值 Tm values

扩增片段长度 Long of amplified products

CaMV35SF：CTCGCATGCCTGCAGGTC CaMV35SR：TCCTCTCCA AATGAAATGAACT PTB3F：ACGCGTCGACATGTCTACGATCATAAATGT PTB3R：GACTAGTTCACCACTTGTTGGTGGT CPF：CACCAGCTAGCACAACACA CPR：GCCAGTCTAGCTCTGCTG

PCR检测体系同2.2.1.4。检测与目的片段大小相同的质粒的菌株GV3101(pGR107-ORF3) 大量扩繁并将部分菌液-80℃保存备用。

60℃

334bp

55℃

714bp

60℃

436bp

2.2.2.8 含重组质粒pGR107-ORF3农杆菌GV3101注射接种本氏烟

用注射器吸取1.5mL GV3101(pGR107-ORF3)菌液，挤压入本氏烟叶片上，同时设置接种GV3101(pGR107)及水作为对照实验。接种2周后对其检测及观察。

2.2.2.9 PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片（R Li et al，2008）

将1-2片接种系统叶片叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL （含0.2%巯基乙醇）CTAB缓冲液[5g CTAB 溶于150 mL ddH2O (温水浴)，5g

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

PVP 40,000，20.6g NaCl，10 mL (0.5 M, pH 8 )EDTA储存液，25 mL 1M（pH 8）Tris，最后用ddH2O定溶至250mL]充分研磨，转入1.5mL离心管中。65℃水浴中保温15-60min，保温过程中不时颠倒离心管，室温下13, 000rmp离心10min，取650?L上清至一新的1.5mL离心管中，加入650 ?L氯仿/异戊醇（24:1），涡旋震荡混匀30sec。室温下13, 000rmp离心10min，转移500 ?L层水相至一新的1.5mL离心管中，加入350 ?L异丙醇，反复颠倒数次，13,000rmp离心15min，小心地用微量移液器吸出上清回收总核酸沉淀。沉淀加入70%乙醇，13,000rpm离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥10-15min。加入100 μL 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，1%琼脂糖凝胶检测或-20℃保存备用。

用TBTV ORF3引物对所提叶片总核酸PCR检测，同时检测接种GV3101(pGR107)及水的植株系统叶做对照。

方法同2.2.2.7。

2.2.2.10 RT-PCR检测分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)植株系统叶片

Trizol法提取分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.2。

用ORF3F/ORF3R引物RT-PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3) 植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.3；用CPF/CPR引物RT-PCR检测接种GV3101(pGR107) 植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.3。

2.2.2.11 电镜检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片

取接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片做负染。将样品加入0.01mol/L负染液（负磷钨酸负染液2%）800μL研磨，转入1.5mL离心管，8000rmp，1min；将上清于手套膜上将铜网正面向液体放置2min；用滤纸吸干铜网上的液体，放入PTA负染3次，2min/次；用滤纸吸干放入培养皿中保存。

2.2.2.12 Western blot检测检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片总蛋白

用液氮研磨叶片，加入等体积蛋白上样缓冲液，用液氮反复洗冻3次，融化后100℃水浴10min，保存备用，点样前稍离心，取上清点样。

BL21（pET28a-ORF3）原核表达菌株及TBTV ORF3抗血清均由本实验室龙亚芹制备并保存。为检测植物叶片上TBTV ORF3，以含本实验室已构建好的原

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

核表达载体菌 (pET28a-ORF3)的BL21为阳性对照，以制备好的TBTV ORF3抗血清为一抗检测。

将保存的含原核表达载体菌(pET28a-ORF3)的BL21在LB（Amp）培养基中活化；活化好的菌液按1：100的菌及培养基LB(Amp)培养；取菌液在4℃、12,000 rpm 离心1min，弃上清。沉淀重悬于50μL蒸馏水，冰浴条件下进行超声波破碎2-4min后，在4℃、12,000 rpm 离心1min，取上清液，加入等体积的 2×SDS加样缓冲液中，100℃加热5min，悬液置冰上。待全部样品处理完后上样。

SDS-PAGE胶制备（萨姆布鲁克等，2002）(Bio-Rad公司单项蛋白电泳仪)

表2-2 SDS-PAGE分离胶及浓缩胶配方

Table 2-2 Formula of separation gel and stacking gel of SDS-PAGE 分离胶separation gel

H2O 30% Acr/Bis 1.5mol/L Tris(pH8.8)

10%SDS 10%APS TEMED

12% 1.6mL 2.0mL 1.3mL 0.05mL 0.05mL 0.002mL

将准备好的样品上样于SDS-PAGE上，电泳时浓缩胶电压为80V，分离胶电压为160V。

将SDS-PAGE电泳结束后的蛋白胶转膜，经SDS-PAGE电泳的凝胶在转移缓冲液中漂洗后，用微型Trans-Blot转印槽（北京六一DYCZ-40D转印电泳槽）将蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上；封闭时将转移后的硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，转入封闭液中（TBST稀释5%的脱脂奶粉），37℃封闭1小时或40℃过夜；第一抗体反应时，将封闭后的硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，然后转入TBST稀释的专化抗血清中，37℃反应1小

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浓缩胶stacking gel

H2O 30% Acr/Bis

5% 2.1mL 0.5mL

1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.38mL

10%SDS 10%APS TEMED

0.03mL 0.03mL 0.003mL

烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

时；第二抗体反应时，取出硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，放入TBST稀释的碱性磷酸酯酶IgG(1:5000稀释)，37℃反应1小时；BCIP/NBT底物显色试剂盒显色（TIANGEN公司）时，取1mL 1×AP反应缓冲液，加50μL NBT溶液和50μL BCIP溶液，混匀，把经洗涤的PVDF膜浸入生色底物混合物中，于室温平缓摇动进行温育反应并细心观察反应过程，当蛋白带的颜色深度达到要求（一般20-30min）时，把浸入PVDF膜水中停止反应，拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验记录。

2.2.2.13 ELISA检测

酶联板预处理：4℃过夜；选取病叶用PBST研磨，4000rmp离心 10min；抗原包被，每孔加入100μL病叶研磨液，37℃，2h；PBST洗涤6次，每次间隔5min；加封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST），37℃，2h；PBST洗涤6次；加入碳酸缓冲液稀释的抗血清100μL/孔，37℃，2h；PBST洗涤6次；加入封闭液1000×碱性磷酸酶标记二抗，37℃，2h；PBST洗涤6次；加酶标底物（PNP药片，使用前15min内配制）100μL/孔，30min；加3M NaOH终止反应，50μL/孔用酶标仪读数。

2.2.3 gfp基因的克隆

pGR208载体上带有gfp基因，根据pGR107载体上的多克隆位点Cal I/Smal I/Sal I设计带有SalⅠ/ClaⅠ酶切位点的引物GGFPF/GGFPR扩增gfp基因。

2.2.3.1 gfp基因的扩增

设计带酶切位点SalⅠ/ClaⅠ的引物，从pGR208载体上扩增gfp，片段长716bp。

GGFPF：CCATCGATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC GGFPR：ACGCGTCGACTATTTGTATAGTTCATCCATGC

2.2.3.2 PCR扩增pGR208载体上的gfp基因（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶）

方法同2.2.1.4。

2.2.3.3 PCR产物割胶回收gfp基因（Axygen公司割胶回收试剂盒）

方法同2.2.1.5。

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

2.2.3.4 克隆载体pMD18-T与gfp基因连接（TaKaRa公司的T4连接酶）

方法同2.2.1.6。

2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等译，2002）

方法同2.2.1.7。

2.2.3.6 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等译，2002）

方法同2.2.1.8。

2.2.3.7 重组质粒pMD18-GFP提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）

方法同2.2.1.9。

2.2.3.8 重组质粒pMD18-GFP的PCR鉴定

将重组质粒DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，选择滞后重组质粒进行PCR鉴定（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶），利用2.2.2.3中的特异引物对待检测质粒进行PCR扩增，方法同2.2.1.4检测gfp基因。

2.2.3.9 重组质粒序列测定

经PCR鉴定和酶切鉴定得到的含目的片段质粒的菌液，送北京博迈德进行基因测序测定，利用通用测序引物M13F对重组质粒进行序列测定并将部分菌液15%甘油保存备用。

2.2.3.10 gfp基因序列分析

将PCR检测正确的菌株DH5a(pMD18-GFP)送北京博迈德公司测序，测序结果与NCBI登录号为AB124780的GFP序列用DNAMAN软件进行核苷酸及氨基酸同源性比较及分析，确定获得的GFP序列变异在允许范畴并保证氨基酸序列能正确翻译。

2.2.4 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP载体构建

2.2.4.1 pGR107-ORF3、pGR107及pMD18-GFP载体的Sal I/Cla I酶切（Takara的Sal I/Cla I酶切体系）

重组质粒pMD18-GFP及双元载体pGR107-ORF3、pGR107 Sal I/Cla I酶切（反应体系20μL）, pGR107为对照。在0.5mL PCR管中加入10μL pMD18-GFP，2μL反应缓冲液H，1μL SalⅠ，1μL ClaⅠ，6μL ddH2O；同时在另一0.5mL PCR

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

管中加入10μL pGR107-ORF3质粒DNA，2μL反应缓冲液H，1μL SalⅠ，1μL ClaⅠ，6μL ddH2O。将两个离心管分别混合均匀，37℃水浴过夜，取酶切产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.4.2 分别割胶回收目的片段gfp及pGR107-ORF3、pGR107酶切后载体片段（Axygen公司割胶回收试剂盒）

方法同2.2.1.5。

2.2.4.3 pGR107-ORF3、pGR107载体与gfp基因的T4连接(TaKaRa公司)

将双酶切的gfp及双酶切的pGR107-ORF3片段在T4连接酶的作用下连接，连接体系10μL。在0.2mL PCR管中加入1 μL双酶切的pGR107-ORF3片段，5μLGFP片段，1μL T4连接酶，1μL 10×连接酶Buffer，2μL ddH2O混合均匀后，4℃连接过夜。同样的方法设置双酶切的pGR107片段与双酶切的gfp基因片段连接。

2.2.4.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999)

方法同2.2.2.4。

2.2.4.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999)

方法同2.2.2.5。

2.2.4.6 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）

方法同2.2.2.9。

2.2.4.7 PCR检测pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒的gfp基因片段

引物为GGFPF/GGFPR,反应体系25μL。方法同2.2.1.4。

2.2.4.8 含重组质粒pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP的农杆菌GV3101注射接种本氏烟

方法同2.2.2.8。

2.2.4.9 免疫荧光显微镜检测接种pGR107-GFP-ORF3、pGR107-GFP的本氏烟各部位

接种2天后，将接种植株不同部位做徒手切片，免疫荧光显微镜观察植株各

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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析

个部位并拍照。

2.2.5 免疫胶体金检测烟草丛顶病毒

利用已获得TBTV ORF3/ORF4抗血清对烟草丛顶病烟株进行免疫胶体金检测，可明确TBTV ORF3/ORF4基因在发病烟株细胞中的定位。

2.2.5.1 样品的低温包埋

取采自云南省保山市龙陵县通过介体蚜虫取食发病的烟草丛顶病样。将新鲜样品切成1×1×3mm3的小块，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸缓冲液（100mM，pH7.2）中，4℃下固定2h；磷酸缓冲液（100mM，pH7.2）清洗3次，每次15min；在4℃依次用30%、50%乙醇溶液脱水，每次30min；在-20℃冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水，每次60min，100%乙醇处理时注意不断轻轻摇动样品；在-20℃冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M渗透，每次120min，100%的K4M渗透过夜，注意不断轻轻摇动样品使渗透完全；置换新瓶，用100%K4M继续渗透6h；将样品包埋于K4M树脂的eppendorf管，注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会抑制包埋剂的聚合；在-20℃冰箱中长紫外线照射聚合72h，室温下聚合48h，注意每天翻动2次样品使紫外光照射均匀；聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片；超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做免疫胶体金标记。

2.2.5.2 胶体金间接标记（在28℃下进行）

超薄切片厚50-70nm左右，载于200-300网孔的锦网上；ddH2O漂洗2min；BL封闭30min；一抗(ORF3和ORF4抗血清由龙亚芹制备)稀释100-300倍（BL稀释），30-60min；ddH2O漂洗3次，每次5min；胶体金标记抗体液稀释30-100倍，以淡红色液为适宜稀释液，标记30-60min；双蒸水漂洗3次，每次5min；4%醋酸双氧铀染色5min。

2.2.5.3 电镜观察免疫胶体金颗粒

在透射电镜（JEM100CX型透射电子显微镜观察）下找到样品，放大到适宜倍数后，调整视眼清晰度，在该放大倍数下寻找胶体金颗粒，金颗粒在视眼中为微小颗粒，找到金颗粒后，在将其放大到适宜倍数并调节视眼清晰度。在较好的视眼下拍照。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/alc6.html