植物生物技术考试题

四,脓杆菌介导转基因的程序,并说明影响转化效率的因素?举例说明? 原理：

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的

T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。

方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1． 农杆菌准备 2． 外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）;

3． 用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4． 外植体与菌液共培养20 分钟;

5． 放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）;

6． 将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ;

7． 移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8． 隔20天，进行第二次筛选； 9． 抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗；

10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

五,DNA分子标记的种类及优缺点?

RFLP、VNTR、RAPD、DAF、AP-PCR、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、SNP、InDel、CAPS、dCAPS、SRAP、EST 1 RFLP

该技术由Grodzicker等于1974年创立特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均

可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性

RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中

2 RAPD

由Williams等于1990年创立其基本原理与PCR技术一致

PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年

首创该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍其原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，首先是双链DNA分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过20-30个循环后，介于两个引物间的特异DNA片段以几何数得以大量复制

RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加缺少或发生分子量变化若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记

RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低 3 AFLP

由Zabeau和Vos于1993年发明AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太

多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来

AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高 4 SSR（SSLP）

由Moore等于1991年创立SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的

不同位置，如（CA）n（AT）n（GGC）n等重复不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记

SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

六．胚培养，胚乳培养有什么价值或用途？胚发育有几个时期？各时期特点？ （一）胚的发育

种子里的胚是由卵经过受精后的合子发育来的，合子是胚的第一个细胞。卵细胞受精

后，便产生一层纤维素的细胞壁，进入休眠状态。

合子是一个高度极性化的细胞，它的第一次分裂，通常是横向的（极少数例外），成为两个细胞，一个靠近珠孔端，称为基细胞；另一个远珠孔的，称为顶端细胞。顶端细胞将成为胚的前身，而基细胞只具营养性，不具胚性，以后成为胚柄。两细胞间有胞间连丝相通。这种细胞的异质性，是由合子的生理极性所决定的。胚在没有出现分化前的阶段，称原胚（proembryo）。由原胚发展为胚的过程，在双子叶植物和单子叶植物间是有差异的。

1．双子叶植物胚的发育

双子叶植物胚的发育，可以荠菜为例说明，合子经短暂休眠后、不均等地横向油裂为基细胞和顶端细胞。基细胞略大，经连续横向分裂，形成一列由6—10个细胞组成的胚柄。顶端细胞先要经过二次纵分裂（第二次的分裂面与第一次的垂直），成为4个细胞，

即四分体时期；然后各个细胞再横向分裂一次，成为8个细胞的球状体，即八分体（octant）时期。八分体的各细胞先进行一次平周分裂，再经过各个方向的连续分裂，成为一团组织。以上各个时期都属原胚阶段。以后由于这团组织的顶端两侧分裂生长较快，形成二个突起，迅速发育，成为2片子叶，又在子叶间的凹陷部分逐渐分化出胚芽。与此同时，球形胚体下方的胚柄顶端一个细胞，即胚根原细胞（hypophysis），和球形胚体的基部细胞也不断分裂生长，一起分化为胚根。胚根与子叶间的部分即为胚轴。不久，由于细胞的横向分裂，使子叶和胚轴延长，而胚轴和子叶由于空间地位的限制也弯曲成马蹄形。至此，一个完整的胚体已经形成，胚柄也就退化消失。

2．单子叶植物胚的发育

单子叶植物胚的发育，可以禾本科的小麦为例说明。小麦胚的发育，与双子叶植物胚的发育情况有共同处，但也有区别。合子的第

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