化学仪器分析小结

高效液相色谱分析法

一、高效液相色谱仪的结构与功能组成

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。 1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。 2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由\优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。 （1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g/ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。 （2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g/ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。 （3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。 （5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

二、液相色谱柱的正确安装和使用说明

液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

（一） 液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构：

a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧

箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。 在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 b、柱填料：

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10μm之间。 2，色谱柱的安装：

a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

c、按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1/4圈，直至不漏液为止。

（二）液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理：

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

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c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 3、流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

三、高效液相色谱仪操作步骤： 1．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜. 2．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3．打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4．进入hplc控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7．设计走样方法。点击file，选取se-lect users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10．填写登记本，由负责人签字。 11．注意事项：

1) 流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气

泡。

2) 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3) 所有过柱子的液体均需严格的过滤。 4) 压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

四、毛细管电泳仪的使用 （一）准备工作 1． 毛细管的制备:

① 剪略长于需要长度的毛细管（使用专用的裁剪纱布），断端利用镊子小心移除。 ② 烧窗：从毛细管进液端开始到实验者需要长度的位置烧窗，窗口尽量小，过程中可用防护工具对窗口两端的毛细管进行防护，烧好的窗需用粘有酒精的棉花擦拭。

注：检测的有效长度为从毛细管进液端到检测窗之间的距离，这个距离一般根据实验者的需要自己掌握。

③ 取出卡槽：打开安放卡槽区域的门，旋转固定卡槽的杠杆90度，按卡槽中央的释放按钮，握住卡槽的两端向上抽出卡槽。

④ 安装毛细管：将进液端的毛细管小心的从卡槽的出口插入，进入时可轻轻旋转。当窗口到达检测点时停止插入，将游离的进液端毛细管从卡槽的入口引出，并固定好毛细管外端的橡胶管。

注：插入毛细管时小心操作，窗口位置的毛细管非常容易破裂，需格外谨慎，过程中切

忌使用暴力。

⑤ 安放卡槽：用与取出的步骤相反顺序的操作安放卡槽。 2． 添加样品，缓冲液及冲洗液：

① 为了减少样品及缓冲液的挥发，在插入加液管前可在加样管固定器的小孔内加入少量的ddH2O。

② 已添加好的加液管，在插入转盘上的固定槽前先离心2min,加液时注意加样枪头紧贴管壁，防止气泡的产生。

③ 为了减少虹吸作用，需要保持入口处和出口处的running buffer 量一致，对于500ul 体积的加液管，推荐加入500ul的剂量；对1.5ml体积的加液管，推荐1.3ml的剂量。

④ 推荐加入样品的最小剂量为50ul,检测需要的最小剂量为15ul。

⑤ 在出口处的waste管中加入50ul的ddH2O，可以防止检测端的毛细管被冲洗液的残留污染。

（二）电泳仪的操作

1．插上电源，检查电泳仪的连接情况，检查制冷区小槽内水量是否充足，打开电脑，打开电泳仪的开关（两扇门都需要关闭），在电脑桌面点开BioFocus的图标，进入到BioFocus的控制界面。

2．设置程序：

① 点击Reagents键，在已有的Reagents Data Base中查看是否含有需要使用的配液，有可点击该配液查看，或使用edit键进行修改；没有则点击add进行编辑添加。添加之后注意命名名称的唯一性。

② 点击Cartridges键，对卡槽的相关参数进行查看，修改。如Cartridges Data Base 中没有和试验要求匹配的配置参数则点击Add进行添加。注意需要激活相应的或者设置的卡槽。

③ 点击Configurations→Define:添加需要的信息:configuration ID; Configuration description; select the cartridge→Continue :Regent 双击左下角regent data base 中需要选择的regent; 双击屏幕右边你需要放置该regent的Inlet Carousel Position→Sample :命名，同样的方式从左下角的Reagents 中添加到右侧相应的位置上→点击empty ,然后点击需要删除的Regent;点击clear ,清除所有设置的Regent 摆放次序→OK。

注：在以上几步中，记得同时设置好中止的清洗程序，及Shutdown程序， ddH2O清洗5分钟，氮气吹干。

④ 点击Methods:选择设置好的程序→Define :填写Method ID, Description→Inlet Regent ，选择电泳中需要的Running buffer →Outlet Regent , 选择电泳中需要的Running buffer→Voltage Mode 填写需要的电压，电流， 正负极，设定电泳时毛细管需要的温度，以及电泳时间→Add:添加在电泳前后需要灌注的洗液等，填写灌注的时间→Injection : 选择电压或者气压的进液方式；前者需选择恒压或者恒流，以及进液时间的长短；后者需选择压力*时间的进液常数→Detector :Detector Parameters : 设置波长，时间，通道，AU范围；Display parameters:设置波长，AU范围，偏移;Options:设置Rise Time, Turn off lamp at run end；Designation: 该设者存储的位置→OK

⑤ 点击Auto Seqs :选择需要的程序→Define 查看，编辑需要调整的程序，如States显示Conflict 则需要对相应的设置进行调整，知道状态显示Pending →Pending， Ready →OK→Start

（三） 停止，存储，查看文件

① 等待所有的程序完成后（包括运行程序及情节程序），要停止运行的程序，则可点击屏幕左上角的Stop键→选择需要中止运行的某一步(Abort Current Run Only)，某一组(Abort Current Run Group)或所有编辑的程序(Abort Automation Sequence)→OK→存储在指定盘上（Yes），自定义盘（NO）→需要取出加液管及转盘(YES),不需要（NO）

注：在所有的对话框消失之前，以及转盘没有回到初始位置之前，不能打开电泳仪的门。 （四）操作要点：

1. 将毛细管电泳仪放置于有空调的房间，保持室温恒定。同时，操作中控制毛细管及仪器恒温。

2. 缓冲液加压一段时间后，淌度和电渗流会变化，要经常更换。 3. 缓冲液要用0.45mm微孔滤膜过滤后使用。

4. 对未涂渍的毛细管柱每天使用前先用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗10min平衡后使用。更换缓冲液时，要用水冲洗3min后，再用缓冲液冲洗10min平衡后进样。

5. 样品宜溶于稀释5~10倍的运行缓冲液中，以获得好的峰形。

6. 为提高定量准确性，宜加入一内标。在保证峰形的前提下，样品宜用高浓度，进样时间应大于5psi×sec。

7. 摸索实验条件时，可先用一短柱，用磷酸盐、硼砂或Tris在不同的pH值条件下试验，当选定缓冲液种类时，可先改变pH值获得最佳分离，再改变浓度以获得较好的峰形及柱效。

为使分析高效、快速，电压一般可用18~20kv。

8.每次作完实验后，用水冲洗5min，可将毛细管两端置于水中保存，也可用氮气吹干后保存。

气相色谱分析法

一、气相色谱的主要组成和其工作原理

气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同， 虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

主要组成：气相色谱种类很多，性能也各有差别。主要包括两个系统。即气路系统和电路系统。气路系统主要有压力表、净化器、稳压阀、稳流阀、转子流量计、六通进样阀、进样器、色谱柱、检测器等；电子系统包括各用电部件的稳压电源、温控装置、放大线路、自动进样和收集装置、数据处理机和记录仪等电子器件。 按照功能单元分有：

（1）载气系统。包括气源、气体净化、气体流速控制和测量。 （2）进样系统。包括进样器、汽化室――将液体样品瞬间汽化为蒸气。 （3）色谱柱和柱温。包括恒温控制装置――将多组分样品分离为单个。 （4）检测系统。包括检测器，控温装置。

（5）记录系统。包括放大器、记录仪、有的仪器还有数据处理装置，为便于准确快速检测，GC-MS 和GC-FTIR 也是常用的联合检测组成。

二、气相色谱柱的安装

色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。

正确的安装请参考以下步骤： 步骤1. 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。 步骤2. 将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端要小心切平 步骤3. 将色谱柱连接于进样口上色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，

色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm，这就是较为理想的状态。（具体的插入程度和方法参见所使用GC的随机手册）避免用力弯曲挤压毛细管柱，并小心不要让标记牌等有锋利边缘的物品与毛细柱接触摩擦，以防柱身断裂受损。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。因为不紧密的安装，不仅会引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。 步骤4. 接通载气当色谱柱与进样口接好后，通载气, 调节柱前压以得到合适的载气流速。 柱前压设置为Psi 15m 25m 30m 50m 100m 0.20mm 10-15 20-30 18-30 40-60 80-120 0.25mm 8-12 13-22 15-25 28-45 55-90 0.32mm 5-10 8-15 10-20 16-30 32-60 0.53mm 1-2 2-3 2-4 4-8 6-14 (以上仅为建议的起始设置，具体数值要依据实际的载气流速。)将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。 步骤5. 将色谱柱连接于检测器上其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。 步骤6. 确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。 步骤7. 色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。 对色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。 一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同。PLOT柱的老化步骤:HLZ Pora 系列 250℃， 8小时以上Molesieve(分子筛) 300℃ 12小时Alumina(氧化铝) 200℃ 8小时以上由于水在氧化铝和分子筛PLOT柱中的不可逆吸附，使得这两种色谱柱容易发生保留行为漂移。 当柱子分离过含有高水分样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。 步骤8. 设置确认载气流速对于毛细管色谱柱，载气

的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛细管色谱柱，那么依照载气的平均线速度（cm/sec）,而不是利用载气流量（ml/min）来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值：氮气：10-12cm/sec 氢气：20-25cm/sec载气杂质过滤器在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时，最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。 步骤9. 柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会增高。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他：色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。注意：当空气中氢气的含量在4-10%时，就有爆炸的危险。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。

三、气相色谱仪操作规程

1、色谱室应选在无腐蚀气体源的环境中，室内温度+5～35℃范围内，环境湿度≤85%相对湿度，室内应保持空气流通。

2、仪器室电源不应与大功率耗电量设备共用一条线路，接地和接零严格分开，三相进户单相三线制供电。

3、色谱气源必须采用高纯气体，严禁采用任何塑料管道输气，进入仪器前要加具变色分子筛的净化系统，对载气还应串接脱氧管，不同种可燃气体不能放置同一气源室内。 4、任何采用钢瓶供气之气源，使用之最低气压不得<1MP、必须及时更换，换瓶时逆时针方向松开减压器支头螺丝，顺时针关闭瓶头阀，拆下钢瓶减压器，换上同种满瓶气开启瓶头阀，顺时针旋进支头螺丝至所需压力。必须特别提醒，在每次打开钢瓶瓶头阀时，首先必须检查支头螺丝是否松开（逆时针旋转为松开）。只有在确认支头螺丝是松开的状态下方能打开瓶头阀，否则钢瓶减压器在打开瓶头阀时，高压打在低压调节器上，一次即可把减压器击坏。凡遇以上情况作责任事故处理。

5、使用TCD检测器时，应先开载气，并确认整个系统无泄漏情况下再把汽化室，柱室，检测室温度升至所需值，然后开启桥路电流，关机时则先关桥路电流，再降温至60℃，最后关

闭载气。当使用氢做载气时，应用管道把放空气接至室外。

6、使用FID检测器时，开启载气，把检测器温度升至所需值，点火、然后把汽化室，柱箱温度升到位，关机时先关闭氢气、空气熄火，然后降温至60℃，停载气。

7、更换填充柱时，对填充柱直接插入汽化室的仪器，应考虑留5CM试样汽化空间。当采用玻璃填充柱时，只能使用He.N.Ar做载气。填充柱使用前必须在低于固定液最高使用温度20～30℃，载气流速5ml/min的条件下。老化8—16小时在基线无噪声时方可作样品分析 8、更换毛细管色谱柱时，当毛细管穿过石墨垫时头应向下，穿过以后用毛细管割刀切去2～3cm，应严格按仪器说明书规定插入汽化室，检测室之距离。用手旋上毛细管固定螺帽呈水平状至紧，用小扳手顺时针旋转1/4圈，检查不漏气即可，千万不要扳的过紧。

9、分析样品瓶和进样注射器只能放置在250×160×35mm有盖的搪瓷盘中，严禁放在仪器顶部或实验台上。

四、气相色谱常识

（一）气相色谱法有哪些特点？

气相色谱是色谱中的一种，就是用气体做为流动相的色谱法，在分离分析方面，具有如下一些特点：

1、灵敏度：可检出10-10克的物质，可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中微量毒物的分析。

２、高选择性：可有效地分离性质极为相近的各种同分异构体和各种同位素。 ３、高效能：可把组分复杂的样品分离成单组分。

４、速度快：一般分析、只需几分钟即可完成，有利于指导和控制生产。

５、应用范围广：即可分析低含量的气、液体，亦可分析高含量的气、液体，可不受组分含量的限制。

６、所需试样量少：一般气体样用几毫升，液体样用几微升或几十微升。 ７、设备和操作比较简单仪器价格便宜。

（二） 气相色谱的分离原理为何？

气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。

（三）何谓气相色谱？它分几类？

凡是以气相作为流动相的色谱技术，通称为气相色谱。一般可按以下几方面分类：

１、按固定相聚集态分类：（１）气固色谱：固定相是固体吸附剂，（２）气液色谱：固定相是涂在担体表面的液体。

２、按过程物理化学原理分类：(１)吸附色谱：利用固体吸附表面对不同组分物理吸附性能的差异达到分离的色谱。(2)分配色谱：利用不同的组分在两相中有不同的分配系数以达到分离的色谱。(3)其它：利用离子交换原理的离子交换色谱：利用胶体的电动效应建立的电色谱；利用温度变化发展而来的热色谱等等。

３、按固定相类型分类：（１）柱色谱：固定相装于色谱柱内，填充柱、空心柱、毛细管柱均属此类。（２）纸色谱：以滤纸为载体，（３）薄膜色谱：固定相为粉末压成的薄漠。 ４、按动力学过程原理分类：可分为冲洗法，取代法及迎头法三种。

（四）气相色谱法简单分析装置流程是什么？

气相色谱法简单分析装置流程基本由四个部份组成：１、气源部分，２、进样装置，３、色谱柱，４、鉴定器和记录器.

（五）气相色谱法的一些常用术语及基本概念解释？

１、相、固定相和流动相：一个体系中的某一均匀部分称为相；在色谱分离过程中，固定不动的一相称为固定相；通过或沿着固定相移动的流体称为流动相。

２、色谱峰：物质通过色谱柱进到鉴定器后，记录器上出现的一个个曲线称为色谱。 ３、基线：在色谱操作条件下，没有被测组分通过鉴定器时，记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。

４、峰高与半峰宽：由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高，一般以h表示。色谱峰高一半处的宽为半峰宽，一般以x１／２表示。 ５、峰面积：流出曲线（色谱峰）与基线构成之面积称峰面积，用Ａ表示。

６、死时间、保留时间及校正保留时间：从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间，以td表示。从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间，以tr表示。保留时间与死时间之差称校正保留时间。以Ｖd表示。

７、死体积，保留体积与校正保留体积：死时间与载气平均流速的乘积称为死体积，以Ｖd表示，载气平均流速以Ｆc表示，Ｖd=tdxFc。保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积，以Ｖr表示，Ｖr=trxFc。

８、保留值与相对保留值：保留值是表示试样中各组分在色谱柱中的停留时间的数值，通常用时间或用将组分带出色谱柱所需载气的体积来表示。以一种物质作为标准，而求出其他物质的保留值对此标准物的比值，称为相对保留值。

９、器噪音：基线的不稳定程度称噪音。10、基流：氢焰色谱，在没有进样时，仪器本身存在的基始电流（底电流），简称基流。

（六）一般选择载气的依据是什么？气相色谱常用的载气有哪些？

作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于所用的检测器。常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气、二氧化碳气等等。

（七）载气为什么要净化？应如何净化？

所谓净化，就是除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质，以提高载气的纯度。不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定器线性变劣等，所以载气必须经过净化。一般均采用化学处理的方法除氧，如用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采用矽胶，分子筛等吸附剂除水分。

（八）试样的进样方法有哪些？

色谱分离要求在最短的时间内，以“塞子”形式打进一定量的试样，进样方法可分为： 1、气体试样：大致进样方法有四种：（１）注射器进样，（２）量管进样，（３）定体积进样，（４）气体自动进样。一般常用注射器进样及气体自动进样。注射器进样的优点是使用灵活，方法简便，但进样量重复性较差。气体自动进样是用定量阀进样，重复性好，且可自动操作。2、液体试样：一般用微量注射器进样，方法简便，进样迅速。也可采用定量自动进样，此法进行重复性良好。

３、固体试样：通常用溶剂将试样溶解，然后采用和液体进样同样方法进样。也有用固体进样器进样的。

（九）简述在气相色谱分析中柱长、柱内径、柱温、载气流速、固定相、进样等操作条件对分离的影响？

操作条件对于色谱分离有很大影响。

１、柱长，柱内径：一般讲，柱管增长，可改善分离能力，短则组分馏出的快些；柱内径小分离效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致担体不能均匀地分布在色谱柱中。分析用柱管一般内径为３－６毫米，柱长为１－４米。

２、柱温：是一个重要的操作变数，直接影响分离效能和分析速度。选择柱温的根据是混合物的沸点范围，固定液的配比和鉴定器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。一般采用等于或高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱温，不易挥发的样品采用高柱温。

３、载气流速：载气流速是决定色谱分离的重要原因之一。一般讲流速高色谱峰狭，反之则宽些，但流速过高或过低对分离都有不利的影响。流速要求要平稳，常用的流速范围每分钟在10－100亳升之间。

４、固定相：固定相是由固体吸附剂或涂有固定液的担体构成。（１）固体吸附剂或担体粗细：一般采用40－60目、60－80目、80－100目。当用同等长度的柱子，颗粒细的分离效率就要比粗的好些。（２）固定液含量：固定液含量对分离效率的影响很大，它与担体的重量比一般用15％－25％。比例过大有损于分离，比例过小会使色谱峰拖尾。

５、进样：一般讲进样快，进样量小，进样温度高其分离效果好。对进液体样，速度要快，汽化温度要高于样品中高沸点组分的沸点值，一次汽化，保证色谱峰形不致展宽、使柱效高。当进样量在一定限度时，色谱峰的半峰宽是不变的。若进样量过多就会造成色谱柱超载。一般讲柱长增加四倍，样品的许可量增加一倍。对于常规分析，液体进样量为1－20微升；气体进样量为0.1－5毫升。

（十）色谱柱管材料应根据什么原则选择？常用的柱管是由什么材质制成的？ 对色谱柱管材质，应按如下要求选择： １、应与固定相、试样、载气不起化学反应。 ２、要易于加工成型。

３、管内壁应光滑，横截面应均匀呈圆形。一般色谱柱管形状呈Ｕ型或螺旋形，大多由铜、不锈钢，玻璃等材质制成。

（十一）新的色谱柱管（铜或不锈钢管）应怎样处理后方能使用？

新柱管应先用稀酸或稀碱（１：１盐酸或氢氧化钠）洗涤，以除去油污等脏垢，而后用自来水冲洗,继而用蒸馏水冲洗至中性，再用干净的空气吹洗并烘干后，即可使用了。

（十二）什么叫担体？对担体有哪些要求？

担体是一种多孔性化学惰性固体，在气相色谱中用来支撑固定液。对担体有如下几点要求：１、表面积较大，一般应在0.5－2米／克之间； ２、具有化学惰性和热稳定性；

３、有一定的机械强度，使涂渍和填充过程不引起粉碎； ４、有适当的孔隙结构，利于两相间快速传质；

５、能制成均匀的球状颗粒，利于气相渗透和填充均匀性好；

６、有很好的浸润性，便于固定液的均匀分布。完全满足上述要求的担体是困难的，人们在实践中只能找出性能比较优良的担体。

（十三）担体分几类？其特点如何？

通常分为硅藻土和非硅藻土两大类，每一类又有种种小类。

１、硅藻土类型：（１）白色的：表面积小，疏松，质脆，吸附性能小，经适当处理，可分析强极性组分；（２）红色的：有较大的表面积和较好的机械强度，但吸附性较大。 ２、非硅藻土类型：（１）氟担体：表面惰性好，可用来分析高极性和腐蚀性物质，但装柱不易，柱效率低些。（２）玻璃微球：表面积小，用它做担体柱温可以大大降低，而分离完全且快速。但涂渍困难，柱效低。（３）多孔性高聚物小球：机械强度高，热稳定性好，吸附性低，耐腐蚀，分离效率高，是一种性能优良的新型色谱固定相。（４）炭分子筛：中性，表面积大，强度高，祛寿命长，在微量分析上有无比的优越性。（５）活性炭：可以单独做为固定相。（６）沙：主要用于分离金属。

（十四）一般常用的担体有哪几种？各属哪类？

101担体：为白色硅藻土担体；102担体：为白色硅藻土担体；celite545：为白色硅藻土担体；201担体：为红色硅藻土担体；6201担体：为红色硅藻土担体；C－22保温砖：为红色硅藻土担体；chromosorb：为红色硅藻土担体。

（十五）使用担体为何要进行处理？一般处理的方法有哪些？

常用的担体表面并非惰性，它具有不同程度的催化作用和吸附性（特别是固定液含量低时和分离极性物质时）造成峰拖尾和柱效下降，保留值改变等影响，因而需要预处理。现将一般处理方法简述如下：

１、酸洗法：用浓盐酸加热处理担体20－30分钟，然后用自来水冲洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干备用。此法主要除去担体表面的铁等无机物杂质。

２、碱洗法：用10％的氢氧化钠或5％的氢氧化钾－甲醇溶液浸泡或回流担体，然后用水冲洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干备用。碱洗的目的是除去表面的三氧化二铝等酸性作用点，但往往在表面上残留微量的游离碱，它能分解或吸附一些非碱性物质，使用时要注意。 ３、硅烷化：用硅烷化试剂和担体表面的硅醇、硅醚基团起反应，除去表面的氢键结合能力，可以改进担体的性能。常用的硅烷化试剂有二甲基二氯硅烷和六甲基二硅胺。

４、釉化：把欲处理的担体在2~3％的碳酸钠－碳酸钾（１：１）水溶液中浸泡一天，烘干后先在870度下煅烧3~5小时，然后升温到980度煅烧约40分钟。经过这样处理，担体表面形成一层玻璃化的釉质，故称“釉化担体”。这种担体的吸附性能小，强度大，当固定液中加入少量的去尾剂后，能分析如醇、酸等极性较强的物质。但对非极性物质柱效能则稍有下降。此外甲醇和甲酸等物质在釉化担体上有一定的不可逆化学吸附，在定量分析时应予以注

意。

５、其他纯化方法：凡是用化学反应来除去活性作用点或用物理复盖以达到纯化担体表面性质的方法都可以使用。

（十六）常用的担体目数为多少？

常用的4－6毫米内径的色谱柱：对于较长色谱柱，选用担体目数一般为40－80目；对于较短色谱柱选用担体目数一般为80－100目(每英寸内的筛孔数目为目)。

（十七）常用的担体怎样选择？

各种担体，名目繁多。在常用硅藻土担体中:红色担体（如6201、201），可用于非极性或弱极性物质的分离。白色担体（如101）可用于极性物质或碱性物质。釉化红色担体（如301）可用于中等极性物质。硅烷化白色担体可用于强极性氢键型物质如废水测定。分离酸性物质，如酚类，要用酸洗处理的担体。分离碱性物质，如乙醇胺，要用碱洗处理的担体。微量分析要用硅烷化的担体。有些特殊的情况下要用特殊的担体，如氟担体分离异氰酸酯类。但是在普通的常量分析中，对担体可以不必过份讲究，甚至如耐火砖粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。

（十八）何谓固体固定相？大体可分为几类？

指直接装填到色谱柱中作为固定相的具有活性的多孔性固体物质。固体固定相大体可分为三类：第一类是吸附剂。如：分子筛、硅胶、活性炭、氧化铝等；第二类是高分子聚合物。如国内的GDX型高分子多孔微球，国外Ｐorapak系列等；三类是化学键合固定相。在气相色谱中，通常是将固定液涂敷在载体表面上。采用化学键合固定相分析极性或非极性物质通常都能够得到对称峰，柱效很高，固定相的热稳定性也有所改善。

（十九）什么是固定液？对固定液有哪些要求？

一般是一种高沸点的有机物的液膜，通过对不同组份的不同分子间的作用，使组份在色谱柱中得到分离。对气相色谱用的固定液，一般有如下几点要求：１、在操作温度下蒸气压低，热稳定性好，与被分析物理或载气不产生不可逆反应；２、在操作温度下呈液态，而且粘度愈低愈好。物质在高粘度的固定液中传质速度慢，柱效率因而降低。这决定固定液的最低使用温度；３、能牢固地附着在载体上，并形成均匀和结构稳定的薄层；４、被分离的物质必须在其中有一定的溶解度，不然就会很快地被载气带走而不能在两相之间进行分配；５、对沸点相近而类型不同的物质有分离能力，即保留一种类型化合物的能力大于另一种类型。这种分离能力即是固定液的选择性。

（二十）固定液的选择原则有哪些？

根据被分离组分和固定液分子间的相互作用关系，固定液的选择一般根据所谓的“相似性原则”，即固定液的性质与被分离组分之间的某些相似性，如官能团、化学键、极性、某些化学性质等，性质相似时，两种分子间的作用力就强，被分离组分在固定液中的溶解度就大，分配系数大，因而保留时间就长；反之溶解度小，分配系数小，因而能很快流出色谱柱。下面就不同情况进行讨论：a、分离极性化合物，采用极性固定液。这时样品各组分与固定液分子间作用力主要是定向力和诱导力，各组分出峰次序按极性顺序，极性小的先出峰，极性越大，出峰越慢；b、分离非极性化合物，应用非极性固定液，样品各组分与固定液分子间作用力是色散力，没有特殊选择性，这时各组分按沸点顺序出峰，沸点低的先出峰。对于沸点相近的异构物的分离，效率很低；c、分离非极性和极性化合物的混合物时，可用极性固定液，这时非极性组分先馏出，固定液极性越强，非极性组分越易流出；d、 对于能形成氢键的样品。如醇、酚、胺和水的分离，一般选择极性或氢键型的固定液，这时依组分和固定液分子间形成氢键能力大小进行分离。“相似相容性原则”是选择固定液的一般原则，有时利用现有的固定液不能达到满意的分离结果时，往往采用“混合固定液”，应用两种或两种以上性质各不相同的，按适合比例混合的固定液，使分离有比较满意的选择性，又不致使分析时间延长。然而，在实际工作中选择固定液往往是参考资料或文献介绍的实例来选用固定液的。

（二十一）混合固定液的处理方法有几种？

混合固定液的处理方法有三种：１、分别涂渍于担体后再混合；２、将固定液混合后再涂渍，注意这时所用的固定液都应溶解在同一个溶剂里；３、分别涂渍，分别填装入按比例长短的色谱柱，最后再将它们串接起来。上述三种处理方法，结果基本相同，但对于特殊的分离，有些也会有差异。

（二十二）常用的固定液涂量为多少合适？

由于固定液含量对分离效率的影响很大。所以它与担体的重量比例，低比例为5％，一般用15％－25％。液体比例再大，则被分析的样品在比较厚的液膜上有扩散现象，有损于分离；液体比例太低时，则由于液膜太薄，担体表面上残余的吸附能力会显示出来，使色谱峰拖尾。由于低比例能促进平衡的建立，可以用较高的载气流速，所以用低的液体比例，再加上少量样品，能缩短分析时间。对硅藻土担体固定液含量可大些15－30％；由于氟担体表面积较小，所以最多只能10％；至于玻璃微球由于表面积特小，固定液含量便只能保持在0.25％左右。

（二十三）配柱时常用的固定液溶剂有哪些？选用溶剂的原则是什么？

常用的溶剂有：甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇、正己烷、石油醚、苯、甲苯和氯仿等等。选用的原则是：１、溶解性好，２、不与固定液起化学反应，３、沸点低，４、毒性小。

（二十四）配柱时在担体上涂渍固定液采用的常规方法是什么？

一般配常用的色谱柱，大都采用“常规”涂渍法，其简要操作为：取所需量的固定液，用适量（能浸过担体）的溶剂溶解，将担体缓缓倒入其中，随到随搅，而后用红外灯照射（或用水浴蒸发）以赶走溶剂，则固定液就附着于担体上了。

（二十五）色谱柱的常用填充方法有哪些？

固定相填充的好坏，将直接影响柱效率.通常多用泵抽填充法，即把色谱柱的一端塞上玻璃棉，接真空泵，另一端接一漏斗，在抽吸下加入固定相，边装边敲打色谱柱，至固定相不再进入为止。装好后，塞上玻璃棉。装柱要求要填充得均匀，紧密，切忌有空隙。

紫外分光光度法

一、基本概念

1分光光度法：测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析的方法称为分光光度法。

2紫外光：波长在200～400nm范围内的光称为紫外光。 3可见光：波长在400～760nm范围内的光称为可见光。

4紫外-可见吸收光谱：物质吸收紫外线和可见光区的电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。

5紫外-可见分光光度法（UV）：利用紫外-可见吸收光谱进行定性和定量分析的方法，称为紫外-可见分光光度法。紫外-可见分光光度法可用于药物的鉴别、检查和含量测定，是药品检验中应用非常广泛的一类仪器分析方法。《中国药典》附录收载有紫外分光光度法。

二、基本原理及组成 1．基本原理

（1）紫外-可见光谱的性质：分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态转变为高能量的激发态的过程称为跃迁。被测物分子的价电子吸收紫外光或可见光，从低能级跃迁到高能级，产生吸收光谱。

（2）紫外-可见分光光度法的分析步骤：供试品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可见分光光度计，绘得吸收图谱。

（3）定性依据：被测物的结构不同，其电子跃迁方式不同，则产生不同的吸收光谱。根据

图谱中的峰位（即最大吸收波长λmax）、谷位（即最小吸收波长λmin）、最大吸收波长处的吸收系数（即E1mλmax）、有无肩峰、特定波长处的吸收度比值等，可以对被测物进行定性。

（4）定量依据--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL

式中，A为供试液的吸收度；T为透光率；E为被测物的吸收系数；C为供试液浓度；L为液层厚度；I0为入射光强度；I为透射光强度。

（5）吸收系数：是物质的特性常数。分为百分吸收系数E1m和摩尔吸收系数ε。

2．基本组成

（1）基本组成：光源→单色器→吸收池→检测器→数据记录和处理。 （2）光源：紫外光区通常采用氢灯或氘灯，可见光区采用钨灯或卤钨灯。

（3）单色器：由色散元件（棱镜或光栅）和狭缝（过宽，光强小，检测灵敏度降低）组成。 （4）吸收池（比色皿）：紫外光测定用石英吸收池；可见光测定用玻璃吸收池。 （5）检测器：常用光电池、光电管、光电倍增管、光二极管阵列检测器。

三、754紫外可见分光光度计操作方法

（一）用途：能在紫外、可见光谱区域对样品物质作定性和定量的分析。 （二）波长范围：200nm-800nm。 （三）操作要点：

1、插上电源，打开开关，打开试样室盖，按“A/T/C/F”键，选择“T%”状态，选择测量所需波长，预热30分钟。

2、开始测量时要先调节仪器的零点，方法为：

保持在“T%”状态，当关上试样室盖时，屏幕应显示“100.0”，如否，按“OA/100%”键；打开试样室盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按“0%”键，重复2-3次，仪器本身的零点即调好，可以开始测量。

3、用参比液润洗一个比色皿，装样到比色皿的3/4处（必须确保光路通过被测样品中心），用吸水纸吸干比色皿外部所沾的液体，将比色皿的光面对准光路放入比色皿架，用同样的方法将所测样品装到其余的比色皿中并放入比色皿架中。

4、将装有参比液的比色皿拉入光路，关上试样室盖，按“A/T/C/F”键，调到“Abs”， 按“OA/100%”键，屏幕显示“0.000”，将其余测试样品一一拉入光路，记下测量数值即可（不可用力拉动拉杆）。

5、测量完毕后，将比色皿清洗干净（最好用乙醇清洗），擦干，放回盒子，关上开关，拔下电源，罩上仪器罩，并打扫卫生，才可离开。 6、本操作要点只针对测量吸光度而言。

（四）注意事项：

1、仪器使用前需开机预热30分钟 2、开关试样室盖时动作要轻缓

3、不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器 4、一定要将比色皿外部所沾样品擦干净，才能放进比色皿架进行测定

（五）仪器的校正和检定 1目的：保证测定结果的准确性。

2规定：定期对仪器进行全面校正检定外，还应于测定前对波长进行校正（采用汞灯或氘灯的特征谱线）；吸收度的准确性采用重铬酸钾的硫酸溶液来检定；杂散光则采用碘化钠和亚硝酸钠溶液进行检查。

（六）吸收度的测定方法

1对溶剂的要求。充分溶解样品、不与样品作用、挥发性小、在测定波长处无干扰（透明）。以空气为空白，溶剂吸收度在220～240nm范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上不得超过0.05。 2空白对照试验。用溶剂调节仪器，使吸收度为0或透光率为100%，然后测定样品池的吸收，此时的吸收即为供试品的吸收。

3测定波长确证。采用1cm的石英吸收池，核对供试品吸收峰的位置，应在规定吸收峰波长±2nm以 以内。

4供试品溶液的浓度。使用吸收度在0.3～0.7范围内所对应的供试品溶液的浓度。 5仪器的狭缝宽度。过大，光纯度变差，则A降低；应以减少狭缝宽度，A不再增加为准。

（七）应用

1鉴别。同一物质的UV谱应该相同，但是，相同的UV光谱不一定代表同一物质。为了提高UV光谱的专属性，《中国药典》采用下列方式：①对比光谱的特征参数：λmax、λmin、E1m、A、肩峰、吸收谷。②对比吸收度比值的一致性。③对比吸收光谱的一致性。 2杂质检查。利用药物和杂质的吸收光谱有明显差别进行检查。若药物无吸收，杂质有吸收，可通过控制其吸收度不得超过规定值控制杂质限量；若药物有吸收，杂质吸收很弱或没有吸收，也可以通过控制其吸收度控制杂质限量。

3含量测定。

(1) 对照品比较法。在相同的条件下分别测定供试液（CX）和对照液（CR）的吸收度AX 和AR，按下式计算含量：CX=（AX/AR）CR

(2) 吸收系数法。在规定波长处测定供试液的吸收度，依被测组分的吸收系数计算含量。 使用吸收系数法测定时，对仪器须进行严格的校正和检定，如波长的准确度、狭缝宽度等必须符合要求，以保证吸收度测定的准确性。

(3) 计算分光光度法。将测得的吸收度进行适当的数学处理，求得待测组分的含量。例如， 双波长分光光度法、导数光谱法等。主要用于消除样品中干扰组分的干扰。 (4) 工作曲线法。配制系列的标准溶液，绘制工作曲线，从中查得供试液含量。

3含量测定。

(1) 对照品比较法。在相同的条件下分别测定供试液（CX）和对照液（CR）的吸收度AX 和AR，按下式计算含量：CX=（AX/AR）CR

(2) 吸收系数法。在规定波长处测定供试液的吸收度，依被测组分的吸收系数计算含量。 使用吸收系数法测定时，对仪器须进行严格的校正和检定，如波长的准确度、狭缝宽度等必须符合要求，以保证吸收度测定的准确性。

(3) 计算分光光度法。将测得的吸收度进行适当的数学处理，求得待测组分的含量。例如， 双波长分光光度法、导数光谱法等。主要用于消除样品中干扰组分的干扰。 (4) 工作曲线法。配制系列的标准溶液，绘制工作曲线，从中查得供试液含量。

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