总结-酵母酶活测定

2.9.3 β-Galactosidase 酶活定量实验

参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。 酵母酶活测定，

准备：每个样品，8 ml 的YPD培养基，Y190 菌株（转化用）。 Z buffer， Z buffer+beta-巯基乙醇， Z buffer+ONPG， NA2CO3

1) 准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌，同时将ONPG溶解在Z缓冲液中（4 mg/ml，调pH 7.0）并振荡混匀1-2 hr；

2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1 min，立刻取出2 ml加入8 ml的YPDA中；

3) 30℃ 250 rpm摇3-5 hr，测OD600在0.5-0.8之间并记录确切OD值； 4) 取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液，14,000 rpm离心30 sec，小心弃上清，加入1.5 ml Z缓冲液，振荡以重悬菌体；

5) 离心去上清，加入300 μl Z缓冲液重悬菌体（则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍）； 6) 取0.1 ml至新管中，液氮冷冻0.5-1 min，37℃ 0.5-1 min使其融化； 7) 反复冻融3次以上使细胞尽可能破碎；

8) 取一个新管加入100 μl Z缓冲液作为空白对照；

9) 每管中加入0.7 ml Z缓冲液+β-巯基乙醇，加入160 μl 溶在Z缓冲液中的ONPG同时开始计时，将管置于30℃温浴；

10) 当溶液变为黄色时，加入0.4 ml Na2CO3中止反应，计录反应时间t； 11) 14,000 rpm离心10 min，取上清，测OD420值； 12) 计算β-Galactosidase 酶活：

β-Galactosidase units=1,000×OD420（t×V×OD600） t为反应时间（第10步记录） V为0.1×浓缩倍数（第5步记录） OD600为第3步所测OD值

2.9.4 提取酵母蛋白

参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。 1) 接酵母菌于SD/-Leu /-Trp培养基中，30℃摇培过夜； 2) 扩培至50 ml YPDA培养基中，30℃摇培至OD600为0.4-0.6，计算总OD600值：测得的OD600值×培养液体积；

3) 将菌倒入预冷的离心管中，4℃ 1000×g 5 min，弃上清，细胞重悬于50 ml预冷的超纯水中；

4) 4℃ 1000×g 5 min，弃上清，冷的超纯水再洗一次，沉淀冻到液氮中，继续下面的实验或冻存于-80℃；

5) 每7.5 OD600加入100 μl 60℃预热的裂解缓冲液（用前加入PMSF和cocktail，因PMSF 有半衰期，需每隔7 min补一次），60℃水浴小于2 min使菌体融化并重悬起来；

6) 转移到1.5 ml的EP管中，加入适量glass beads（80 μl/7.5 OD600），70℃ 10 min，剧烈振荡1 min；

7) 4℃ 14,000 rpm离心5 min，将上清转移至新的EP管中并置于冰上；

8) 沉淀置于100℃ 3-5 min，剧烈振荡1 min，4℃ 14,000 rpm离心5 min，小心吸取上清，并将两次的上清合到一起；

9) 100℃ 10 min煮样，即可进行western blot。 试剂配置

YPDA培养基：1 L配方：20 g Difo peptone，10 g Yeast extract，15 ml 0.2% adenine hemisulfate solution，加水至950 ml，灭菌后冷

却至55℃再加入50 ml 40%的葡萄糖（葡萄糖溶液可112℃灭菌或抽滤灭菌），若为固体培养基灭菌前还需加20 g/L Agar；

SD/-Leu /-Trp培养基：6.7 g/L Yeast nitrogen without amino acids，0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplement，若为固体培养基需加20 g/L Agar，灭菌；

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基：6.7 g/L Yeast nitrogen without amino acids，0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp DO supplement，若为固体培养基需加20 g/L Agar，灭菌；

贮存液：10×TE：0.1 M Tris-HCl，10 mM EDTA，调pH 7.5灭菌，

10×LiAc：1 M LiAc，乙酸调pH 7.5灭菌， 50% PEG4000；

PEG/LiAc：40% PEG，1×TE，1×LiAc；

Z缓冲液：16.1 g/L Na2HPO4·7H2O，5.5 g/L NaH2PO4·H2O，0.75 g/L KCl，0.246 g/L MgSO4·7H2O，调pH 7.0并灭菌；

Z缓冲液+β-巯基乙醇：100 ml Z缓冲液加入0.27 mlβ-巯基乙醇；

裂解缓冲液：储存液：8 M尿素，5% SDS，40 mM Tris-HCl（pH6.8），0.1 mM EDTA，0.4 mg/ml溴酚兰，使用前每毫升储存液加入10 μl β-巯基乙醇，并加蛋白酶抑制剂PMSF和cocktail。

2.10 酵母互补实验

所用的载体为Dr. Hiten D. Madhani实验室（University of California）惠赠的p415-ADH1改造，用ADH1启动子驱动或将ADH1启动子换为酵母BRE1启动子，分别连接拟南芥的HUB1和HUB2基因，构建好的质粒转化酵母bre1Δ（YM1740），空载体转化野生型YM1736（S288C）及bre1Δ（YM1740）作为对照，统计细胞体积大小参照Hwang et al.（2003）进行，大体流程如下：

1) 将酵母菌接于SD/-Leu培养基中，30℃摇培至OD600 0.6-0.8； 2) 加入2%甲醛，30℃ 20 min固定；

3) 离心收集菌体，用0.1 M的磷酸钾（pH6.5）洗2次； 4) 细胞重悬于1 ml P溶液中（0.1 M的磷酸钾[pH6.5]，1.2 M山梨醇），4℃待用；

取10 μl加入1 ml 0.1 M的磷酸钾（pH6.5），用流式细胞仪统计细胞体积的大小，每个株系统计约3-5×104个细胞。

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