基因工程实验手册

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。 (一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。

目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。 2．载体的选择

DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。其中以质粒载体最常用。

质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。它的存在与否，一般说来，对细胞的生存并没有决定性的影响。

根据复制是否受染色体复制功能所控制，质粒可分为严紧型质粒----即每个细菌细胞是可含1～3个拷贝和松驰型质粒----每个细菌细胞一般含10个以上拷贝。

质粒具有不相容性，即在没有选择压力的条件下，两种不同的质粒不能稳定地共存于同一宿主细胞内。相互不相容的质粒属于同一不相容群；而属于不同的不相容群的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

许多质粒本身除作为一个复制子具有复制和调控系统外，还携带一些功能各异并赋予其

-1-

宿主以不同表型特征的基因，如具有抗生素抗性等。作为一种克隆载体，能提供某种特殊表型，为其作为载体进行基因操作带来很大方便。

由于天然质粒的这些基本特性，使其可用作克隆的载体，但并不一定是理想的载体。作为理想载体，它应该具备如下条件：

(1)应该具有能自主复制的复制子，并且有能使所携带的外源DNA忠实复制、高效表达所需的调控系统。

(2)对多种限制性核酸内切酶有单一切点，而且酶切点最好位于易于被检测的表型基因上。 (3)能够赋予宿主细胞易于检测的表型。 (4)分子量小，多拷贝。 (5)携带外源DNA的幅度较宽。

(6)从生物防护的角度考虑，应当是安全的。 (二)目的DNA片段与载体DNA体外重组。

将载体DNA与目的DNA片段剪切，并在体外进行连接，得到重组子。 1．DNA分子的剪切

对DNA分子的剪切，通常采用限制性内切酶进行酶解。除了酶解外，还可用化学降解和机械剪切法等方法对DNA分子进行剪切，不过这些方法因对DNA的剪切缺乏特异性，较少使用。

2DNA分子的连接

带有目的基因的DNA片段与载体DNA，由限制性内切酶作用产生的末端相结合形成结合体时，在接头处需要DNA连接酶把缺口修复，形成一完整的双链。大肠杆菌产生的和T4噬菌体感染的大肠杆菌产生的DNA连接酶，均能封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。它们催化的反应十分类似，但它们所需要的辅助因子不同。T4 DNA连接酶需要ATP，而大肠杆菌DNA连接酶则需要NAD。这两种辅助因子在反应中分别释放出焦磷酸(PPi)和烟酰胺单核苷酸(NMN)的同时，均形成酶-AMP复合物。这种复合物同时表现出一个5′-磷酸和3′-OH基团的缺口结合，并在磷酸二酯链上形成一个共价键。连接DNA缺口的最适温度是37℃，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此，连接粘性末端的最适温度是介于酶作用速率与末端结合速率之间，大约15℃。 将DNA片段连接成为人工重组体的方法有四种。 (1)粘末端法

用限制性内切酶产生单股粘末端。两种DNA片段都用同一种限制酶降解，产生相同的粘末端。在退火条件下，末端单股间碱基配对，在DNA连接酶作用下，共价连接封闭成新的DNA分子。 (2)接尾法

用末端核苷酸转移酶在DNA片段上制造一个粘末端，如在外来DNA片段3′-端加一小段单股的poly(dA)或(dG)，在载体DNA的3′-端加上一段Poly(dT)或(dC)，利用

-2-

Poly(dA)·Poly(dT)或Poly(dG)·Poly(dC)形成碱基配对，两片段用连接酶连接起来。 (3)平末端法

有些限制酶(如EcoRⅤ)切割产生的DNA片段不具有粘末端，而是平末端。如用其他方式产生的片段，用对单股DNA特异的核酸酶S1修平，或DNA聚合酶Ⅰ补平而形成的平末端，亦可通过T4DNA连接酶作用，连成新的DNA分子，但效率低，只有粘末端的1%。 (4)人工接头法

有时我们所需要的DNA片段不含有适于产生粘末端的限制酶识别序列，可通过人工合成的或利用现有的DNA片段上的限制酶识别序列，加在外源基因片段或分子载体上，使它们具有限制酶的新切点。由于此法的应用，几乎可使所有的DNA片段插入现有的载体分子中去进行无性繁殖。这种化学合成的具有限制酶末端的片段称为人工接头，用它可以把平末端的片段连接起来。用平末端连接法将人工接头接在待克隆的基因的两端，然后用限制酶(如EcoRⅠ)处理，产生具有粘性末端的片段，这些片段便能连到已用相同限制酶处理过的载体分子上。借助这种人工接头，产生了位于外源DNA两端的限制酶识别序列，使得外源DNA在宿主菌中克隆化和扩增之后，能恢复原状。

DNA分子连接反应在高浓度DNA溶液中进行，可增加重组体的产率比例。在稀溶液中，由于分子间反应频率下降，有利于线性片段发生环化。用碱性磷酸酶处理线性化的质粒载体DNA去掉5′-磷酸，便阻止了环化作用和质粒二聚体的形成。只有插入未经磷酸酶处理的外源DNA片段提供5′磷酸，才能使载体环化。 (三)重组体转入受体细胞。

外源基因DNA片段与载体组成的重组体，需先转化入受体细胞，才能进行增殖与表达。把重组质粒DNA转入受体细胞叫转化，把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞叫转染。转化的成功与否，首先要使受体细胞处于感受态。大肠杆菌被广泛采用作为受体细菌。使受体细胞呈感受态最简便的方法是用0.01～0.05mol/L氯化钙处理，加入重组体DNA，置低温温育后，在42℃短时间热冲击来提高转化率，然后缓慢加入培养基，生长后在培养基平板上筛选转化子。

(四)重组体克隆的筛选与鉴定

重组DNA分子上如含有的基因是由纯化的mRNA合成的cDNA或PCR产物，只需作少量筛选即可获得所需克隆。但若要从基因库中选出某一特定基因，那么筛选工作就比较复杂。

重组体的选择主要有以下几种方法：

(1)通过表型直接筛选(利用载体的遗传标志：抗生素抗性、噬菌斑形成等)； (2)菌落或噬菌斑原位分子杂交； (3)免疫化学法； (4)遗传互补法。

筛选出重组体后，还必须对重组体DNA进一步鉴定。一般作凝胶电泳鉴定，酶切图谱分析及PCR分析等。除此之外还可采用基因产物分析或对核苷酸序列分析等方法进行鉴定。

-3-

(五)外源基因表达产物的分离纯化

由于表达载体不同，外源基因表达产物存在形式不同，有的以融合蛋白形式存在，有的以包涵体形式存在，有的分泌到细胞外，具体分离纯化方法应根据表达产物的性质及表达产物在细菌培养物中的存在形式设计分离纯化方法。

-4-

实验一 PCR技术

总 论

一、基本原理

PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，是由三个基本反应组成的循环性过程。 1．变性：加热将所要扩增的双链DNA解链成单链DNA，

2．退火：使温度下降，寡聚核苷酸引物与所要扩增基因两侧DNA按碱基配对原则结合。 3．延伸；在适当的缓冲液中，Mg2+及4种dNTP存在下，DNA聚合酶能忠实地按模板的碱基顺序合成互补链，即从引物的3′-OH延伸，方向为5′ 3′。可合成与模板顺序完全相同的DNA。

变性、退火、延伸三步反应反复循环，每循环一次所生产的DNA均能成为下一次循环的模板。n为循环次数，因此20次PCR循环将产生约一百万倍(2)的扩增产物。 二、影响PCR的因素 1．耐热DNA聚合酶

(1)背景：耐热DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermusqauaticun,Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶。Taq酶是从水生栖热菌菌株YT中分同的DNA聚合酶，该菌能在70～75℃的环境中生长，1969年从美国黄石国家公园的一个温泉中分离出了这个菌侏。

由于采用了耐热DNA聚合酶，才必变了PCR的命运，使PCR广泛应用成为可能。一开始PCR所用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片，由于该酶不耐热，在一个循环中，变性之后都要加酶，20次循环要加20次酶，这样PCR反应成本很高，一般实验室无法开展工作。每次都加酶，也使反应复杂。

自1987后,TaqDNA聚合酶被纯化和使用后，PCR技术就在分子生物学的各个领域等于到了非常广泛的应用。从这个意义上讲，是TaqDNA聚合酶给PCR技术注入了新生命力。当然，PCR技术也促进了TaqDNA聚合酶 的研究，使TaqDNA聚合酶的因很快被克隆并在大肠杆菌中表达，酶的产率存了很大提高，使重酶成本大大降低。 (2)性质：(以TaqDNA聚合酶为例) ①温度与酶活性 最适温度75～80℃ 70℃延伸率 60NT/S 55℃ 24NT/S 37℃ 1.5NT/S 22℃ 0.25NT/S 〉90℃无DNA合成

虽然90℃以上不能合成DNA，但较稳定。92.5℃作用130min,活力保持50%，95℃可耐受40min，97.5℃可耐受5 ～ 6min。PCR中，变性温度95℃30秒，50次循环之后，Taq聚合酶活性仍可保持75%。

-5-

20

②离子与活性

对Mg敏感，Mg浓度适中直激活作用，浓度太高抑制酶活性。 ③核酸外切酶活性

没有3′→5′酸外切酶活性。

有依赖于DNA合成作用的，链置换的5′→ 3′核酸外切酶活性。 ④其他：

适当浓度(50mmol/L)KCl激活50～60%，高于此浓度抑制活性。 ⑤错误率(碱基配对不忠实)

每80，000碱基对中错一个，25轮循环之后，400个碱基对中错一个，dNTP与Mg增高，错误率加大。 (3)用量：

反应总体积为100μl时，酶用量为1～2.5U然而，由于DNA的不同和引物不同，以及其他条件的差别，Taq酶用量亦有差异。Taq酶的试验用在0.5～5IU之间，根据电泳结果决定酶的最佳用量。若酶的用量偏高，有非特异性产物出现。若酶的用量偏低，则合成产物量少。 2．模板：

(1)DNA模板(基因组DNA) ①样品处理

血液、血斑、精液、精斑、羊水、口腔上皮细胞 、尿样、毛发、石蜡包埋组织等都可以提取DNA进行PCR。 ②模板量：10～10目的分子

1μg人基因组DNA单拷贝基因约含3×10目的分子 10ng酵母细胞约含3×10目的分子 1ng大肠杆菌细胞约含3×10目的分子 1/100 M13噬菌斑约含10目的分子 ③模板量与循环次数的关系

目的分子数 循环次数 3×10 25～30 1．5×10 30～35 1×10 35～40 50 45～50

若模板来源困难，以合适模板量及最小循环数为宜。 3．引物的条件： ①长度

与模板顺序互补的分应为15～30个核苷酸(NT)常用20NT左右。近年来，由于引物合成

-6-

3

45

6

55

6

5

6

2+

2+

2+

成本的降低，为了增加特异性，引物长度有增加的趋势。 ②跨度

常扩增2Kb以下的片段，但长片段扩增试剂盒也可扩增10kb以上，有的达数10kb。 ③顺序

要求特异的顺序。可通过基因数据库检测与相关基因的同源性。 ④碱基

GC为40～60%，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异性条带，ATGC最好随机 分配，避免成串的嘌呤和嘧啶，任一碱基的百分含量都在10%～40%之间，不出现5个以上同一核苷酸的寡聚体。 ⑤Tm值

PCR引物的Tm值应为55～80℃。

对于PCR引物，Tm值计算一般以每个G或C 4℃，每个A或T2℃计算，即： Tm=4×(G+C)+2×(A+T) ⑥二级结构

避免引物内部出现明显的二级结构。 ⑦引物间互补

一对引物的顺序不应互补，尤其是避免3′端的互补，以免形成引物二聚体。 ⑧引物二端

3′端：3′端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基要求绝对配对。如果不知扩增序列，而是从氨基酸推测DNA的顺序，引物的3′端最好选择只有一个密码子的甲硫氨酸或色氨酸，如果3′端最末的碱基不肯定，可用次黄嘌呤取代，因为次黄嘌呤(Ⅰ)可与ATGC配对，这样可避免因3′末端碱基不配对而造成PCR失败。

5′端：引物5′端要求不严格，5′可附加一段与模板非互补的序列，可长至45NT，而不影响扩增。 ⑨cDNA引物

除了上述条件外，还应注意：

二个引物应跨越一个或二个内含子，或选择二个外显子剪接处的顺序，这样可以避免基因组DNA的污染而影响结果。引物退火时就不五基因组DNA结合，而只与cDNA结合。 (2)引物量

每条引物的浓度为0.1～1μmol或100pmol～1000pmol转换成μg必须乘以分子量。如0.1μmol 引物转变为μg则为0.1×引物分子量。

引物的精确分子量可用下列公式计算：

引物分子量＝An×312.2 + Gn×328.2 + Cn×288.2 + Tn×303.2 – 61（ An、Gn、Cn和Tn分别为A、G、C和T的数量）。

合成引物时，含量单位常用A260或OD260表示。

-7-

1A260单位指溶于1ml pH7.0磷酸缓冲液在1.0cm光路中测定260nm的光密度值为1.0的冻干寡聚核苷酸量

1A260单位单链DNA=33μg (3)引物应用样品的制备与保存。

引物可直接溶于水或pH7.0(或溶于接近pH7.0)的缓冲液 保存：冻干粉－20℃数年 溶液：－20℃数月 (4)改变引物产生的新型PCR ①反向PCR

典型的PCR是对两个已知序列之间DNA片段扩增。然而反向PCR则将位于已知序列两侧的末知序列进行扩增。用适当的限制性内切酶在已知序列外侧目的基因两端切开DNA链，使酶切片段自身连接形成环状分子，从而将外侧区域化为内侧区域，设计与已知序列末端同源引物，并使其3′端朝向未知区域 ，则可以用PCR扩增环中的未知区域。 ②锚定PCR

如果待扩增的序列只有一端是已知的，别一端是未知的，则可以用锚定PCR进行扩增。例如，要扩增一个感兴趣的mRNA，已知3′端序列，5′端序列不清楚。通过反转录酶将mRNA转录成cDNA,然后在DNA末端转移酶的作用下，在cDNA3'末端加入Poly(dG)尾巴。根据已知一端的特异序列合成第一个引物、带在Poly(dc)尾的“锚顺序”作为第 二个引物，用PCR可扩增出感兴趣的cDNA。 ③不对称PCR

标准的PCR产生靶序列的双链DNA拷贝。不对称PCR可产生单链DNA。主要方法是在PCR反应中加放不等量的一对引物(比例一般为50∶1或100∶1)，经过若干循环后，其中一种引物消耗完，在随后的循环中，只有一种引物参加反应，结果形成了单链DNA。此方法可用于DNA序列分析和制备单链DNA探针。 ④引物标记PCR

对PCR引物5′端进行标记，使得PCR扩增产物5′端带有相应的标记物(如荧光素、同位素和生物素等)。用P ATP直接将一个PCR引物磷酸化，然后在标准PCR反应中直接使用标记引物，扩增出一端带有标记的片段。这种末端标记法对产物直接测序，不影响PCR反应。这种方法标记后，可用杂交检测PCR产物。它也可以对PCR产物进行定量。用不同颜色的荧光染料标记寡苷酸引物，同时使2个或2个以上的DNA区段扩增，终止扩增后除去未延伸的引物，用紫外光照射扩增产物，就能显示某一种荧光染料的颜色或几种荧光染料的颜色组合，例如单呈红色或绿色，则说明缺失了其中一个DNA区段，若显示黄色(由红色和绿色互补形成)则说明这两个区段均存在。 ⑤多重PCR

多重PCR技术就是在一个反应体系中同时混入多对不同的引物，从而扩增出多段PCR产

-8-

32

物。多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失方法。 ⑥加端PCR

加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA顺序的PCR。加端PCR的引物被设计成除与模板配的一部分以外再加上若干碱基这样便能使增产物的末端加上额外的一段DNA。1986年Scharf等利用加端PCR技术在扩增产物末端加上一个限制酶的识别顺序。以后，有人发现引物足够长时扩增产物的末端甚至可加上多至数十个碱基。应用这一方法可以在扩增产物的末端加上特定功能的DNA片段。 ⑦重组PCR

含两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。分子遗传学研究工作中要求引入的点突变、插入或缺失往往并不处于DNA链的末端，所以加端PCR有它的局限性。1986年Mullis等报道了由PCR扩增的两个DNA分子。这一技术可应用于在DNA片段的任何位置引入位点专一性突变、插入、缺失等以及两个不相邻片段的连接。 4．dNTP

四种脱氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度通每种用20～200μmol/L，过高的浓度导致聚合酶将其错误掺入，影响扩增产物；dNTP用量控制在循环50次后，dDNTP仍保留50%，采用等浓度的dNTP可减少误掺入错误，用低浓度的dNTP比用高浓度dNTP有更好的特异性、准确性，dNTP用量与目标序列组成长度有关。值得注意的是dNTP与Mg2+结合影响游离的Mg2+含量、dNTP改变，Mg2+改变。中性的dNTP可直接从试剂公司购得(pharmacia、Sigma、华美)如果购买冷冻干燥的粉剂，可以自配溶液，但自配的溶液必须用NaOH中和，用前用紫外吸收法测定浓度。一般应将dNTP应保存在-20℃ 5．Mg2+

Mg2+浓度对扩增作用的专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mmol/L左右(每种dNTP 200μmol/L)。Mg过高，导致非特异性扩增产物。过低则降低扩增产物量。 6．循环参数

各步温度、时间与引物长度及GC含量有关。升、降温度速度快则减少扩增时间，复性效果好。如果变性温度高，则酶活性损失大，变性温度低，则不能全变性，扩增产物产量降低。

退火温度可采用引物Tm-5。

退火与延伸温度合二为一则成为二温循环PCR，其优点是增加特异性和减少反应时间。7．PCR仪 8．产物 (1)凝胶电泳分析

1.5～4%琼脂糖凝胶，分离100～1000bp小片段。 6～10%聚丙烯酰胺凝胶分离小于100bp片段

产物回收：用2～3%低融点脂糖糖凝泳分离。加等体积的苯酚、氯仿，65℃溶化，混匀、

-9-

2+

振荡、速冻、高速离心、上清液加NaCl至0.3mmol/L,用两体积无水乙醇沉淀。 (2)特异性的分析 ①大小与预计一致 ②酶切、切点与设计一致 ③探针杂交 ④顺序分析 (3)不出现扩增条带 ①酶失活，调换新酶

②模板中含有杂质，特别是甲醛固定石蜡包埋的组织，往往常含有甲酸，造成DNA脱嘌呤而 影响PCR结果。

③模板变性不彻底模板先在沸水浴中加热5分钟，后立即冰浴中速冷。 ④引物变质失效

⑤反应体积改变为20μl～100μl温度平衡慢。 (4)非特异条带的出现

①非特异小片段：引物二聚体，引物过量，3′重叠。

②非特异大片段：引物过量，引物顺序特异性不高，循环次数多，酶质量不好，酶量多。 改进：降低酶量或调换酶，增加模板量，降低引物量，减少循环次数，提高退火温度，重新设计较长一点的引物。 (5)出现整个涂沫条带

原因：酶过量，质量差，dNTP过量，循环数过多，退火温度过低MgCl2，浓度过高。 改进办法： ①减少酶量，换酶。 ②减少dNTP。

③增加模板量，减少循环数。 ④改用二温度PCR循环。 ⑤MgCl2过高，降低。 9．污染问题 (1)污染源：PCR产物

(2)防止污染措施，PCR反应前后所用试剂、器材分开存放，设计阴性对照。

-10-

成分 10×连接Buffer

回收的PCR产物（100ng/μl）

T载体（50ng/μl） T4DNA连接酶（6WeissU/μl）

ddH2O 总体积

10 000r/min离心5s混匀。

用量 1 5 1 1 7.0 15.0

放在调好16℃的保温瓶内，并将保温瓶装盖严，置4℃冰箱冷藏式放置过夜。 三、试剂

1．10×T4DNA连接酶缓冲液 660mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 55mmol/L MgCl2 50mmol/L DTT 10mmol/L ATP 2．无菌水 3．T4DNA连接酶 四、说明 1．连接缓冲液

现使用的缓冲液多数是随商品连接酶由厂家同时提供的。也可自己配制。常用的缓冲液为Tris-HCl溶液，pH7.5,使用时需加含-SH的化合物如疏基乙醇和二硫苏糖醇，还应有一定浓度的Mg2+及新鲜未降解的ATP。除此之外，还常加入一定量的牛血清白蛋白。为了保证ATP不被降解，每次要用新鲜的，也可直接配制在连接缓冲液中，因为在连接缓冲液中ATP比较稳定。连接缓冲液应在-20℃冰箱中保存，储备液不可反复冻融，最好配制后分装保存。 2．DNA连接酶用量

T4DNA连接酶的量以Weiss单位度量。1Weiss单位是20分钟37℃催化1nmol［P］焦磷酸转化到［P］ATP的酶量。连接酶用量与DNA片段的性质有关，如果需要连接平齐末端，必须加大酶量，一般用连接粘性末端酶量的10～100倍。连接平齐末端时，还可加入T4RNA连接酶，在T4RNA连接酶存在下，可使平齐末端的连接效率提高数十倍，但对粘性末的连接并无影响。

3．连接带有粘性末的DNA片段时，DNA浓度一般为2～10μl/ml,连接平齐末端时，需加大DNA浓度至100～200μg/ml(这里浓度的计算以假定DNA片段长度为200～5000bp对为前提)。提高DNA浓度将促进分子间的连接，降低浓度对分子本身环化有利。

4．连接反应后，反应液可在0℃储存数天，-8℃储存2个月。但是，在-20℃冰冻保存将会

32

32

-21-

降低转化效率。

5．粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定。所以，尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，温度以15～２０℃为宜。

6．5mmol/L ATP将完全抑制T4DNA连接酶连接平齐末端，而181mmol/L ATP才能抑制粘性末端的连接。连接反应液中ATP浓度一般在0.5-1mmol/L范围内。

-22-

实验五 重组DNA的转化

一、原理 1．转化的概念

外源基因DNA片段与载体组成的重组，需先进入受体细胞，才能进行增殖与表达。以质粒为载体得到的重组体或重组子是重组质粒。把重组质粒DNA转入受体细胞(菌)称为转化。把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞(菌)叫转染。 2．感受态

感受态就是细菌吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。所以要转化成功，首先要使受体菌处于感受态。刺激细菌使之成为感受态的方法很多，如CaCl2处理、电激等。 3．DNA转化的过程

受体菌以Ca2+处理，在低温中与外来DNA分子相混合，DNA分子转化的复杂过程包括4步：

(1)吸附—完整的双链DNA分子汲附在受体菌的表面；

(2)转化—双链DNA分子解链，单链DNA入受体菌，另一链降解； (3)自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环装DNA； (4)表达—供体基因随同复制子同时复制并被转录、转译。 二、方法 

(一)受体菌的培养与CaCl2处理

1.从固体培养基平板上吊菌接种到2mlLB试管中，37℃振荡培养过夜。 2.取0.4ml菌液转接到30ml/150ml三角烧瓶中，振荡培养2小时30分钟以上， 3.取9ml菌液于灭菌有盖离心管4000 r/min离心5分钟，收集菌体。

4.把菌体悬浮在75mmol/L CaCl2中(约10毫升左右)，冰浴25分钟，4000r/min离心5分钟，收集菌体。

5.再把菌体悬浮在0.6毫升的75mmol/L冷CaCl2中，使菌液浓缩15倍(9毫升～0.6毫升)，冰上作为转化用的受体菌菌液。 (二)转化反应

1．在灭菌的1.5ml离心管中加入50μl新鲜制备的DH5α感受态菌及5μl的连接产物，混匀后冰浴30min。

2．将离心管移入42℃水浴中，恰好停留90sec（切忌振荡）。使受体菌极短暂热刺激，以利于DNA的吸收，提高转化效率。

3．立即将离心管置于冰浴中，120sec后再移入37℃水浴中孵育5min。

4．向离心管中加入200μlLB液体培养基，在37℃恒温振荡器上以110r/min培养1h。以利转化后的受体菌，在良好的环境(通气、新鲜的LB液体培养基)中繁殖生长。 (三)涂板

1取反应物在平板上涂布。

-23-

2涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37℃温箱中培养过夜。 三、试剂

75mmol/L CaCl2溶液 无水氯化钙4.16克 ddH2O 至500毫升 1.1kg/cm灭菌20min 四、材料 1．菌种 大肠杆菌 DH5α 2．培养基 (1)LB液体培养基 LB液体培养基 精解蛋白胨 3 g 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3 g 葡萄糖 0.6 g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300 ml。用10mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装于15 ml 试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm灭菌20 min。

(2)LB固体培养基：取500ml三烧瓶，加入 琼脂 4克 LB液体培养基 200ml 1.1kg/cm灭菌20分钟 3．抗菌素 Amp(100mg/ml) 五、仪器 1．恒温培养箱 2．恒温振荡器 3．普通离心机 六、说明

1．连接后的DNA溶液与细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作。如果温度时高时低，转化率极差。

2．DNA连接液的盐浓度较高，与细胞混合时要加以稀释，因为高盐浓度会影响转化率。 3．外源DNA的大小和结构对转化效率有很大影响，一般说来，分子越小，转化效率越高；环形分子的转化效率比线形分子的转化效率要高等于多。共价闭环的超螺旋的质粒DNA比同

-24-

2

2

2

种线形DNA分子的转化效率高上千倍，因此，在转化前要尽量保证重组DNA为完整的环状分子。

4．用于转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高，静止生长期以后，转化能力逐渐丧失。

-25-

实验六 质粒DNA的提取

一、原理：

采用碱变性法抽提质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

很多生物试剂公司还提供试剂盒用于小量质粒DNA的提取。通常情况下，采用试剂盒都能获得较高质量的DNA，所得到的DNA都可直接用于转染、测序及限制酶分析等。下面介绍二种试剂盒。 二、方法

方法1(博大泰克B型质粒小样快速提取试剂盒)

1．挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含pUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试管)中，37℃震摇培养过夜。

2．将1.5ml菌液加入微离心管中，14 000r/min,离心10s，弃去上清液。反复数次，收集全部菌体。

3．倾去上清，滤纸吸干。

4．加100μl 溶液1，震荡起菌体。

5．加150μl 溶液2，立即轻柔颠倒离心管，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮，然后将离心管防止冰上1-2分钟。

6．加150μl 溶液3，立即温和点到数次,室温放置5分钟，12000rpm离心12min。 7．将420ul结合缓冲液加入离心吸附柱上，然后将步骤6中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12000rpm离心30秒。倒掉废液收集管中废液。

8．加入750ul漂洗液于离心吸附柱，静置1分钟后，12000rpm离心15秒，倒掉废液收集管中废液。重复一次，倒掉废液后，再次于12 000r/min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 9．小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中，加入适量的洗脱缓冲液，常规50ul，室温放置2-5分钟，12 000r/min离心1分钟。

方法2（BioFlux Biospin质粒DNA小量提取试剂盒） 1．将1-1.5ml过夜培养的菌液加入1.5ml离心管中。 2．于10 000rpm(8000-10000g)离心30秒，并去处上清。 3．加250ul Resuspension Buffer,重悬细菌沉淀。

4．加250ul细胞Lysis Buffer,轻柔颠倒4-6次。（不要剧烈震动，防止基因组DNA被剪切，注意不要让反应持续超过5分钟）

-26-

5．加350ulNeutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4-6次。 6．于13000g（大于14000rpm）离心10分钟。

7．将步骤6离心后得到上清转移到Spin column内，于6000g（小于等于6000g）离心1分钟，并弃去接液管中的液体。

8．向Spin column内加入650ul Wash Buffer，于12000g离心30-60秒，并弃去接液管中的液体。

9．重复第8步一次。

10．再次于12000g离心1分钟，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。 11.向Spin column内加入50ulElution Buffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。

12．于12000g离心1分钟，1.5ml离心管溶液中含有质粒。 三、材料 1菌种： 2培养基 LB液体培养基 精解蛋白胨 3 g 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3 g 葡萄糖 0.6 g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300 ml。用10mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装于15 ml 试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm2灭菌20 min。 3．抗菌素：

氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100 mg/ml。 4. 博大泰克B型质粒小样快速提取试剂盒 5. BioFlux Biospin质粒DNA小量提取试剂盒 四、仪器： 1恒温振荡器。 2低温冰箱-20℃。 3台式高速离心机。 五、说明：

1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭----氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的，包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐

-27-

等。

2．在基因操作实验中，保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统，如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲液对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca2+,如果用磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；TE中的EDTA是二价离子Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离子是脱氧核糖核酸酶的辅助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

3．NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中稳定，但当pH大于12或小于3时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而使染色体DNA与质粒DNA变性。

4．SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合成复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受干扰。

5．3.0mol/L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构)。而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。pH5.2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与SDS-蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：

用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀。一般实验中，用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，使乙醇的最终含量占67%左右。由此可预见，也可用95%乙醇沉淀DNA，但是用95%乙醇使总体积增大，而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因而DNA损失也增大，影响收率。

乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度0.1～0.25mol/L。在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。但当加入的盐溶

-28-

液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。

乙醇沉淀DNA，一般采用低温条件，这是由于在低温条件下，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀，一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。 除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇，最终除去其残留部分的难度更大。此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时更容易发生，所以一般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。 7．影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。 (1)菌株

质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。一般最好选用enA基因突变的宿主菌，如DH5α，JM109和XL1-Blue等。使用含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。

enA基因是核酸内切酶Ⅰ。核酸内切酶Ⅰ是一种12kDa的壁膜蛋白，受镁离子激活，可被EDTA抑制，对热敏感。双链DNA是核酸内切酶Ⅰ的底物，但RNA是该酶的竞争性抑制剂，能改变酶的特异性，使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性，变为平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸内切酶Ⅰ的功能仍不清楚，enA基因突变的菌株没有明显的表型改变，但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长期核酸内切酶Ⅰ的表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶Ⅰ水平高300倍。此外，培养基中促进快速生长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶Ⅰ水平增高。

此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1-Blue生长速度较慢。HB101及其衍生菌株如TG1及JM100序列，含大量的糖，这些糖如果在质粒纯化过程中不除去，在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活性。 (2)质粒的拷贝数

细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点(replication origin)如pMB1及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进一些特殊的载体时，能降低质粒的拷贝数。此外，太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。一些质粒，如pUC序列，由于经过了突变和改造，在细菌细胞内的拷贝数很大，以pBR322质粒为基础的质粒拷贝数较低，粘粒(cosmid)及特别大的质粒通常拷贝数极低。 (3)细菌培养

用于制备质粒的细菌培养应该从选择性培养的平板中挑取单个菌落培养。不应该直接从甘油保存菌，半固体培养基及液体培养基中挑菌，这可能导致质粒丢失。也不该从长期保存的平板上直接挑菌，这也可能使质粒突变或使质粒丢失。挑取单个菌落至3ml选择性培养基

-29-

中，培养至饱和状态(12～14小时)就可进行小量质粒提取。

-30-

实验七 DNA酶切

一、原理 1．三类限制酶

限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。限制酶可分为3类。Ⅰ类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。在基因工程中Ⅰ类和Ⅲ类限制酶都不常用。常用的是Ⅱ类限制酶。 2．Ⅱ类限制酶

Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。

基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种Ⅱ类限制酶。 3．限制性内切酶

(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoRⅠ识别序列为：

5′?GAATTC?3′ 3′?CTTAAG?5′

对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。 (2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。 (3)同裂酶(同切口限制性内切酶)

一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。这些酶称为同裂酶(Isoschizomers)。

有一些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau AⅠ，识别序列在Bam HI之内。

两种酶切割后得到相同末端，所以这两种酶产生的片段可以连接。 (4)来源及命名

一般采用Smith和Nathans(1973)提出的方法对限制性内切酶进行命名，以产生该酶的微生物属名的第一个字母(大写)种名的前两上字母(小写)，以及菌株型号或质粒、噬菌体名称组成。例如，从Bacillus amyloliquefaciens H中提取的性内切酶称为Bam H；从Haemophilus influenzae Rd中提取的限制性内切酶称为Hin d；从Escherichia Coli RT中提出的酶称为Eco R(大肠杆菌耐药质粒RI)。在同一型号细菌中的几种不同酶可以编成不同的号，如Hin dⅡ、Hin dⅢ、HpaⅠ、HpaⅡ、MboⅠ、MboⅡ等。 (5)限制性内切酶的星活性

一般来说，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。

产生星活性的条件：

-31-

①甘油浓度

②离子强度 高盐缓冲液酶降低盐 ③pH值 7.5～8.5产生

④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V) ⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+ ⑥酶与DNA的比例

酶与DNA比为(50U/μg)产生星活性。为了防止星活性的出现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。 4．影响限制性内切酶反应的因素

限制性内切酶能否有效、特异地切割DNA，最关键的因素有 (1)底物DNA的纯度与物理特性 A．纯度

酶切反应要求最严的成分是底物DNA，酶切产物直接受DNA底物纯度的影响。 提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反应，有些甚至改变识别序列特性，处理办法为酶切前透析或乙醇沉淀。 B．DNA浓度

DNA浓度太稀加量大，含有EDTA影响结果。 C．识别序列位点，及与其邻接的特异性。

限制性内切酶对DNA序列显示高度特性，因此，识别序列内核苷酸的甲基化或糖苷化都会影响酶切反应，识别位点接近末端的程度也影响切割，如EcoRⅠ要求识别序列后在末端至少有一个碱基存在才能切割。 D．DNA的二级/三级结构

识别/切割位点的二级和三级也影响酶切效率，切割超螺旋比线状需要更多的酶。 (2)反应系统

A．缓冲液 pH、Na+离子 B．金属离子Mg2+

C．甘油能使酶稳定，防止长期低温(-20℃)保存时发生冻结。甘油会使很多酶的识别特异 性下降，酶切反应含甘油量应低于5%。 D．水，无机离子

(3)反应体积：酶浓度及EDTA (4)保温时间与温度 二、方法 1.制备质粒DNA。

2．对质粒DNA进行定量，并调整至0.2μg/μl。 3.取一支0.5ml微离心管，加入：

-32-

成分Component 10×Buffer 酶1(10U/μl) 酶2(10U/μl) ddH2O Total volume

10 000r/min离心5s 混匀,37℃水浴60min。

体积volume 1μl 0.5μl 0.51μl 3μl 10μl

Plasmid DNA (0.2μg/μl) 5μl

3.取酶解样品，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶解效果。 三、试剂 1.10×缓冲液。 成分为：

60mmol/L Tris-HCl(pH7.9) 1．5mol/L NaCl 60mmol/L MgCl2 10mmol/L DTT 2.电泳缓冲液：

40mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 20mmol/L NaAC 2mmol/L EDTA

配制方法：先配50倍电泳缓冲液，用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。 3.溴酚蓝指示剂：

称取溴酚蓝200mg，加重蒸水10ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖50g，加蒸馏水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至100ml，加10mol/L NaOH 1～2滴，调至蓝色。

4.EB：(10 mg/ml 溴化乙锭) 5.琼脂糖 四、仪器设备：

恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、紫外检测仪 五、说明

1.酶切时所用DNA的量根据不同需要可有所增减。切点增多，所用DNA量亦相应增加。但是，所用DNA溶液的体积不能太大，否则，DNA溶液中其他成分会干扰酶反应和电泳。 2.酶活性通常用酶单位表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μgλDNA的酶量为一个单位。但是，许多实验室制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当

-33-

增加酶的用量。职有必要，可以用不同的酶量做试验，以决定最适酶量。反应液中加入过量的酶不合适，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的连接反应。

3.市售内切酶一般浓度很大，为节约起见，使用前，可事先用酶反应缓冲液(1x)进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验时，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。

4.延长反应时间，通常可以弥补酶量的不足，但是这对一部分酶不适用，随着反应时间的延长，这些酶的活性迅速下降。

5.在制作酶切图谱时，有时需要用二种酶切割DNA样品，如果这两种酶反就条件一致，可将 酶一起加入反应液。如果二种酶所需缓冲液不同，可采用下列方法：

a.将要求低盐浓度缓冲液的酶先反应，然后加入适量的盐溶液和第二种要求较高盐浓度缓冲液的酶。

b.第一个反应在较小的体积下进行，然后用第二种酶要求的缓冲液稀释。

c.第一个反应完成后，用等体积酚/氯仿处理，水相加0.1倍体积3mol/L醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心，干燥后进行第二个反应。

d.有些生产酶的公司，对双酶同时反应进行了研究，对双酶反应提出了推荐使用的缓冲液，使用所推荐的一种缓冲液，可同时用二种酶对DNA进行酶切。

6.从冷藏处取出酶(包括各种工具酶)，应立即放入冰水中。每次均应用清洁和消毒的吸管应避免限制酶被DNA或其他酶所污染。酶自冰箱取出后，应迅速操作将酶立即放回冷冻处。 7.如果酶切反应体积太大，电泳凝胶槽中装不下时，可用下列方法浓缩DNA；加入EDTA 1/3体积及2份乙醇，于干冰/甲醇浴中冷却5分钟，然后在台式高速离心机上离心5分钟。弃去上清液，其中含有较多蛋白质，可在真空下干燥沉淀。将DNA溶解到适量的TE液。 8.如果需纯化限制性内切酶酶节的DNA片段，可用酚/氯仿提取一次，再用氯仿提取一次，用乙醇沉淀DNA。

-34-

实验八 DNA Southern blot分析

一、原理

Southern杂交，通过对特异性探针结合的基因组DNA片断内或其周围序列进行限制性内切酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。基因组标记的DNA探针先用一种或几种限制性内切酶消化，消化后的片断通过标准琼脂糖电泳按大小进行分离。然后DNA经过原位变性，从胶上转移到固相支持物上。附着于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法可以确定与探针互补的带的位置。

Southern杂交目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 二、方法

（一）细胞基因组DNA的提取

1．吸除原培养基，经胰酶消化转移至1.5ml 离心管中； 2．1000rpm 离心 10min ,去上清；

3．加入200－500ul lysis buffer 55℃ 孵育4－16小时； 4．加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀1min； 5．14000rpm 离心5min; 上清转移至另一干净的离心管中； 6．重复抽提一次；

7．上清转移至另一干净的离心管中，加入1/10 体积的NaAc ,3倍体积的无水乙醇，－20℃

沉淀过夜。（或－70℃ 2h） 8．14000rpm 离心10min,去上清； 9．70%乙醇清洗沉淀2次,室温干燥10min; 10．加入50－100ul TE 55℃ 3-4h溶解沉淀; （二）探针的标记：

1．探针标记：(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ,boehringer Mannheim Cat.No.1585614)

2．依据DNA浓度，在PCR管中加入1ug模板DNA（PCR回收产物），加水至16ul。 3．沸水中，水浴10分钟，迅速放入冰无水乙醇中。 4．加入4ul DIG-HIGH Prime,混匀，短暂离心。 5．37℃水浴孵育1－20小时（过夜）。

6．加入2ul 0.2M EDTA(PH8.0),终止反应。（或65℃，10分钟） （三）地高辛标记southern杂交步骤 1 酶切电泳

1.1 取10-20ug基因组DNA稀释到500ul合适的酶切限制性缓冲液中。4℃过夜。 （消化基因组DNA时的困难常常是由于DNA成团。稀释后常可解决此问题）

1.2 每管加入10-20U限制性内切酶。孵育4-6小时。可取10ul消化液琼脂糖电泳，检测消化程度。(完全消化的基因组DNA应该以从12kb-0.5kb连续地片状迁移。在成片的DNA顶

-35-

部应该没有浓缩条带。根据所用的限制性内切酶，你还可能在成片DNA中看到卫星条带，这些条带是分开的。)

1.3 用乙醇沉淀消化物：加50ul 3mol/L NaAc,混匀。后加1ml乙醇并混匀。在-20℃至少放置30min；离心20min,14000rpm。去上清。

1.4 用70％乙醇清洗一次：加1ml 70％乙醇，14000rpm 5min。去上清。离心5s使残余液体流到管底。吸掉液体。空气中干燥15min。

1.5 用TE（PH8.0）重悬沉淀。（TE的体积取决于凝胶孔的大小，样品包括染料，应加满约3/4孔的体积。时间允许可室温放置30min-1h 以使沉淀完全溶解）

1.6 缓慢电泳：0.7%琼脂糖凝胶（4－5mm厚）电泳，跑过夜或一整天（2.5V/cm凝胶长度） 1.7 切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号，拍照，记录电泳结果(拍照时，凝胶旁放一尺子)。 2 凝胶变性与转膜

2.1 凝胶在碱性变性溶液中进行DNA变性

2.1.1 室温下将凝胶浸于数倍体积（没过胶）的碱性变性缓冲液中15min并轻轻振荡； 2.1.2 换液一次继续浸泡凝胶20min，并轻轻振荡。

2.1.3 弃去变性缓冲液，水中清洗1遍，加入数倍体积（没过胶）的中和缓冲液。室温不断振摇30min（2×15min）。

2.2 组装转移装置及在碱性溶液中转膜 (注意：在拿尼龙膜时应戴无粉末的橡胶手套，用钝镊子夹膜的边缘。)

2.2.1准备DNA从凝胶向膜转移的平台，将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。

另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。 将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入碱性转移缓冲液中。 安装毛细管转移装置

A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。 B．将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。 D．用保鲜纸封住凝胶四边。

E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一 玻璃板，其上压一重物。

G．转移几小时或过夜(至少4小时) 注意：勿使转移液干枯。

2.2.2 DNA转移需要8－24小时，当纸巾湿润后更换新的纸巾。尽量避免整叠纸巾都被缓冲

液浸湿。

-36-

2.2.3 除去凝胶上的纸巾及吸水纸。翻转凝胶以及与之接触的膜，凝胶向上平放与干燥的吸

水纸上。用笔标记加样孔的位置。

2.2.4 将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。采用紫外交联固定DNA： A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。 B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。

C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，直接用于杂交或空气中干燥保存备用。 （此膜可在4℃长期保存。） 3 预杂交与杂交 3.1 预杂交

将适量（20ml/100cm）的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42 ℃

预杂交2-3h。 3.2 杂交 3.2.1准备探针

水煮地高辛标记的探针(5-25ng)10min使变性，并立即放在冰上2min。

3.2.2加适量(5-25ng)的探针到已预热的杂交液(2.5ml/100cm)中，混合均匀(避免形成泡

沫，影响杂交效果)。

3.2.3 倾倒预杂交液，将探针和杂交液的混合液加入膜中。 3.2.4 42℃杂交16小时。 3.3 洗膜

3.3.1将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

3.3.2用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min 。

3.3.3用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在68℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。 4 免疫检测

4.1用10mL冲洗液洗膜1-5min。(washing buffer)

4.2膜在100 mL封闭液（buffer 2）中孵育30-60min。(轻轻搅动，同时准备anti-DIG-AP。) 4.3 将anti-DIG-AP用buffer 2配成75mU/ml (1:10000稀释)。 4.4倒掉封闭液，将膜和20 mL抗体anti-DIG-AP孵育30min。

4.5倒掉anti-DIG-AP，在100 mLwashing buffer中洗膜2次，每次15min。 4.6在20ml detection-buffer 中平衡2－5min。

4.7将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜，然后，立即用保鲜纸包裹，挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉。室温孵育5min。

4.8在37℃孵育潮湿的膜10min（5-15min）。增强发光。

4.9用Lumi Film或X-光底片将杂交膜进行室温曝光15-30min。(发光性能至少可持续48小时)

-37-

2

2

4.10 X-光底片的冲洗

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片 三、试剂的配制： Lysis buffer:

100Mm Tris-HCL (PH 8.5) 5mM EDTA 0.2% SDS 200mM NaCL

100ug/ml Proteinase K (20mg/ml Proteinase K stock is stored at -20℃ andded

to the Lysis buffer prior to use.)

酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）

TE buffer (10Mm Tris-HCL PH8.0 , 1mM EDTA ) 3M NaAc PH 5.2

PBS (NaCL 8g/L, KCL 0.2g/L, Na2HPO4 1.44g/L, KH2PO4 0.2g/L) Trypsin/EDTA (0.25%Trypsin, 1mM EDTA 2Na)消化液 变性缓冲液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCL

中和缓冲液：0.5mol/L Tris-cl (PH7.5), 3mol/L NaCL 碱性转移缓冲液：0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCL 四、仪器设备：

恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、紫外检测仪、暗盒、杂交炉、紫外交联仪等。

-38-

实验九 真核细胞RNA的提取

一、原理

本方法利用将TRIzol一步法进行总RNA提取的实验方案。 二、方法

（一）样本制备和保存 1、组织样本的制备 1）动物组织

1) 首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样本编号。

2) 准确切除所需组织后，立即在冰上剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。 3) 在RNase-free 的生理盐水中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。 4) 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。

5) 做好实验记录，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 注意事项

（1) 包裹组织的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样本袋（每个样本袋只保存同样的组织，样本较多时应分装至多个小袋，不要在一只样本袋中放过多的样本以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘标签纸（标签上注明：样本名称、编号、日期），迅速转入液氮罐。

（2) 不要用Eppendorf管保存组织样本，因为Eppendorf管从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。

（3) 在采集临床标本时，如果时间不允许进行样本清理，就立即将样本投入液氮中以确保样本的质量。 2、细胞样本的制备 1）贴壁细胞

（1) 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液。

（2) 按每10 cm细胞加2 mL TRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂。 （3) 缓慢旋转培养瓶数次，使TRIzol试剂充分接触培养瓶表面进行消化。

（4) 转移到RNase-free的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。

（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。

-39-

2

2）悬浮细胞

（1) 悬浮细胞培养诱导结束后，离心去除培养液。

（2) 按照每5×10个细胞加1 mL TRIzol的比例加入TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。 （3) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。 3）全血样本的白细胞分离

（1) 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀。

（2) 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g离心30 min。

（3) 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清。

（4) 加入白细胞20倍体积的TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解并形成清亮不粘稠的液体。

（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中可以保存半周左右。 注意事项

（1) 未经TRIzol试剂处理的细胞样本不要保存。

（2) 如果样本是冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA提取的可靠性，以便确保实验成功。

（3) 血液样本保存是不稳定的，新鲜血液必须立即分离出白细胞或者直接提取RNA进行保存。

（4) 白细胞样本保存也是不稳定的，白细胞样本务必按照上述过程进行保存。 （5) 不要在-20℃冰箱中保存RNA或者白细胞样本。 （二）总RNA提取 1. 试剂使用量

1） TRIzol的使用量： 2） 氯仿的使用量：

每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿。

3） 异丙醇的使用量： 每1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇。 4） Milli-Q水的使用量：根据沉淀的大小确定。

2. 实验过程

-40-

6

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/tnjg.html