神经干细胞移植与脊髓损伤修复罗伟

神经干细胞移植与脊髓损伤修复罗伟

众所周知,脊髓损伤(spinal cord in2jury , SCI) 是临床治疗的世界性难题。以往,许多学者曾尝试周围神经移植、胚胎脊髓移植、雪旺细胞移植、大网膜移植及应用神经营养因子治疗脊髓损伤。这些研究虽有很大进展,但都未达到目的。近年,国内外把研究焦点集中到了具有自我复制能力和多向分化潜能的神经干细胞(neural stem cells , NSCs) 上,已取得了一些突破。笔者就脊髓损伤修复和NSCs 移植及应用前景作一简介。

1 脊髓损伤的研究 1. 1 脊髓损伤后的反应

1. 111 脊髓形态学改变:脊髓损伤后,急性阶段出现局部神经元和胶质细胞的死亡、轴突退缩、神经干完整性丧失、溃变、炎症反应等。亚急性和慢性阶段还出现继发性改变,失去轴突的神经元坏死,神经胶质增生和纤维化并导致瘢痕形成及代偿性而非再生性轴突侧索的出芽生长等。

1. 112 细胞及细胞因子变化:中枢神经损伤区存在星形胶质细胞、少突胶质细胞、原始少突胶质细胞、小胶质细胞。这4 种胶质细胞均能抑制轴突的生长。成熟的少突胶质细胞能产生许多重要的抑制性物质,包括NI35 和NI250 (一种髓鞘相关阻断因子) 和髓鞘相关糖蛋白(MAG) ;原始少突胶质细胞能产生抑制性的蛋白多糖NG2 ;值得一提的是,星形胶质细胞在正常情况下和损伤早期,可能有促进轴突再生的作用,但损伤后,也可产生一系列的抑制性蛋白多糖;小胶质细胞受刺激后能产生多种毒素,杀死神经细胞和损伤神经轴索。因此,脊髓损伤区多种不同的抑制性因子及脊髓损伤后发生的创伤性细胞反应,导致了星形胶质细胞分裂并衍化为“瘢痕性”胶质细胞;小胶质细胞和原始少突胶质细胞增殖并移向损伤区,对脊髓的轴突再生极为不利[1 ] 。

112 脊髓损伤的修复机制

哺乳动物脊髓是自然界长期进化的产物,具有复杂的结构和功能。一般说来,成年哺乳动物脊髓的神经细胞是体内高度分化的细胞,已经失去有丝分裂的能力。因此,脊髓损伤后修复的途径是: (1) 残留的神经细胞的轴突残端通过终末出芽或侧支出芽的形式再生,并延伸至相应的靶细胞,形成突触连接,重建相应的神经环路,从而恢复或部分恢复对靶细胞的神经支配。研究结果显示,损伤脊髓的修复,不仅与神经元本身的内在因素有关,而且与周围的环境因素及来自靶区的特殊信号有关[2 - 3 ] 。(2)近年研究还发现,利用NSCs 移植补充、替代丧失的神经元,可部分重建新的神经环路,恢复部分神经功能。

2 NSCs 移植

211 NSCs 研究现状NSCs 的主要特征为未分化,能自我更新,具有分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的多种分化潜能。目前,人们已经能够从胚胎和成年啮齿动物及人的脑和脊髓内分离出具有向神经元和神经胶质细胞分化潜能的干细胞,并在体外培养成功。成年NSCs 多位于脑和脊髓中轴部位,难以大量取材,且目前无法对NSCs的增殖分化进行精确的调控,人们曾设想从相对易获取的组织如骨髓中获得NSCs。最近Castro 等[4 ] 做了这方面的尝试,但未获成功。他们把Rosa26 小鼠骨髓基质中的造血干细胞植入致死剂量照射的C57B1/ 6 小鼠体内,数月后采集受体脑组织、脊髓进行X - gal 组织细胞化学分析,但未能发现NSCs。212 NSCs 移植治疗脊髓损伤由于NSCs 具有独特的生物学特性,利用NSCs 移植对脊髓损伤部位实行细胞替代和基因转移治疗,是当代新发展起来并极有应用前景的脊髓损伤的治疗策略和脊髓损伤治疗研究的焦点。

212. 1 NSCs 移植的时机、方法及疗效评价:关于脊髓损伤后NSCs 移植的时机问题,国内外有不同的报道。Ogawa等[5 ]报告,脊髓损伤后24 h ,损伤处出现急性炎症反应,有神经毒性作用的炎症因子[如白细胞介素- 6 ( IL - 6) 、肿瘤坏死因子( TNF) 等]含量急剧增高,在

这一时期植入NSCs 不能存活。第9 天移植,NSCs 大部存活,并分化成不同类型神经细胞。他们认为,损伤处微环境对NSCs 存活有至关重要的作用。第9 天时,急性炎症已消退,微环境进入修复阶段,有神经生长、营养因子的表达及微血管的形成,有利于移植细胞的存活。也有学者提出,损伤后1 周左右适宜移植。郭家松等[6 ] 则在损伤后立即进行NSCs移植。在移植方式上,多数学者使用微移植技术,即用微管(如汉密尔顿注射系统) 把NSCs 直接注射到损伤处,以尽可能小的量,移植尽可能多的细胞来减少对宿主造成的创伤。也有学者采用了不同的方法。Teng 等[7 ] 设计了一种脊髓仿生物(polymer scaffold) ,将NSCs 植入其中,再将仿生物植入成鼠损伤脊髓,可减少胶质瘢痕形成,减轻组织进一步损伤。国内有些学者将吸附NSCs 悬液的Ⅰ型明胶直接植入损伤腔内[ 6 ] 。疗效评价方面, 大多数学者采用BBB 评分法,Ogawa 等[5 ] 采用了食物球获取实验进行神经功能评定。

2. 212 直接移植:成年哺乳动物脊髓由于外伤、缺血、变性致神经元缺失,引起中枢神经功能障碍。为了补充、替代缺失的神经细胞,恢复神经功能,近年来,许多学者把NSCs 直接用于移植。Ogawa 等[5 ] 从E14. 5 SD 大鼠分离出脊髓NSCs ,在体外传代后,植入脊髓损伤处。他们发现,在宿主脊髓损伤处,神经前体细胞分裂增殖,并分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,并且神经元发出突起嵌入脊髓组织中,与宿主神经元良好整合,并形成突触结构。成鼠运动功能得到恢复。Sufan 等[8 ] 把从大鼠胚胎( E16) 海马中分离出含有NSCs 的神经球注入第四脑室中,通过脑脊液转运,在损伤脊髓处的软脊膜形成细胞群,并扩散至脊髓、神经根。植入的NSCs 良好地整合到宿主脊髓中,在脊髓中它们像星形胶质细胞伸出突起包被神经纤维,在神经根处则像雪旺细胞一样包被有髓纤维或整合到无髓神经束中。McDonald 等[9 ]的实验证明,小鼠胚胎NSCs 植入损伤的大鼠脊髓后,植入细胞存活,并分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元,且从损伤处向周围迁移8 mm;大鼠后肢能主动支持体重和协调步态。

2. 213 NSCs 的定向分化移植:越来越多的证据表明,NSCs 植入体内后分化受脊髓局部微环境调控。故为提高细胞移植效率,有必要根据拟移植部位的类型及周围环境,在移植前事先在体外进行“裁剪加工”,使之定向分化,以便能更容易掺入靶组织点。Cao 等[10 ]报告,从胚胎和成年脑组织分离出来的大鼠及人类NSCs ,植入成年中枢神经系统后,主要分化为神经胶质细胞,但在植入损伤或病变的中枢神经系统后,细胞分化延迟。因此,他们提出,有必要在体外进行NSCs 的定向分化,以产生大量能促使神经功能恢复的神经元。Keirstead 等[11 ] 发现, 大鼠PSA -NSCM+ 神经前体细胞在体外大多数分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞。新生雄鼠的PSA - NSCM+ 神经前体细胞体外增殖后植入外伤后局部脱髓鞘的成年雌鼠脊髓后,分化成雪旺细胞促进髓鞘再生。Cao 等[12 ] 从E14 大鼠胚胎大脑皮质或成鼠脑室下区分离出NSCs ,植入正常的成鼠脊髓,发现有大量细胞存活,但多为星形胶质细胞,未见Neu -N+ 神经元。而植入挫伤脊髓或损伤后空泡或损伤处前后端灰白质中,大多数细胞分化为星形胶质细胞。说明神经前体细胞在体内、外分化成不同的细胞,在体内分化主要局限于胶质细胞系。Cao 等在[13体] 外分离出了神经元限制性的前体细胞(NRPs) ,把它们分别移植入正常和损伤的成鼠脊髓。作者发现,NRPs 植入正常成鼠脊髓后能分化为各种类型的成熟神经元,而植入损伤成鼠脊髓的NRPs 大多数未分化,少数分化为MAP2 或βⅢ- 微管蛋白阳性神经元。这说明,在损伤脊髓中NRPs 的分化受到抑制,损伤脊髓的微环境对NRPs的分化有重要影响。Onifer 等[14 ]研究了RN33B 细胞在正常和不同损伤脊髓中的分化,他们把LacZ 标记RN33B 细胞植入损伤的腰膨大处或正常成鼠脊髓中,发现在正常鼠整个脊髓灰质均能见到双极或类似正常神经元的多极细胞,在损伤动物模型组只能见到双极RN33B 细胞。以上结果表明,在正常脊髓中RN33B 细胞可分化正常的多极神经元,在损伤脊髓中可能有抑制因子释放抑制其分化。Whitte2more[15 ]也发现,永生化的神经前体细胞RN33B 对不同局部微环境表现出很强的可塑性,分化的类型和程度与损伤的情况有关,同时,宿主的中枢神经系统

也能调控RN33B 的分化。在NSCs 移植时要注意人类中枢神经系统细胞永生化产生染色体畸变,有潜在的致瘤性。Akiyama 等[16 ] 检测成人脑组织,发现脑室下区、侧脑室前角、齿状核的部位有神经前体细胞,把这些细胞分离出来后在培养基中克隆,可分化成神经元、星形胶质细胞,少数为少突胶质细胞,再植入脱髓鞘的大鼠脊髓,出现大量的髓鞘再生,与周围神经中雪旺细胞形成的髓鞘相似。结果表明,人NSCs 体外定向分化后能促进大鼠脊神经髓鞘的再生。

2. 214 转基因细胞移植:由于NSCs 可以在体外大量培养,可以与受体的脑组织形成结构和功能整合,存活时间长,易于进行转基因操作并可携带多个外源基因且有高水平的表达,如取材于自体,还具有免疫耐受性及安全性等优点,因此,把NSCs 或体外培养的永生化NSCs 系作为外源性基因载体进行基因治疗是极有前景的脊髓损伤的治疗策略。基因治疗中基因转移的策略主要有两种,即体外法和在体法。体外法就是在体外先对NSCs 细胞进行遗传修饰,使其表达和分泌特定蛋白,然后将修饰NSCs 移植入活体神经组织,通过神经递质替代或神经营养因子(NTFs) 和其他治疗因子的引入达到恢复正常的神经功能的目的。目前,多数学者采用体外法。Himes 等[17 ]切断成鼠T8 脊髓单侧Clarke 核轴突,然后用含有碱性磷酸酶报告基因的重组逆转录病毒对NSCs 做遗传修饰,使之能表达神经营养因子- 3(NT - 3) 、神经生长因子(NGF) ,再将细胞植入成鼠脊髓。结果发现: (1) 植入的细胞已存活; (2) 未移植的对照组或只移植表达报告基因的NSCs 组丧失了30 %的Clarke 核神经元; (3) 而移植表达NT- 3 NSCs 组无明显的神经元丧失。以上结果说明,通过转基因技术,将编码神经营养因子等的基因片段导入NSCs ,使其在移植部位进行表达,改善局部微环境,能促进失突触神经元的生存和增殖。研究表明,脊髓损伤后再生神经纤维只要有合适突触靶位便可再建脊髓神经环路。Castellanos 等[18 ] 用NSCs 为损伤后脊髓轴突再生提供新的突触靶位。他们将经过基因修饰可表达酪氨酸激酶受体C(trkC) 的大鼠神经前体细胞植入正常大鼠脊髓。在移植前用trkC 配体NT - 3 对神经前体细胞做预处理以启动细胞分化;经动物明胶包埋后移植入体内后暴露于NT - 3 。经上述处理的trkC NSCs 存活率约100 % ,而未处理组则只有30 %～50 %。TrkC 表达和NT- 3 联合作用减少神经前体细胞向星形胶质细胞分化,并且神经前体细胞较好地与宿主神经元形成功能上的联系,说明基因修饰的NSCs 在神经营养因子的作用下能促进脊髓损伤后神经环路的重建。Liu 等[19 ] 用含有NT - 3 、IRES、LacZ/ neo 序列的逆转录病毒对NSCs 克隆(C17) 做遗传修饰,使之能表达NT -·572 · 中华创伤杂志2004 年9 月第20 卷第9 期 Chin J Trauma , September 2004 , Vol. 20 , No. 93 ,然后,将细胞植入大鼠脊髓,并对体外及体内的干细胞分别做了研究。结果发现: (1) 大部分细胞均表达NT - 3 和LacZ基因,且无论体内体外均出现高度联合表达。(2) 细胞在体内存活达2 个月以上,并分化成神经元和胶质细胞,还出现一些迁移。结果提示,转基因NSCs对脊髓损伤有修复作用。半横断损伤大鼠T13脊髓节段可阻断5 - 羟色胺介导的下行抑制性调控,引起背角神经元过度兴奋导致慢性疼痛。Hains 等[20 ]通过基因转染得到能分泌5 - 羟色胺RN46A - B14 神经前体细胞,植入损伤脊髓。检测发现5 - 羟色胺水平接近正常水平,电生理检测发现背角神经元兴奋电位基本正常。他们的发现证实,植入的RN46A - B14 神经前体细胞分泌5 - 羟色胺,改善了组织的相关功能。3 展望脊髓损伤后NSCs 移植研究目前仍存在不少的问题: (1) 大量的工作尚处于实验研究阶段,而且资料大多是在啮齿类小动物(绝大多数为大鼠) 身上获得的,尚未见大动物和高等动物的相关报道; (2) 动物实验造成的脊髓损伤与人类实际情况差别较大; (3) 目前仍很难估计NSCs 移植试验的风险,缺乏客观、准确的评价标准。在临床试验开始前仍有很多问题需要解决。但是,干细胞移植和转基因治疗是新发展起来并极有应用前景的神经病学治疗策略,随着NSCs 基础理论的不断完善和发展,其应用于脊髓损伤后功能恢复的研究一定会取得突破性进展。

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