淋球菌PCR检测技术研究进展

聚合酶链反应(PCR)检测技术是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应,即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下,使DNA链扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展,对淋球菌的基因结构越来越清楚。1985年Korch等克隆出隐蔽性质粒基因(cppB),1988年Rossau等发现淋球菌16SrRNA存在着另一个独立的基因区域,这个基

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中国卫生检验杂志 2 0 0 8年 4月第 1 8卷第 4期

C i s ora f e t aoa r eh o g, p 0 8;o 8 N hn eJunl ahL brt yT cnl y A r 0 V l o4 e oH l o o 2 1

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【综述】

淋球菌PR C检测技术研究进展周炳可(西上思县疾病预防控制中心，西上思广广[键词]淋球茵；关聚合酶链反应；测技术检[中图分类号] R 9 . 1 32 1[文献标识码] A [章编号] 10 8 8 (0 8 0 06 0文 04— 6 5 20 )4— 7 3— 3 55 0 ) 3 50

聚合酶链反应 ( C检测技术是一种体外 D A扩增技 P R) N术。其基本原理是酶促 D A合成反应，在模板 D A、物 N即 N引和脱氧核糖核酸存在及 D A聚合酶的作用下， D A链扩 N使 N增。由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成。随着微生

淋球菌检测的确诊试验。G yo等㈤采用 A TMA C m o2 ads P I o b sa as对女性宫颈拭子和尿液标本进行检测， y结果淋球菌敏感性和特异性分别为 9. 9 2和 9、 8 7%。他们认为该法可推荐用

作检测女性宫颈和尿液标本，特别适用于无症状的女性。3 cp— P pB CR

物基因组学的发展，淋球菌的基因结构越来越清楚。18对 95年 K rh等…克隆出隐蔽性质粒基因 ( p B) 18 oc c p,9 8年 R s o—su等发现淋球菌 1SR A存在着另一个独立的基因区域， a 6rN

cp pB— P R是以隐蔽性质粒基因 (p B为扩增靶序列， C cp ) 临床培养分离出的淋球菌菌株 9%均具有隐蔽性质粒。 63 On—se .1 e t p PCR

这个基因区域的核苷酸系列靶目标较多，且较稳定，能把淋球菌与其它非淋球菌区别开来。此后，淋球菌的其它特异性基因如 of、 p、oA相继被应用作检测靶目标的研究。根据 r O a pr l

即一步 P R, C只设计一对引物用于 P R即完成检测。H C o

淋球菌的特异基因序列，设计引物，进行 P R检测，现阶段 C是检测淋球菌的最快速准确的方法，文将淋球菌 P R检测技本 C术研究进展综述如下。

1 Ro h c e Amp io lc r— PCR

等根据基因库所提供的淋球菌 cp p B基因序列设计了一对引物即 H ( C A G Ar C C C O15一G T C C C G G兀℃C~ 和 H 3 5 A 3) O (一

C A G C TC A C G C一， 1 G A A C Y G G A A A 3 )对 2株非淋球菌菌株

和3 3株淋球菌菌株，过 4经 0次 P R循环反应， C仅有淋球菌菌株扩增出预期的 30b 9 p片段，其它细菌无反应，而提示以 c— p p B基因作为靶对象，具有应用前景。3. Ne td— PCR 2 se

以胞嘧啶 D A甲基转移酶基因为扩增靶目标，早期应 N是用于 P R的靶点之一， C目前已有商业性检测奈瑟淋球菌 R ce ohA pi r C m l o R试剂盒。 Ln a c P i n等采用 R ceA pi rP R d oh m l o C c

即套式聚合酶链反应，又称二步 P R C。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮 P R,后再使用第一对引物扩 C然增的 D A序列内部的一对引物再次扩增。D v 等根据 c— N ai d p p B基因设计一对外引物： O ( C A G A A C G G Y H 1 5G T C C T C C C T - G 3) H 3( G A A C Y G G A A A ,应混合 C和 O 5 C A G C T C A C G C 3 )反物中，引物 ( O、 0 )行第一次扩增，增的产物转移至新 H 1H 3进扩

检测 60例男性， 9所用的标本为单份首次尿液和连续 5份混合尿液，对于单个实验，合尿液实验检测淋球菌和衣原体的相混

总敏感性为 9 .%, 6 1特异性为 9 .%。此方法与培养法相比 65敏感性高。L w o e等用 R ceA pi r C oh m l o—P R与 1SR A— c 6rN P R和 cp C p B—P R3种方法平行检测来自男女尿标本后作了 C比较，为 R h p cr C认 c o eAm lo—P R敏感性比 1SR A~P R和 i 6rN Ccp p B— P R低。随着 R h m l o检测系统的广泛应用， C c o eA pi r c 研究者发现，以胞嘧啶 D A甲基转移酶基因为扩增靶目标的 N

的标准混合物中，混合物含引物 ( pB 1和 cp N )进行此 cp N pB 2,第二次扩增，两次循环的参

数相同，以出现 24b 5 p为阳性结果。此方法的敏感性为每一反应试管中可检测到<1 F。 U C3. snc p— PCR 3 t pB

P R敏感较低， C且存在与脑膜炎球菌、黄热病球菌等发生交叉反应而出现假阳性结果，因此其阳性结果宜用另外一种P R确证 C2 1 r 6S RNA— P CR

即单管套式 cp p B—P R C。在同一反应体系中，包括两对引物，两对引物的火退温度不同，通过控制火退温度使外则引 物先扩增，经过约 3 0次循环后，降低火退温度，内则引物再使以前面扩增产物为模板进行套式扩增。 H r an等以 c— e mn r p p B基因为靶点设计一对外引物 G 1 5 C (一C’A C 1 G c— r T G Tr G T IG G T C一3 ) G 2 5 G A Y 、 C (一A C A A C A G 1 r A A T C A G C A A G G C C G r一

1SR A— C 6 r N P R是以 1S核糖体 r N 6 R A基因为扩增靶点。 1SR Al具有进化上的保守性， 6 rN 2 比较稳定，且在细胞内含量

较高，特异性和敏感性都较高。较早应用于临床，已有商业现化的试剂盒， 1SR A基因为扩增靶目标的 P R检测系以 6rN C统一A 1MA C m o2asy为代表的检测方法，美国食品药 P1 o b sa是品监督管理局规定用于检测男女尿液标本的方法，作为常

3) 和一对内部引物 G 3(一A I 'C G G C A C一 C 5 T TI A T T A A C

3 ) G A (一T rA G C T T 1一3)行 s ep— 、C 5 AIC A C C A C℃ t进 t pB n

P R检测， C结果此方法的敏感性为每一反应试管中可检测到耋0 3细胞。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应， .因此试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，种方这

[作者简介]周炳可 (9 3一)男， 16,主管技师，主要从事卫生检验工作。

法对减少扩增产物的污染问题极为有用，也增加了每次试但验的复杂性。

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