常见细胞实验流程

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实验前准备

? 根据自己实验的情况提前预定超净台 ? 进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套

? 将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min

高压灭菌操作

将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包好。

将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，若没有超过则需加水。

检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。 插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。

关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的稳定。

开始计时，灭菌30min。结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。 拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。

（组织内）蛋白质提取过程

对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。

根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。

将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，开始研磨。

将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min. 离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。

蛋白质浓度测定

1、 取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可 2、配制BCA标准蛋白液：

浓度 原液体积 去离子水体积 A管： 2000ug /ul 30ul 0ul B管： 1500ug/ul 37.5ul 12.5ul C管： 1000ug/ul 25ul 25ul D管： 750ug/ul 18.75ul 31.25ul E管： 500ug/ul 12.5ul 37.5ul F管： 125ug/ul 3.125ul 46.875ul G管： 25ug/ul 0.625ul 49.375ul H管： 0 0ul 50ul

?取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和

去离子水

?先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用

孔的个数加入底物液）

?加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列

上的字母标记依次加入

?之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次）

?加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，

之后将板放入保温箱中静置30min

?30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行

操作）

?数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据

?在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下

对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：y=ax+b（计算机上操作）

?将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度 ?若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组

的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性）

?将浓度标准化的样品蛋白与loading buffer 混匀至100ul（混合液中

loading buffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：取20ul 5Xloading buffer +80ul 样品蛋白混匀即可 ?在加样做western blot之前，蛋白样品需变性：

将与loading buffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开）

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（组织内）RNA提取过程

将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。 将匀浆好的上清转移至1.5ml EP管中，进行离心12000rpm/5min.

离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置5min，然后12000rpm/5min.

离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。之后按1:1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。 离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml 75%乙醇DEPC水溶液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min.

倒掉上清，在滤纸上空干。然后加入20ul DEPC水溶解沉淀，并吹打均匀。（如果RNA量较多，可相应的加更多的DEPC水，40ul 甚至60ul） 测定RNA浓度，取1ul RNA+99ul DEPC水于EP管中（相当于稀释100倍），另取一EP管放100ul的DEPC 水用于定标。定标后倒掉，用去离子水冲洗比色皿，然后测定RNA OD值和浓度，记下数据。 RNA电泳（用于检测提取的RNA是否已降解）

? 配胶(1%的胶)：取0.2g 琼脂糖+ 20ml TAE +1ul EB ? 制胶时，应让液体沸腾3次，冷却后加入EB混匀（每20ml加1ulEB）,

胶制好后倒入板中凝固，并垂直地插入梳子，静置30min 后拔下梳子（可提前用梳子划动下胶，使得胶更均匀）。 ? 取1ul的Loading buffer和样本RNA混匀，加样

正确的电泳结果应有3条带：28S 、18S、5S。28S亮度应为18S亮度的

8.

2倍，5S条带越宽越代表RNA降解越多。如果加样孔内有残留代表蛋白污染，如果离加样孔很近的地方有条带代表DNA污染。

细胞冻存

? 首先向培养瓶内加入胰酶（1ml）消化细胞

? 显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆脱落时，即可用适量培养基中止消

化，之后将细胞液吸入15ml的管内（动作要快，防止胰酶损害细胞） ? 将管内1/3的细胞液放回培养瓶继续培养（剩余的细胞液平均冻存两管） ? 离心剩余的细胞液，1200rpm,5min（用等量的PBS配平）

? 离心后弃上清，得白色沉淀。可在试管台上轻轻来回划动试管，使得沉

淀松动更易于悬浮

? 用配好的3ml冻存液悬浮沉淀，吹打混匀，使得细胞为单个细胞

? 分别取1.5ml放入两冻存管内，在冻存管上做好标记：细胞类型，代数，

日期等

? 标记好后4°冰箱放置30min（切勿超过30min），计时 ? 之后-20°冰箱中放置30min

? 最后放入-80°冰箱内可保存半年。若半年后还没有使用则需要将细胞拿

出来复苏，长满后再冻存起来。

? 冻存液的配制方法：

血清（20%）+DMSO（10%，超净台上锡纸包裹的）+培养基（70%）

例如配3ml冻存液：

血清=600ul；DMSO=300ul；培养基=2100ul

细胞复苏

? 将实验所需要的仪器提前放入超净台内紫外灭菌15-20min ? 在整个复苏过程中冻存的细胞都应保持在37°水浴中

? 烧杯中放入37°水，将从冰箱内拿出的细胞用镊子夹住放入烧杯内摇晃

使细胞慢慢融化

? 细胞融化后，用酒精浸湿的纸擦干冻存管 ? 之后在超净台内将细胞液吸取到放有适量（例10ml）PBS的15ml管内吹

打均匀（在取细胞之前提前在管内倒入PBS） ? 1200rpm，5min离心，离心后弃上清得沉淀

? 将得到的细胞沉淀用适量的培养基悬浮，并吹打均匀，使细胞单个存在 ? 吹打均匀后，用吸管将细胞液吸入培养瓶中（大/小培养瓶根据自己的实

验而定）

? 最后向培养瓶内加入适量的培养基 ? 显微镜下观察细胞情况

? 最后将培养瓶盖子拧松，放入37°培养箱培养

Western Blotting

Western blot 实验过程中所需要配制的试剂: ? 1 X TBST: （用于洗膜）

100ml 10X TBS +900ml 去离子水+1ml Tween 20 ? 5%牛奶：

取5g牛奶溶于1000ml 1XTBST中混匀 ? 1X Running: （用于跑电泳）

10XRunning 100ml 溶于900ml 去离子水中 ? 1X transfer: （用于转膜）

10XTransfer 100ml +100ml无水甲醇+800ml去离子水 ? 一抗：

用5%牛奶将一抗稀释2000倍（稀释倍数根据自己实验而定），若抗体由甘油保存，稀释一抗应取所计算体积的2倍。 ? 二抗：

用5%牛奶将二抗稀释10000倍（牛奶封闭性更好）

具体操作流程：

1. 清洗玻璃板

? 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都要洗净，

之后先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗干净，立在桌面上晾干。

2. 配胶（区别于RNA 电泳胶）

? 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

? 先按照10% Gel （10ml）比例配下层的分离胶，加入TEMED后立即摇匀

即可灌胶。

? 灌胶时可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃缓慢放出，待胶面升到绿带中间线

高度即可，然后加入100ml异丙醇封闭 ? 静置等待胶凝固，（若试管内剩余的胶凝固代表玻璃板内的胶已经凝固

了）凝固后倒掉异丙醇，用去离子水冲洗干净，并用吸水纸将水吸干，并避免刮破胶

? 再按照5ml的比例配上层的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后即可灌胶。

将配好的胶灌满剩余的空间，之后垂直缓慢地将梳子插入浓缩胶中，避免产生气泡

? 胶凝固后即配胶结束 配胶注意事项：

? 若配好的胶不立即使用，可以保存在4度冰箱内，但保存时间不宜过长

（用卫生纸包裹玻璃板，浸湿卫生纸，放入一次性塑料手套内即可，此时不要拔下梳子）

? 蛋白胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。

? 按照10% Gel的方法进行配胶。注意：选择玻璃板时要看清玻璃板上的

大小标记，一般用10ml的。玻璃板一定要用去离子水洗干净，之后室温晾干。

? 浓缩胶和分离胶配制所用Tris-Hcl的PH值是不同的，分别为7.8和6.8 3.跑电泳与上样

? 配制（1000ml）1XRunning 电泳缓冲液：（实验室现有的是10X）

取100ml 10 X Running 缓冲液溶于900ml 去离子水中即可得到1XRunning 缓冲液

? 将配好的胶板放在电泳槽内，注意正负电极的准确连接，两手分别捏住

梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出

? 倒入配好的电泳缓冲液，若使用的是两块胶，加入的电泳液液面应超过

“2Gel”字符线（电泳液也要灌满玻璃板）

? 加蛋白上样量：测完蛋白含量后，计算含20-50ug蛋白（根据自己的实

验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。

? 用10ul枪头进行加样，将枪头插入加样孔缓慢加入样品，加样过快的话

容易使样品冲出加样孔（注意同一实验和对照组所加的上样量应该相等，这样才具有可比性），同时加入2-3ul Marker作为条带分子量大小的对照 ? 加样完毕后，盖上电泳槽盖，连接电源，先调电压至120V，按start开

始跑电泳

? 当样品被压成同一水平的线时，可以降低电压至100V或80V左右，电

泳至样品内的溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，关闭电源，进行转膜

4. 转膜

? 转膜前先用镊子捏住两张硝酸纤维素膜的一边浸泡在无水甲醇中 ? 配制1X transfer（转膜缓冲液）：

取10x transfer 100ml +100ml无水甲醇 +100ml去离子水混匀即可

? 将转膜液倒入搪瓷盘内，并放入转膜所需的夹子（夹子具有黑白两面）、两

块海绵垫（海面上带有滤纸）、小绿板和浸过的膜

? 将夹子打开使黑的一面位于底部保持水平，在其上垫一张海绵垫，用小绿板

来回擀几次排除其内的气泡。

? 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，除去小玻璃板后，将浓缩

胶用小绿板轻轻刮取，要避免不要把分离胶刮破。

? 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用小绿板擀去

气泡。

? 之后将另一海绵垫平铺在胶上，用手压住，并用小绿板赶走气泡，注意动作

要轻柔，避免胶与膜发生错位。

? 气泡赶净后就可以合起夹子（整个过程都要在转膜液中进行）。 ? 另外一块胶按照形同的过程进行操作

? 之后将夹子放入转移槽中，要使黑色的面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红

面。

? 由于在转膜的过程中会产生热量，所以将整个转膜槽放入装有冰块的桶内进

行。

? 插上电源，调电压至80V，转膜2h（转膜时电极方向注意是膜正胶负） ? 转膜结束后，可看到膜上有明显的Marker条带，用丽春红染色液让膜显色，

之后可以看到膜上蛋白的条带

? 将膜放入一平皿内于摇床上脱色，放入1xTBST洗三次，每次10min。 ? 若事先知道目的蛋白的分子量，可以用保鲜膜将膜包裹，之后将膜修剪

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