细胞免疫荧光染色
更新时间:2024-03-18 09:28:01 阅读量: 综合文库 文档下载
细胞免疫荧光染色
1. 盖玻片处理:用前1天用纱布擦净灭菌,放入6孔板。
2. 接种细胞:较低密度为适宜,约2000-10000个/孔(根据细胞生长状态决定,常用
5000个/孔),2ml(浓度为2500/ml)
3. 24h后细胞贴壁,根据需要同步16-18h,干预处理,细胞融合60-70%时染色最
佳
4. 37度PBS洗涤,3ml/孔,贴边加(可将6孔板倾斜,加完样在放正以防冲掉细胞,
0.5min。室温PBS也可,但4度禁止,否则细胞易皱缩。
5. 固定:4%多聚甲醛(1ml),先常温稳定5min,然后4度,10min,(可放在饭盒内)。 6. 吸掉多聚甲醛,迅速加PBS 5ml/孔,洗涤5min×3次,镜下观察,细胞形态如前。 7. 透化:0.1%-4%triton×-100,1ml/孔,室温透化5min(triton是去污剂,目的是
将脂质成分破坏,如细胞膜、核膜等,故不影响实验结果,可不用洗涤)
8. 5%BSA(滤过)室温封闭至少20min(可配制含5%BSA和0.2%triton的混合液,将
两步合成一步)风干
9. 用5%BSA将一抗1:50或1:100(常用)稀释至EP管 200ul/玻片 10. 将纱布垫在饭盒中,去离子水润湿纱布,准备封口膜。
11. 吸去BSA,迅速滴加一抗,从玻片1中央滴加,液体会自行扩散至全片。为保持细胞
湿润,将6孔板封好,放入饭盒,37度孵育1-2h(有利于抗体结合),再室温3-4h。(或室温2h后,4度过夜)注意勿晃动6孔板,防止抗体不均或从玻片洒出。 12. PBS洗涤10min*3次(可用western的摇床)
13. 用5%BSA将二抗1:50稀释(得到的实际浓度为1:100,因二抗本身已经被甘油
稀释1倍),也可1:200稀释。室温1.5h后可显荧光(放在饭盒里,避光) 14. PBS洗涤10min*3次(可用western的摇床) 15. 免疫荧光显微镜观察。泡在2ml的PBS中保存。
16. 多聚甲醛: 4度避光保存 100ML PBS加4克多聚甲醛,磁力搅拌器加热搅拌,温度控
制在60℃以下,最好用细粉末的多聚甲醛,如仍不溶,滴加NaOH,(1N或0.1N),最后调PH值,7.4左右。 triton:用PBS稀释,常温保存
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