生物化学及分子生物学实验考试 - 图文

一、 实验原理步骤： 1、 分子克隆总流程：

分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

流程：

（1）带有目的基因的DNA片段的获得——PCR引物设计，PCR获得。 （2）重组DNA分子的构建——与载体酶切连接。

（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选——转化，培养，筛选

（4）检测——菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒，测序。

2、质粒DNA的提取及鉴定——碱裂解法

原理：

根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 ? 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。

? 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。

步骤：1、细菌培养和收集 ① 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。（已完成）

② 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。

2、细菌裂解及质粒的提取

③ 将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。 ④ 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。 ⑤ 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置10min。 ⑥ 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。 3、质粒的纯化

⑦ 向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 ⑧ 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中 ⑨ 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1),反复混匀。 ⑩ 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。 4、质粒的浓缩 ① 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10-15min。 ② 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 ③ 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清

液, 空气中干燥5－10min。 5、质粒的溶解和保存及电泳检测 ④ 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 ⑤ -20℃保存 ⑥ 1%胶，恒压150V,电泳10-20分钟

要点：载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

类型：大肠杆菌中的质粒、?噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。

条件：复制子、咸志梅单一识别位点、标记基因、适合的拷贝数

? 碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）

? 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布） ? CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同）

? SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清） ? 玻璃纤维膜法(试剂盒)

EDTA螯合Mg离子，抑制DNA酶活性，

3、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测

原理：DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。超螺旋》线型》开环 步骤：1、酶切：

无菌ddH2O 4 μl 1 10xbuffer O 1 μl 2 质粒DNA 3 μl 3 BamHI 1 μl 4 NotI 1 μl 5 ———————————————— 总体积 10 ul

混匀后,点动（Short）离心， 37℃酶切60分钟 2、制胶1%，上样，电泳

4、目的基因片段的回收——玻璃纤维柱法

原理：利用特殊硅基质材料，在一定高盐（消除DNA 和硅基质的负电排斥）缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理（DNA磷酸基团与基质硅烷醇基团形成氢键），配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。 步骤1、110V ，1%胶电泳分离

2、 切胶，12000离心1min 3、 纯化：

溶胶:估计凝胶的体积,按照100μl胶加入500μl的溶胶液(Gel-lysis Buffer 溶

胶液,6M NaI)65℃水浴溶胶,其间偶尔摇动,至胶完全溶解(熔胶要充分)

② 装柱:将溶液冷却至室温,装柱(做标记),10000rpm离心30秒,滤液可以重新上柱,重复离心一次后弃滤液

③ 漂洗：500μL漂洗液(Washing Buffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm离心30秒,去掉废液

④ 重复漂洗：重复漂洗一次,弃废液 ⑤ 干燥：再12000rpm离心2min(离心要充分,彻底去除乙醇) ⑥ 洗脱:在柱子中央加入120μl洗脱缓冲液(elution buffer)或ddH2O,室温放置2分钟,转入新的EP管中(标记),12000rpm离心1分钟,收集滤液

⑦ 沉淀:向滤液中加入15μl的3MNaAC溶液,混匀,然后再加入270μl的无水乙醇,-20℃保存备用(下次实验材料)

5、大肠杆菌感受态细胞制备及连接产物的转化

原理：

? 感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态

? 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程

? 致敏过程：

用理化方法诱导细胞进入感受态的操作

在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

筛选：抗性或蓝白班：又称蓝白斑筛选法，质粒上LacZ′基因编码的α肽链与受体菌中编码的β半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为α互补。如果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ′基因中，则β半乳糖苷酶失活，显白斑。 步骤：（1）、大肠杆菌DH5α感受态的制备

1、接单菌落到5ml LB液体培养基中，37℃、190rpm振荡培养过夜。

2、1%（50 μl) 菌液接种到含5 ml LB的试管中，37℃振荡培养1-2小时，至OD600 0.4-0.5。（已完成）

3、将1.5mL菌液转移到离心管中。 4、离心 5000rpm，4℃，3min。 5、倒出培养液上清。

6、用冰预冷的1ml 0.1M的CaCl2处理、轻轻悬浮细胞。 7、冰上静置20min。

8、5000rpm，4℃离心5min，倒出上清。 9、100μl CaCl2轻轻悬浮，冰浴待用。 （2）、质粒的转化

1. 100μl的感受态细胞分成2管(50μl/EP管)

2. 实验样品: 将2μl质粒DNA加入到50μl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹

打)（标记P+）

3. 阴性对照：将2μl无菌水加入到50μl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)

（标记P-） 4. 冰浴20min

5. （热击）42℃，90sec，静置，勿摇动 6. 迅速放到冰上,冰浴2min

7. （复苏）加入950μl LB液体培养基（无抗性），标明组号，37℃，200rpm摇床培养

30min

8. 连接产物转化管：4000rpm离心5分钟，吸出弃去800uL上清液后，轻轻混匀菌体，

将剩余200uL菌液均匀涂布在Kan平板上。（注意编号!）37℃培养

6、菌落PCR鉴定重组克隆子

原理：聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction, PCR

在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。

以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模板3’末端引物存在的条件下,利用酶进行互补链的延伸。经变性、退火和延伸多次循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

? 变性：双链DNA解链成为单链DNA

? 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 ? 延伸：以目的基因为模板,合成互补的新DNA链 (延伸时间：1kb/min) 步骤：1、DNA模板的制备(挑取细菌沉淀) 2、引物设计与合成(教师已做) 3、PCR扩增GFP基因

4、琼脂糖电泳检测，1%胶，110V

7、重组克隆子的酶切鉴定

原理：试剂盒抽提质粒，用限制酶切割，琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段。 步骤：1、挑选阳性克隆子培养(已做)

2、抽提质粒

① 1.5-5ml过夜培养菌液,倒入EP管中(标记), 10000rpm离心1min,弃上清。 ② 加入250μl 溶液I（含RNase A），充分混匀。 ③ 加入250μl 溶液II，轻轻混匀，室温放置2min。 ④ 加入350μl 溶液III，轻轻混匀，13000g离心10min。 ⑤ 将上清液转移至纯化柱中（标记），13000g离心1min，倒去收集管中的

流穿液。

⑥ 在纯化柱中加700μl DNA漂洗液（含70%乙醇），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。

⑦ 重复步骤6。 ⑧ 再次13000g离心2min,用于干燥纯化柱。 ⑨ 丢掉下层收集管，将纯化柱放入新的1.5ml EP管（标记）。 ⑩ 小心加入30ul 50-60度预热的Elution Buffer（T buffer or 纯H2O）（要加到柱子正中间，是液体均匀扩散到DNA吸附填料上），室温放置2min，13000g离心1min，下层新EP管中液体为所纯化的质粒DNA。 3、酶切分析，10ul体系 4、电泳鉴定，1%胶，110V

8、转化BL21——同DH5α 9、蛋白质的诱导表达 原理：

E.coli BL21(DE3)：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体

lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，即T7基因不表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 步骤：

1. 原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。 2. 挑取单菌落于2mL Kan+ LB培养基培养过夜。(已做) 3. 以5%的比例转接于20mL Kanr LB培养基中(加20μLKan)，培养约1小时至约OD600=0.4-0.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。

4. 取1.5mL菌液,制样作为未诱导对照。 5. 三角瓶中加入IPTG 20μL(0.2M)至终浓度为0.2mM，继续培养。

取样：分别于培养后，40min，80min,120min取1mL菌液制样。(0min样品处理一致)

制样： ? 12000rpm离心1min,去掉上清。 ? 加入25μL ddH2O,重悬(充分分散细胞)。 ? 加入25μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀。 ? 沸水浴5min(蛋白质变性),取出后立即置于冰上。 ? 冷却后,冰箱冷藏,备用。 待纯化样品的收集和制备： ? 收集10ml诱导好的菌液（180min）于15ml 离心管中，5000g离心5min。 ? 倒掉上清液，用1.0ml lysis buffer（洗涤缓冲液）重悬菌体，转移至1.5ml离心管。

? 10000rpm离心2min，去上清。细菌冻存-20℃备用。

10、蛋白质的纯化

原理：亲和层析法——his标签和Ni填料

利用his标签和Ni填料结合，利用不同条件洗去杂质，并改变条件将蛋白洗脱收集。 步骤：

一、收集菌体（已完成）

1. 取10mL IPTG诱导3小时的细菌培养液至一支15mL离心管中，平衡，5000g 离心5min，弃上清。

2. 用1mL Lysis Buffer将菌体重悬，转移至一个1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃上清。将菌体沉淀置－20℃冰箱保存。 二、裂解细胞

1. 将上次保存的菌体取出，室温解冻后加入613uL Lysis Buffer，7uL PMSF（100mM），重悬。

2. 向重悬液中加入70uL 溶菌酶（10mg/mL）、7uL RNase A（1mg/mL）、3.5uL DNase Ⅰ（1mg/mL），轻轻混匀后30℃孵育15min，其间每隔半分钟轻轻摇动一次混合液。 3. 15000g离心10min，将裂解上清转移至另一离心管中。 三、蛋白纯化

1. 向裂解上清中加入Ni-IDA Resin悬液100uL（注意：吸取前充分混匀），轻柔混匀，冰上放置30min，其间每1min轻轻颠倒一次。

2. 将裂解上清与Ni-IDA Resin的混合液转移至一个废旧的DNA吸附柱中。 3. 500g “short”离心10s，弃流穿液。

4. 向柱中加入600uL Wash Buffer，500g “short”离心10s，弃流穿液。 5. 重复第“4”步两次。

6. 将吸附柱放在一个干净的1.5mL EP管上，向柱中的Resin加入50uL Elution Buffer，静置2min。500g “short”离心10s。

7. 将流穿液重新吸回至吸附柱，重复洗脱2次。可在紫外灯下观察洗脱效果。 8. 将吸附柱及Resin交回给老师，洗脱下来的蛋白做好标记保存在－20℃。

11、诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测

原理：

带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比,而与颗粒半径(分子量和结构)和介质粘度成反比，使用同种凝胶和相同电压，SDS为十二烷基磺酸钠，是一种强阴离子去污剂，蛋白与SDS结合后均带负电荷，二硫苏糖醇(DTT)还原剂可以打开二硫键等连接，使链展开。多肽与SDS结合的量与多肽的分子量成正比，SDS多肽复合物的迁移率只与分子量相关。

凝胶电泳：分子筛作用、浓缩效应 步骤： 1、 配胶

30%丙烯酰胺溶液——单体

0.5mol/L Tris(pH6.8)浓缩胶1.5mol/L Tris(pH8.8) 分离胶——缓冲液 10%SDS——变性剂

TEMED四甲基乙二胺——催化剂 10%过硫酸铵——交联剂

2、灌胶——分离胶下，浓缩胶上，分离胶在梳子下沿1cm，加400ul水密封，注意气泡 3、点样及电泳——Tris-甘氨酸电泳缓冲液，80V进胶，120V电泳 4、染色和脱色——考马斯亮蓝染色过夜，脱色液脱色1-2h 5、观察

二、 技巧及理论等

1、 影响蛋白质表达的因素有哪些？

2、 SDS-PAGE电泳有哪些效应？

3、 TE缓冲液中为什么要添加EDTA？

4、 聚丙烯酰胺凝胶电泳中，分离胶之上为什么要加水？

5、 DNA错误插入率高的原因有哪些？

6、 DNA不纯怎样解决？

7、 细菌培养过夜时，培养皿为什么要倒置？

还有其他小题哦~~~

请看老师ppt上的一些注意事项，以及试剂的作用，一些步骤顺序及为什么要这样做？ Good luck

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5tap.html