苏州大学本科生毕业论文

苏州大学本科生毕业设计（论文）

目 录

摘要 ........................................................................................................................... 1 前言 ........................................................................................................................... 3 1 材料和方法 ........................................................................................................... 3 1.1 材料及主要试剂 ................................................................................................ 4 1.2 方法 .................................................................................................................... 4 1.2.1 引物设计 ......................................................................................................... 4 1.2.2 PCR扩增目的片段 ........................................................................................ 4 1.2.3 目的片段的分离和回收（Takara回收试剂盒） ........................................ 5 1.2.4 酶切反应 ......................................................................................................... 5 1.2.5 连接反应 ......................................................................................................... 5 1.2.6 感受态细胞制备 ............................................................................................. 6 1.2.7 连接产物的转化 ............................................................................................. 6 1.2.8 试剂盒抽提质粒DNA ................................................................................... 6 1.2.9 重组质粒的鉴定及测序 ................................................................................. 6 1.2.10 原核表达 ....................................................................................................... 7 1.2.11 SDS-PAGE蛋白电泳 ................................................................................... 7 2 结果 ....................................................................................................................... 8 2.1 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆 ....................................................... 8 2.2 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析 ....................................................... 9 2.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定 ................................................................... 12 2.4 蛋白质表达与SDS-PAGE分析 ..................................................................... 13 2.5 Western Bloting分析........................................................ 错误！未定义书签。 3 讨论 ..................................................................................................................... 14 参考文献： ............................................................................................................. 15 致 谢 ..................................................................................................................... 16 附录1. .................................................................................................................... 19 附录2. .................................................................................................................... 20

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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达

摘 要

本研究以家蚕中大造品种为材料，以其 cDNA为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin-2基因；采用大肠杆菌原核表达系统（BL21）进行家蚕Serpin-2基因的表达研究。主要结果如下：

根据已知野蚕Serpin-2（GenBank登录号：AF242200.1）序列设计合适的引物，采用PCR方法克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析表明，家蚕Serpin-2基因编码区长度为990bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75 kDa，等电点约为4.67。与家蚕

Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度高达99.29%，氨基酸序列相似度高达98.93%，

推测家蚕Serpin-2与野桑蚕Serpin-2基因起着相同或类似的作用。

将家蚕大造Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌BL21中，经1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明，经IPTG诱导转化家蚕Serpin-2的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带，相对分子量约44 kDa，与预计的大小相符，证实家蚕

Serpin-2在大肠杆菌中得到表达。

家蚕Serpin-2基因的成功克隆和原核表达研究为从分子水平上解析Serpin在野桑蚕体内的功能打下了基础。

关键词：家蚕；Serpin-2；基因克隆；原核表达

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Cloning and prokaryotic expression of Serpin-2 gene of Bombyx

mori

Abstract

In this study，the gene of Serpin in Bombyx mori (Serpin-2) was cloned by PCR using the whole body cDNAs as templates. E.coli prokaryotic expression system was used for expression study of serpin-2 gene. The main results are as follows:

According to the sequence of Bombyx mandarina serpin-2 gene, proper primer was designed and Serpin-2 gene of Bombyx mori（The GenBank accession numbers：AF242200.1）was cloned by PCR. According to sequence analysis, the 990bp coding region of Serpin-2 encoding 329 amino acid residues results in theoretical molecular weight of 43.75 kDa, isoelectric point of 4.67. Comparied to the Serpin-2 gene of Bombyx mori and Bombyx mandarina，the gene identity and amino acid identity reach 98.7%，respectively. It reveals that Serpin-2 of Bombyx mori and Bombyx mandarina may play a same or similar role.

The Serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector pET-28a（+） and then transformed into E. coli BL21(DE3). And 1mmol/L IPTG was used to induce the target protein to express. SDS-PAGE analysis indicated that there was a specific band with relative molecular weight of 44 kDa on PAGE profiles for the BL21 with Serpin-2 induced by IPTG, comparied to the contract BL21 and BL21 with empty pET-28a(+)，which confirmed that the Serpin-2 gene was successfully expressed.

The successful cloning and prokaryotic expressing research of Serpin-2 gene in Bombyx mori has established the foundation for analying the fuction of Serpin in Bombyx mori.

Key words: Bombyx mandarina; Serpin-2; cloning; prokaryotic expression

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前 言

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年衍变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂，是一种球状蛋白，并且各种Serpins大约有30％的序列同源性，疏水区同源性高达70％[2]。目前，大约已有500 种Serpins 在动物、微生物、病毒和植物中得到鉴定（Irving JA， et al.， 2000）。 由350至500个氨基酸组成并且有着高度保守的三级结构[3]。该抑制剂已陆续在真核生物，细菌和病毒中得到鉴定，而其超家族很多成员也被鉴定存在于病毒、植物和动物细胞组织中，而这些成员中大多数都是从哺乳动物血浆中分离的，它们大多与凝血过程有关[4]。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶的活性而参与了许多基本的生命活动，已经被广泛应用于农业、医药和食品等行业，对昆虫的生命活动也至关重要。

Serpin在昆虫的头部、精巢和卵巢中的含量也很丰富，甚至在丝腺，中肠中也有分布，并且在受到外界微生物刺激时Serpin在昆虫的血淋巴和脂肪体中大量表达（Tong Y and Kanost MR， 2005； Aratake H， et al.， 1990； Zou and Jiang， 2005）。有报道证明，一些Serpins在血细胞的细胞质中表达，也有一些Serpins蛋白在细胞内产生作用，定位于细胞质或细胞质和细胞核之中（Tong Y and Kanost MR， 2005； 樊净， 2003） 。近10年来，昆虫Serpin分子水平的研究进展很快，但与哺乳动物相比，其新基因的发现、基因结构分析、表达调控和基因功能的研究较少，对于有些基因的功能机制还不清楚，在鳞翅目野桑蚕中的研究则更少[6]。

目前对家蚕serpin家族成员的研究主要集中在Serpin6（刘衬丽，许雅香等）、Serpin16（董照明，赵萍等）和Serpin4（查宏贤，许雅香等）。其中对Serpin2的研究主要在烟草天蛾，Tong和Kanost（2002）发现烟草天蛾serpin2A参与免疫反应，抑制多种血淋巴蛋白酶，如烟草天蛾Serpin2抑制了血液中酚氧化酶原的活化级联反应；使用革兰氏阴性菌和阳性菌刺激烟草天蛾后，Serpin2与血液中的HP1形成复合物；并且，Serpin2还同时与HP21以及另外两个未鉴定的蛋白酶形成复合物。Zou等（2009）将家蚕34条serpin进行了进化分析，发现家蚕Serpin2与烟草天蛾的Serpin2A有较高同源性。

为此本课题拟对家蚕Serpin2基因作较详细有研究，主要集中在基因克隆，序列分析比对。为研究家蚕Serpin2蛋白的功能打下基础。本研究计划利用基因Bank获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin2）基因序列、通过已知序列设计引物。利用PCR技术基因克隆技术扩增并克隆家蚕Serpin2基因。经基因测序，对序列进行分析和比对。从而达到研究目的。

[3]

1.材料和方法

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1.1 材料及主要试剂

家蚕（大造）cDNA、宿主菌E．coli TG1菌种、BL21菌皆为苏州大学特种经济动物饲养实验室保存。

克隆载体pUCm-T为Takara公司产品；原核表达载体pET-28a（+）由本实验室保存。PCR试剂盒（内含Taq酶、dNTPmix、10×buffer等）、凝胶回收试剂盒、250 bp

DNA Marker、100bp-6000bp DNA Ladder Marker、限制性内切酶Hind3、BamH1

和T4 DNA Ligase为宝生物工程(大连)有限公司产品；蛋白质Marker为Promega公司产品；小牛血清白蛋白为上海生工生物工程有限公司产品；质粒小量快速抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品。

NCBI的Blast工具；ExPASy在线ScanProsite程序（http://www.expasy. org/tools/pi_tool.html）；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在线程序；DNAMAN软件；Tanon Gis凝胶图像处理系统。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据家蚕Serpin-2序列设计一对引物扩增野桑蚕Serpin-2基因的ORF区域。 正向引物SPN2F：5’-CCCAAGCTTTCAATTTCGTCCACG-3’ 反向引物SPN2R：5’-CGCGGATCCATGGATTCAAAGGCT-3’

1.2.2 PCR扩增目的片段

a. 在离心管中，按照Takara公司Taq酶的使用说明进行如下操作：

ddH2O

10×LA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) dNTP混合物(每种10 mmol/L) Serpin2F Serpin2R

模板cDNA

35.5 μL 5 μL 4 μL

2 μL (10 μmol/L) 2 μL (10 μmol/L) 1 μL（约0.1～0.2 μg） 0.5 μL

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La×Taq酶

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比分析，发现基因在相似部分碱基重合度为98.7%（图5）

图5野桑蚕和家蚕Serpin-2基因相似部分对比分析

（红色竖线表示碱基相同）

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又如图6所示，测得的家蚕Serpin-2基因的ORF长度为987 bp，编码329个氨基酸残基。其蛋白质预测分子量约为 43.75 kDa，等电点约为4.67。

10 20 30 40 50 60

1 ATGGATTCAAAGGCTTTATCCTCTGCAGTCACCAAGTTCTCTGCAAAGTTTTGCAATGAA 1 M D S K A L S S A V T K F S A K F C N E 70 80 90 100 110 120

61 CTGGATAAAAAGAAGAATGTTGTATCATCGCCATTGTCAGCAGAATACTTGCTGGCGTTG 21 L D K K K N V V S S P L S A E Y L L A L 130 140 150 160 170 180

121 ATAACTTTGGGAACTACTGATCCTGCACACGAAGAGCTATTGACAAGCCTAGGTATCCCG 41 I T L G T T D P A H E E L L T S L G I P 190 200 210 220 230 240

181 GATGATGACACGATTCGCTCATCATTCTCGGCTGTGTCGTCAAAATTGAAATCAATAAAA 61 D D D T I R S S F S A V S S K L K S I K 250 260 270 280 290 300

241 GGTGTTACGTTTAATGTAGCCAACGAAATATACATCAAGGAGGGTGACTATGAGCTCGAC 81 G V T F N V A N E I Y I K E G D Y E L D 310 320 330 340 350 360

301 CCAAAACTTAAGAAGGACGCTGTCGAGGTATTCGATGCAGATTTTGAAAAAGTTGACTTC 101 P K L K K D A V E V F D A D F E K V D F 370 380 390 400 410 420

361 GATAACGGAGCCGCAGCCGCCGGCCTAATAAACAAATGGGTTGAAAATAAAACAAATGAA 121 D N G A A A A G L I N K W V E N K T N E 430 440 450 460 470 480

421 CGTATTAAAGATCTCTTGAGTGAAGACAGCCTCGATTCGTATACGCGTTTGGTTTTGGTC 141 R I K D L L S E D S L D S Y T R L V L V 490 500 510 520 530 540

481 AACGCTCTCTACTTCAAGGGTACATGGCAAAACCAGTTCGACTCTATAAGCACCATGGAG 161 N A L Y F K G T W Q N Q F D S I S T M E 550 560 570 580 590 600

541 CGACCGTTCTATGTTGACACCGAAACGACAGTTAATATTCCTATGATGTACCAAGAAAAT 181 R P F Y V D T E T T V N I P M M Y Q E N 610 620 630 640 650 660

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601 AATTTCAAGTATGGTGAGAGCCACGACCTCAATGCGCAGTTACTTGAAATGGCGTATGAA 201 N F K Y G E S H D L N A Q L L E M A Y E 670 680 690 700 710 720

661 GGTAACGATGCCAGCATGGTTATCGTGCTGCCGAACGAAATTAATGGCCTGGACGGGATA 221 G N D A S M V I V L P N E I N G L D G I 730 740 750 760 770 780

721 CTGCAGAAGCTGGCCGATGGCTACGACCTAACTTCGGAACTGGACAAAATGTTCTCGACC 241 L Q K L A D G Y D L T S E L D K M F S T 790 800 810 820 830 840

781 AAAGTGCGAGTGACGGTGCCGAAATTCAAGATCGAAACTGAGATTGATCTACTTCAAGTT 261 K V R V T V P K F K I E T E I D L L Q V 850 860 870 880 890 900

841 TTGCCCAAGTTGGGTATTCAGGCGATCTTCAACCGCCAGAATTCCGGTCTGACCAAGATC 281 L P K L G I Q A I F N R Q N S G L T K I 910 920 930 940 950 960

901 TTGGATAACGACGAGCCGCTGTACGTATCCAAGGCTGTGCAAAAAGCCTTCATTGAAGTC 301 L D N D E P L Y V S K A V Q K A F I E V 970 980 990 1000 1010 1020 961 AACGAGGAAGGCGCCGAAGCAGCCGCCTGA 321 N E E G A E A A A *

图

6家蚕Serpin-2基因的cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列

（星号（＊）表示终止密码子）

2.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定

将PCR产物回收纯化后连接进pET-28a（+）原核表达载体；重组质粒经Hind3 、BamH1双酶切鉴定，结果如图（6）。在约1.2 kb大小位置出现了一条条带，与预期结

果相一致。

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图6 野桑蚕Serpin-2基因表达重组质粒酶切鉴定

M. DNA marker；1.带有目的片段的pET-28a载体酶切结果

2.4 serpin-2的蛋白质原核表达SDS-PAGE分析

家蚕Serpin-2重组转化菌经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析如图7所示，在

40～50 kDa大小位置诱导转化目的基因Serpin-2的BL21菌与对照组BL21(DE3)菌、

空pET-28a(+)转化BL21(DE3)菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带(图7中箭头所指)，而预测的野桑蚕Serpin-2蛋白分子量约为43.75 kDa,与预期的所要表达的Serpin-2蛋白分子量大小相符，推测家蚕Serpin-2基因在大肠杆菌中得到成功表达。

图7 Serpin-2基因表达产物的SDS-PAGE电泳和Western Blot分析

M．蛋白质Marker；1．无质粒转化的BL21菌的表达; 2. 空载体pET-28a转化BL21

菌后的表达；3.经1mM IPTG诱导的pET-28a-Serpin-2的表达；

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3 讨论

家蚕( Bombyx mori L. )和 野桑蚕( Bombyx mandarina Moore) 同属鳞翅目家蚕蛾科。研究证明,家蚕与野桑蚕的血缘十分亲近[7]，根据野桑蚕Serpin-2序列设计引物，采用PCR方法成功克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析表明，家蚕Serpin-2基因编码区长度为987 bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75 kDa，等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度达99.29%，有8个基因不同；氨基酸序列相似度达98.93%，4个氨基酸残基有差异。推测野桑蚕与家蚕Serpin-2起着相同或类似的作用。

将野桑蚕Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌

BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳表明，野桑蚕Serpin-2在大肠

杆菌中成功表达，蛋白相对分子量约44kDa，与推导的蛋白分子量相符。pET-28a（+）作为原核表达载体，它含有T7启动子，是一种T7噬菌体表达系统，具有能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因的优点，而且其转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，大量表达目的蛋白。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点，可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白，从而获得重组的目的蛋白，是一种较好的表达载体。与真核表达系统相比，具有成本低廉，操作简单，容易培养，生产周期短，易于获得高水平表达蛋白的优点[8]。本研究成功构建了含有Serpin-2基因完整ORF序列的原核表达载体，并且目的基因在原核大肠杆菌细胞中成功表达，为进一步对该表达产物的活性分析及相关功能研究提供了参考。

目前，昆虫Serpin-2的功能特性尚无清晰的研究和认证，鉴于Serpin超家族成员的同源性较高，可以从研究该家族中其他成员着手，探索研究Serpin-2的生理功能。很多实验表明Serpin 在昆虫中具有一定的免疫作用。它们与丝氨酸类蛋白酶形成非共价复合物，在局部发生黑化反应，阻止丝氨酸蛋白酶的级联反应，从而抑制多酚氧化酶原的激活，发挥它们的免疫功能[9]。

经分析，该野桑蚕Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列。信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中[10]。该研究中Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列表明它在细胞内起作用，这一点跟烟草天蛾Serpin-2有共同之处。烟草天蛾Serpin-2是一种细胞内蛋白质[11]，在细菌刺激后，该基因在血细胞的细胞质中表达[12]。野桑蚕Serpin-2在细胞内的调控网络中如何发挥作用，其具体调节机制和功能还有待更进一步研究。

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参考文献

[1] 于继彬,季平,沈卫德.野桑蚕的遗传多样性及其研究进展(J).中国农业, 2001,

22(4):51-5

[2] 张梅,朱柞铭,1996.丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究及应用.生物化学与生物物理进

展,23(3): 240-244

[3] 樊静.丝氨酸蛋白酶抑制剂B家族(J).生命的化学,2003,23(4):275-276

[4] Carrell RW, Bowell DR, 1986. Serpins: the superfamily of plasma serine

proteinase inhibitors. Elsevier Biomedical Press, 403–419.

[5] 吴秀萍,于申业,刘相叶等.旋毛虫Serpin 基因的体外表达及其特性鉴定(J).中国生物

制品学杂志,2009,02,22(2)

[6] 刘衬丽,王东,李兵等. 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6的克隆、序列分析和组

织表达(J).昆虫学报.2009.01

[7] 中国农业科学院蚕业研究所.中国养蚕学(M).上海:上海科技出版社,1991

[8] 董伟,董晓慧,楚雍烈等.人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达.西

安交通大学学报,2006,27(1): 11-14.

[9] Zhu Y, Wang Y, Gorman MJ, et al., 2003. Manduca sexta Serpin-3 regulates prophenoloxidase activation in response to infection by inhibiting prophenoloxidase- activating proteinases. J. Biol. Chem., 278(47): 46556-46564.

[10] 郑斌,詹希美.信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用(J).生物技术通讯.2005年3期 [11] Gan H, Wang Y, Jiang HB, et al., 2001. A bacteria induced, intracellular serpin in granular hemocytes of Manduca sexta. Insect Biochem.Mol.Biol., 31(9): 887-898.

[12] Tong Y, Kanost MR, 2005. Manduca sexta serpin-4 and serpin-5 inhibit the prophenol oxidase activation pathway. J. Biol. Chem., 280(15): 14 923-14 931.

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致 谢

本次毕业设计是在许XX副教授的悉心指导下完成的。实验过程中我不断地遇到各种困难，在想放弃的时候是许老师一直鼓励我做下去，直到实验成功。许老师一丝不苟的工作作风、严谨的治学态度、真诚待人的品德风范，使我受益匪浅。在这一年中，许老师不仅在学业上给予我精心指导，在生活上也给予我关怀和爱护，在我遇到生活中无法解决的矛盾问题时，许老师能够耐心听我的倾诉并教授我相关的人生经验，给与我最大的鼓励和支持。在此，向许雅香老师表示衷心的感谢，感谢许老师在过去一年中为我的成长倾注了心血。

感谢沈卫德老师的关心与鼓励。沈老师的平易近人和谆谆教诲将使我终身受益。 感谢班主任王艳红老师及所有教授过我课程的苏州大学的老师们，是你们的诲人不倦才有了现在的我。

特别感谢査宏贤师兄、孙姗姗师姐在实验设计上给予的有益启示和实验操作中给予的指导和帮助，感谢特种经济动物饲养实验室老师同学给予我的各方面的支持和帮助。

感谢父母不求回报地付出。

最后，谨向论文评阅和答辩的全体专家致以最真诚的谢意。

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附录1.

pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白

斑筛选有插入片断的重组克隆。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，

pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以

把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

pUCm-T载体的图谱如下：

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附录2.

原核表达质粒pET-28a(+)

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/f8o5.html