生物技术药物实验讲义 - 图文

生物技术药物讲义

前言

生物制药技术是制药工程及药学专业的专业课之一，它内容覆盖了生物技术的许多研究领域，使学生得到生物技术实验操作的全程、全方面训练，以提高学生的学习兴趣、动手能力和工作的责任心。

生物技术药物这门课程通过讲授生物制药技术的基本概念，基本理论入手,使学生理解和掌握如何从基因表达出发,到生产出合格的药品的详细过程,有重点介绍胰岛素,细胞因子等的生产过程,增强学生的学习兴趣,培养学生的综和素质。

实验内容同时将过去简单的验证性实验转变为综合性、设计性实验，旨在实验中提高学生实验设计能力、分析问题、解决问题的能力以及实验数据的处理能力，从而培养和提高学生的实践能力和创新能力。还能大大提高学生对这些热门学科的兴趣，对提高学生的综合素质和创新能力具有重要的作用和意义。

实验一 质粒DNA的提取

一、实验目的

掌握最常用的提取和纯化质粒DNA的方法。 二、实验原理

质粒是染色体外能独立遗传的共价闭合双键DNA分子，它存在于细菌和其他一些生物体内，能够提供给宿主细胞一些表现型如抗药性、分解复杂有机物的能力。细胞质粒是常用的基因工程载体，它的提取可以大致分为：细菌培养物的生长、细菌的收集和裂解以及质粒DNA的纯化几步。

本实验就是应用细菌培养物在含有Amp的LB固体培养基上培养筛选后通过LB的液体培养基过夜培养，使得菌体大量增长，然后通过离心沉淀收集菌体进行下面的碱变性法裂解细菌，使细胞内的DNA物质溶解出来。因为宿主菌的线性染色体DNA与闭环双键质粒DNA的结构状态的差异，在变性的状态下线性DNA和质粒DNA是不能完全分离的。只有当条件恢复时，质粒DNA迅速准确配置，重新形成完全天然超螺旋分子，而现状DNA则交联变成不溶于水的线团结构，附在细胞碎片上一起被离心出去。然后再通过一定的溶液纯化提取到的质粒DNA，最后进行琼脂凝胶电泳检测提取到的质粒DNA的纯度。

三、实验仪器与材料

仪器：灭菌锅；冰箱；制冰机；旋涡混合仪；微量移液器；超净工作台；常温离心机；水浴锅；核酸电泳仪；紫外分光光度计

材料：

LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃

灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；

含质粒的大肠杆菌菌株：如pBSSK/DH5α、pET28/BL21； 氨苄青霉素：母液100mg/ml，工作浓度100ug/ml；

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA； 溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS； 溶液III：3mol/L醋酸钾用醋酸调到pH 4.8； 酚/氯仿/异戊醇：V/V=25:24:1； NaAc：3mol/L，pH5.2；

TE：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA； 无水乙醇；70%乙醇； RNaseA：10mg/ml。

进口琼脂糖 (agarose)：质量分数为0.8%～1.5%；

10×TBE缓冲液 ：108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至1L。电泳时工作浓度为 0.5×TBE缓冲液；

溴化乙锭(ethidium bromide,EB)：贮存浓度为0.5mg/ml，工作浓度为0.5mg/L； 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，4℃保存； λDNA/HindⅢ标准Marker。

四、试验方法与步骤

⑴、菌种的培养：将含质粒的菌液接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签或接种针挑取单菌落接种到5ml含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（约18小时）备用。

⑵、打开超净工作台的风门开关，用酒精棉球分别擦拭手、工作台面、微量取液枪以灭菌。

⑶、点燃酒精灯，用镊子取一支灭过菌的离心管置于离心管架上，作好标记。 ⑷、将装有菌液的锥形瓶瓶口部分在酒精灯火焰上过火灭菌后，打开盖子，用微量取液枪取1.5ml菌液于离心管中，将装有剩余菌液的锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上灭菌后封口备用。

⑸、将离心管置于离心机中，12000rpm离心1min。

⑹、弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上数秒使液体尽可能流尽。

⑺、加入100ul溶液I，用枪吹打悬浮后置于旋涡混合仪上振荡，使菌体充分悬浮，室温静置5min。

⑻、加入200ul新配制的溶液II，温和颠倒混匀，冰浴中静置5min。 ⑼、加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，冰浴中静置10min。 ⑽、将管置于离心机中，12000rpm离心10min。

⑾、取上清，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，将管置于离心机中，12000rpm离心5min。

⑿、取上清,加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，将管置于离心机中，12000rpm离心5min。

⒀、取上清，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇, 轻轻颠倒混匀，于-20℃冰箱中静置30min。 ⒁、将管置于离心机中，12000rmp 离心15min。

⒂、弃上清。将管口打开倒置于纸巾上数秒使液体尽可能流尽。

⒃、用1ml 预冷的70％乙醇洗涤沉淀1次，将管口打开倒置于纸巾上数秒使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上10-15 min除酒精。

⒄、用40μl TE溶解沉淀后，再加入2μlRNaseA，置于离心机中稍许离心混匀，再置于水浴锅中37℃保温30min除RNA。

⒅、取2ul样品用水稀释100倍后，以水为对照测其OD260与OD280值。

⒆、另取5ul样品与2ul 6×上样缓冲液混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度和分子量。

⒇、其余样品作好标记后贮存于4℃冰箱中备用（用于构建重组子）。

五、实验结果与讨论

实验二 紫外分光光度法测定DNA纯度和浓度

一、实验目的

通过紫外分光光度计对DNA浓度和纯度的检测，进一步熟悉了解之外分光光度计的使用。

二、实验原理

紫外分光光度法的测定原理

核酸分子由于含有具共轭双键结构的嘌呤和嘧啶，可强烈吸收250-280nm波长的紫外光，其最大吸收波长为260nm，最小吸收波长为230nm。常可据此对核酸进行定量的测定和纯度的鉴定。

○1、定量测定DNA的依据

定量测定时可将OD260代入下列经验公式粗略计算核酸的浓度： 双链DNA的含量（ug/ml）= OD260 ×50×稀释倍数 50：当OD260=1时，溶液中双链DNA的含量为50ug/ml 单链DNA的含量（ug/ml）= OD260 ×40×稀释倍数 40：当OD260=1时，溶液中单链DNA的含量为40ug/ml ○2、DNA纯度鉴定的标准

纯的DNA：1.8≤OD260/OD280≤1.9；OD260/OD230＞2。

? 如OD260/OD280＞2，说明RNA没有除干净或DNA已变性解链。 ? 如OD260/OD280 ＜1.7，说明蛋白质没有除干净。

? 如OD260/OD230 ＜2，说明小分子物质（如酚，盐酸胍等）没有除干净。

三、实验仪器与材料

仪器：紫外分光光度计；微量移液器 ；烧杯；离心管； 材料：

（1DNA样品溶液，H2O

四、实验步骤

（1）分光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

（2）取质粒DNA样品2ul，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 （3）在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为ug/ul，则样品DNA浓度为OD值的10倍，即如OD260=0.1，则样品浓度即为1ug/ul。

（4）若OD260/ OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。

五、实验结果与讨论

实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一、实验目的

（1）通过学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA，掌握水平式凝胶电泳技术。 （2）通过测定提取到的染色体DNA或质粒DNA的纯度和浓度，为进一步的酶切、连接及转化条件的选择提供依据。

二、实验原理

凝胶电泳原理

带电物质在外加电场中向相反电极移动的现象称为电泳 (electrophoresis) 。带电颗粒在外加电场中的泳动速度可用下式表示：

V:分子的泳动速度； Q:分子所带的电荷； r：分子的半径； η:介质的粘度。

即泳动速度与分子本身所带静电荷的数量成正比，与分子的大小成反比，与分子的形状也有关。

核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，即可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。

电泳中所使用的支持介质有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝脉。前者分辨率稍低,但分离范围广、易于操作,适用于较大分子（如大片段 DNA ）的分离。后者分辨率高,适用于较小分子的分离。核酸电泳中常采用琼脂糖凝胶。

琼脂糖是从海藻中提取到的长链状多聚物,当琼脂糖加热至90℃左右,即可熔化形成清亮、透明的液体,待冷至40-45℃时则可固化形成凝胶 。琼脂糖凝胶约可区分相差loobp的DNA片段，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp-50kb的DNA片断 。

电泳时通常在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），利用EB能插入核酸分子的碱基对之间而与核酸结合并在紫外灯下能发出橙黄色荧光的特点，在紫外光下即可检测出10ng的核酸条带。

三、实验仪器与材料

仪器：紫外分光光度计；微量移液器 ；烧杯；离心管；核酸制胶装置；天平；微波炉；电泳仪；凝胶成像系统；手套；封口膜；锥形瓶；制冰机；pH计

材料：

（1）DNA样品溶液，H2O

（2）5×TBE：54gTris;27.5g硼酸；EDTA（0.5mol/L，pH8.0）20ml，加水至1L，用前稀释10倍

（3）溴化乙锭（EB）：0.5mg/ml溶液，工作浓度为0.5mg/L，即使用前稀释1000倍。 （4）6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，4℃保存； （5）λDNA/HindⅢ标准Marker。

四、实验步骤

⑴、将制胶槽调水平，安装好制胶装置，插好梳子。

⑵、将天平调水平。取出称量纸，将纸四边折起后置于天平上，调零。 ⑶、称取0.28克琼脂糖于一锥形瓶中，加入40ml 0.5×TBE缓冲液，混匀。 ⑷、将锥形瓶置于微波炉中，高火2-3min，加热熔化至无颗粒状琼脂糖。

⑸、取出锥形瓶，待冷却至60℃左右，加入5μl EB，摇匀后立即倒入准备好的胶室中。 ⑹、待胶完全凝固后(约需30 min)，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，使加样孔端置于负极，再向电泳槽中倒入0.5×TBE缓冲液至液体刚好淹过凝胶面。

⑺、取一块封口膜（或一次性塑料手套）平放于桌面上，将6×上样缓冲液依次相间点在膜上（每点约2ul）。

⑻、取6ul基因组DNA（或其它DNA样品）加到膜上的上样缓冲液中，用枪吹打混匀。 ⑼、将混匀液小心加到凝胶上的加样孔中。

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