食品生物技术实验

实验1 糖化酶固定化技术

1 实验目的

(1)熟悉酶的固定化技术和原理。 (2)掌握糖化酶的固定化操作。

2 实验原理

在一定pH条件下，带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物，同时，海

藻酸钠与钙离子在一定条件下结合形成不溶于水的微球，从而使混合于其中的糖化酶通过包埋固定化。戊二醛含有两个醛基，可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生反应，相互交联而使固定化酶硬化，由于带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物已将绝大部分游离酶包埋起来，因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间，使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高。

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

磁力搅拌器，pH计，水浴锅，500mL烧杯，50mL注射器，12号注射器针头，冰箱。 3.2 药品及配制

（1）所需药品：糖化酶，明胶，海藻酸钠，氯化钙，戊二醛，生理盐水。 （2）活力单位为70U/mL的糖化酶酶液100ml：用所给糖化酶配制。 （3）浓度为3%的明胶溶液150ml：称取明胶4.5g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，静止10分钟，水浴加热使明胶溶解，注意水浴的温度不超过70℃。

（4）3%的海藻酸钠溶液150ml：称取海藻酸钠4.5g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，不断搅拌同时加热煮沸彻底溶解。

（5）1％氯化钙溶液500ml。 （6）5％的戊二醛溶液500ml。 （7）5％稀盐酸：调节pH用。

4 实验操作

将15mL糖化酶液与40℃150mL3％的海藻酸钠溶液混合搅拌，加入40℃

150mL3％的明胶溶液混合乳化约10min，调pH为4.2~4.6，缓慢搅拌并降温至5～

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10℃，用12号注射器的针头将上述冷却液从3cm的高度注进1％氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，将球取出置人30℃ 5％的戊二醛溶液中进一步硬化1h，用生理盐水洗涤后，过滤得固定化糖化酶，贮存在0～5℃冰箱中备用。

5 实验结果

观察所得固定化糖化酶的色泽和形状，粗测其粒度大小，测量其体积和沥干水后的重量，把所得各项指标填入下表：

表1 所得固定化糖化酶的外观、体积和质量

形状及大小 色泽 总体积（ml） 总重量（g）

6 思考题

1． 本实验的固定化方法是所述哪几种酶固定化方法的结合? 2． 为何固定时乳化液的pH要保持在4.2~4.6？

实验二 固定化糖化酶活力的测定

1 实验目的

（1）学习固定化糖化酶活力的测定方法。

（2）了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

2 实验原理

糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉β-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉α-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉β-1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其醛

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基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。

I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI

体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。 3.2 试剂

（1）2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。

（2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液

称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至 1000ml贮存于棕色瓶中。

（5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

（6）1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。

（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液

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配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。

4 实验方法步骤

（1）固定化糖化酶的称量

称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL)，待用。 （2）酶活力的测定

于甲、乙、丙三个三角瓶中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热5-10min，在甲管中加入待测酶液2ml(酶活总量约100-170单位)，乙管中加入已经称量好的固定化酶，丙管加2ml蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h后（加固定化酶的三角瓶在反应过程中应不断搅拌），取出各加20%NaOH溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。

取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml，摇匀后暗处放置15min。加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。

5 结果计算

5.1 计算原酶液和所得固定化糖化酶的活力

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=（A-B)N ×90.05 ×（1/2） ×（32.2/5） ×n

式中 A——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； B——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml）； N——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L）；

90.05 ——1ml l mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量（mg）；

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1/2 ——折算成1m1酶液的量 32.2——反应液总体积（ml）

5 ——吸取反应液样品的体积（ml）； n ——酶液稀释倍数。 5.2 计算固定化酶的活力回收率

固定化酶活力回收率=

固定化酶总活力 用于固定化的酶的总活力

× 100%

6 思考题

（1）该实验中影响糖化酶活力单位测定值的因素主要有哪些？

（2）比较分析DNS比色法、斐林试剂热滴定法与碘量法三种测定糖含量方法的特点。

实验三 干红葡萄酒的酿制

葡萄酒是葡萄汁发酵而成的低度酒精饮料，它的主要成分有单宁、酒精、糖分、有机酸等。葡萄酒的品种繁多，按酒色分为白葡萄酒、桃红葡萄酒、红葡萄酒；按酒中糖分含量分为干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒；按饮用方式分为餐前、佐餐和餐后葡萄酒；按酿造方法分为天然葡萄酒、加强葡萄酒、添香葡萄酒；按酒中CO2含量分为静酒和起泡酒。葡萄酒的生产工艺成熟，原料来源丰富。既可工厂大规模生产，又可庄园小批量酿造。

一、实验目的

学习葡萄酒酿制的原理，掌握葡萄酒主要理化指标及其测定方法。 二、实验原理

葡萄酒的酿造原理是利用葡萄皮自带的酵母或人工接种的酵母菌，将葡萄汁中的葡萄糖、果糖发酵，生成酒精、二氧化碳，同时生成副产物高级醇、脂肪酸、挥发酸和酯类等，并将葡萄原料中的色素、单宁、有机酸、果香物质、无机盐等所有与葡萄酒质量有关的成分，都带到发酵的原料酒中，再经陈酿澄清，使酒质达到清澈透明、色泽美观、滋味醇和、芳香宜人。

三、实验材料与仪器

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1．材料：新鲜葡萄，活性干酵母菌，6％的亚硫酸，白砂糖，酒石酸(柠檬酸)，滤纸，酒精，皂土，纱布，漏斗。

2.试剂：0.1mol／L NaOH标准溶液，4g/L浓度的碘液(精确浓度为3.97g/L)，2％可溶性淀粉溶液，1.0g/L标准葡萄糖溶液（盐酸酸化）， 1mol／L NaOH溶液，1/3浓度的硫酸。

3.仪器：手持式糖度，酒精度计，密度计。 四、工艺流程及操作步骤 1.工艺流程

成熟的红葡萄→分选→去梗破碎→加二氧化硫→发酵→压榨→调整酒精含量→后发酵→换容器→贮存→换容器→贮存陈酿→下胶→过滤→→冷冻→过滤→灌装→干红葡萄酒

2．操作步骤 （1）器具准备

破碎葡萄之前，先将用具洗刷干净，发酵及贮酒容器用6％的亚硫酸溶液冲洗，或用硫磺烟熏进行消毒。所用器具应选择水缸、上釉陶缸、玻璃瓶、橡木桶、瓷盆等，不得用铁、铜制作的工具，因葡萄汁（酒）与铁、铜接触，会使铁、铜离子溶进葡萄汁，而使酒变质败坏。

（2）原料与分选

酿酒用的葡萄要成熟。成熟的葡萄种子为褐色或深褐色，绿色的葡萄果皮由绿色变为黄色或浅黄色，果实透明发亮。红色葡萄呈紫色或紫黑色，味酸甜。将采收的葡萄剔除霉烂的果子和青果以及其他杂质，取样化验酸度，糖度。

（3）破碎

将分选好的葡萄放在瓷盆内，除去果梗，将葡萄压破或捏破，破碎后不压榨，将皮肉汁混合发酵，以浸提果皮上的色素。

（4）成分调整

我国大多数地区葡萄的含糖量在12％～20％，发酵后生成7％～11.7％的酒精，因酒精含量较低，所以需要在葡萄汁发酵期，补加白砂糖,使发酵后生成所需浓度的酒精。实际生产上，每生成1％酒需要1.7度糖（1.7％）。果汁含糖量调整到21-23％，用葡萄汁溶解糖并在发酵旺盛时添加。

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（5）酸度调整

配制葡萄酒，要求果汁含酸量在0.8～1.2g/100ml为宜，果汁的酸度如果低于0.5g/100ml，可补加酒石酸或利用酸度高的品种葡萄混合发酵，使其酸度达到要求。(本实验不调)

（6）发酵

发酵温度可达33℃，生产中控制在28～30℃之间，主发酵期一般为3～5d。红葡萄酒发酵分以下3个阶段：

发酵初期：主要为酵母繁殖阶段，初期果浆平静，随后在酵母的作用下，开始发酵，温度渐升，葡萄皮被产生的CO2顶浮于液面，进入发酵盛期。

发酵盛期：称为主发酵期，每天需用干净的木棒搅拌2～3次，量大的也可用酒泵搅拌，将酒“帽”搅散压入汁中。当发酵3～5d后（根据葡萄品种和所要做酒的类型确定，如做解百纳类型的干红酒一般要5～6d视颜色浸提程度分离皮渣；做果香型干红酒一般需3～5d）分离皮渣，压榨。

（7）压榨

先用竹筛粗滤，然后将葡萄皮渣装入白布袋中，用手或木棒挤压榨汁，量大者可用螺旋式压榨机进行压榨。质量好的压榨酒可与粗滤原酒混合，装入经洗净消毒的贮酒容器中，但不得超过容量的95％以继续进行后发酵。

压榨后的皮渣可进行蒸馏制取白兰地。 （8）后发酵

在后发酵期，控制品温不超过20℃，后发酵进行15～20d左右，当发酵液糖达4g/L以下时说明整个发酵结束。应及时添加SO2，并保证满容器，在原酒液上添加亚硫酸或高度酒精，防止染菌或氧化。

（9）成品的调配

根据产品标准和风格，将不同的品种、不同的年份酿成干酒进行勾兑（高档酒不允许调砂糖和脱臭酒精或白兰地），以达获得优异的感观质量和合格的理化指标。

（10）冷冻（生产上通常利用冬季温度降至-4～6℃维持7～15d后将酒与含酒石酸氢盐的酒泥分离，除去酒石）

（11）过滤

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酒配制好之后进行过滤（方法同前），使酒液达到澄清透明。 （12）装瓶杀菌

将过滤的澄清酒液调整游离二氧化硫含量在30～40 mg/L（游离二氧化硫约为总二氧化硫的2/3）后装瓶压盖，瓶装在低温、清洁卫生的场所保存。

五、测定方法 1.糖度测定

斐林试剂滴定法，或用手持式折光仪测葡萄汁的糖度（°Bx），再通过查表得糖含量。

2.酸度测定

0.1mol/LNaOH标准溶液滴定。 3.酒精含量测定

发酵液经蒸馏后，用酒精比重计测得。 4.游离硫、总硫测定

①总二氧化硫的测定：取葡萄酒25mL，加入250mL碘量瓶中，加入10mL水稀释，再加入1mol/L氢氧化钠10mL，加塞，摇匀，反应10min，添加1/3浓度的硫酸3～5mL，2～3滴2％淀粉指示剂，立即用4g/L(此浓度的碘液1mL相当于二氧化硫1mg)的碘液测定。

②游离二氧化硫的测定：在反应瓶中加入25mL酒样，加入20mL水稀释，添加1/3的硫酸3mL，2～3滴2％淀粉指示剂，立即用4g/L的碘液测定。

实验四 纤维素酶在果汁制备中的应用

一、实验目的：了解影响果汁出汁率、固形物含量及澄清度的各因素；掌握果胶酶、纤维素酶在果汁生产中的应用。

二、实验原理：水果中含有纤维素、果胶等大分子物质，在榨汁时，这些物质会影响出汁率并使榨出的果汁浑浊，易出现沉淀。添加纤维素酶、果胶酶可以将果胶、纤维素分解成小分子的可溶性的物质，从而提高出汁率并使果汁饮料澄清。

三、实验器材

1．实验材料：新鲜桔子

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2. 主要仪器：榨汁机、恒温水浴锅、分光光度计 3．实验药品：纤维素酶、5%柠檬酸、10%柠檬酸钠 四、实验内容 1.工艺流程

桔子→清洗→去皮→榨汁→过滤→酶处理→比较酶处理前后果汁澄清情况，并测透光率

2.方法步骤

（1）清洗、去皮和榨汁：每小组同学取桔子2-3个（重约200g），冲洗干净，去皮后用榨汁机榨汁。

（2）过滤：用滤布将果汁过滤到烧杯中，用5%柠檬酸或10%柠檬酸钠将果汁pH调到纤维素酶的最适pH值，一般为pH 3.0左右。

（3）酶处理：取由（2）所得果汁20ml，加入0.1%的纤维素酶，在所用纤维素酶的最适作用温度（看包装说明）下保持30min，中间注意不断搅拌或震荡。

（4）测透光率：取加酶处理后的果汁上清液，以蒸馏水为对照，在650nm下测定透光率。同时测定未加酶处理的果汁的透光率，比较两者有何区别。

四、结果与分析 （1）实验结果：

加酶处理后果汁的透光率为： 未加酶处理果汁透光率为：

（2）分析：对比所得实验数据，结合感官分析，说明透光率和澄清度的关系。

五、思考题

（1）影响果汁非生物稳定性的因素有哪些？

（2）除了透光率外，还有什么指标可以用来表示果汁的澄清度？

实验五 制作酸泡菜

一、实验目的：掌握酸泡菜制作的原理和制作方法；熟悉影响泡菜质量指标的各因素及其控制。

二、实验原理：

1. 利用乳酸菌在无氧的环境下大量繁殖制作泡菜。

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2. 亚硝酸盐与某些化学物质发生反应后形成玫瑰红色染料。然后对比颜色，可以估测出泡菜液样品中亚硝酸盐的含量。

三、实验器材

1. 实验材料：新鲜萝卜（或白菜） 2. 主要仪器：泡菜坛、菜刀、砧板 四、操作过程： 1．工艺流程

原料→清洗→晾晒→切分→盐水配置→装坛→封坛发酵→成品泡菜 2.实验操作

（1）原料清洗、晾晒及切分：将萝卜或白菜清洗干净，表面晾干，切成片状或小块。

（2）配置盐水：用冷开水或优质矿泉水来配置盐水，每500ml水加盐15g。也可同时加入10g白沙糖以提高发酵速度，又叫盐糖水。

（3）装坛：将配置好的盐水倒入坛中，放入切分后的原料。

（4）封坛发酵：盖上坛盖，并在坛口边缘的凹槽中装上2-3cm高的清水，以封闭坛口缝隙。在无泡菜坛的情况下，也可以将切分后的原料装入广口玻璃瓶中，然后将瓶子倒扣在装有清水的容器中以达到封闭效果。30℃条件下发酵时间约为5-7天。

（5）开坛：发酵完成后，打开坛子，捞出泡菜，根据个人口味调味后食用。 五、实验结果

请对你所制得的泡菜进行感官评价： 色泽： 组织状态： 滋味： 气味： 六、思考题

1、为什么要用冷开水或优质矿泉水来制作泡菜，而不使用一般自来水？ 2、影响泡中亚硝酸盐含量的因素有哪些？

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/80rt.html