16S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用

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动物医学进展。0 6 2 ( 1:5 1 2 0, 7 1 ) 1—8Pr gr s n e e i r e ii o e s i V t rna y M d cne

1 RNA在细菌分类鉴定研究中的应用 Sr 6刘文强，贾玉萍。赵宏坤。,( .城大学农学院，东聊城 2 2 5;. 1聊山 5 0 92山东大学生命科学学院，山东济南 2 2 0; 5 10

3山东农业大学动物科技学院， .山东泰安 21 1) 7 0 8中图分类号：8 2 6￥ 5 .1文献标识码： A文章编号：0 75 3 ( 06 1—0 50 1 0—0 82 0 ) 10 1—4

该湖大摘要：菌的 1核糖体 RNA( io o 善，技术已应用于海洋、泊和土壤、气微生物细 6S r s me b 2] R NA,R r NA)其在进化上的特征性序列，菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[。以

6Sr NA作为细菌分子鉴定的依据现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指 1 1 R标。其具体操作是，以聚合酶链式反应 ( C分离细菌样本中的 1 R P R) 6S r NA的基因细菌核糖体的 R NA含有 3种类型， 2 即 3sr NA、6Sr NA和 5Sr R 1 R RNA,它们含有的核苷酸分别约为29 0个， 4 0 1 5 0个和 1 0个。2 2 0世纪 6 0

片段，过克隆、序或酶切、针杂交获得通测探其序列信息，与 1 RNA数据库中的序再 6Sr

年代末， ee始采用寡核苷酸编目法对生物进 Wo s开行分类，通过比较各类生物细胞的 r NA特征序他 R

列数据进行比较，定其在进化中的位置，确从列，认为 1 RNA及其类似的 r NA基因序列作 6sr R

而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它综述了 1 RNA作为微生物系统分子分类们为细胞所共有，功能同源且最为古老，含有保 6S r其既

鉴定的理论基础和方法，及在细茵分类鉴守序列又含可变序列，大小适合操作，的序列以分子它定中的应用。 变化与进化距离相适应。5Sr NA虽易分析，由 R但于核苷酸少

,有足够的遗传信息用于分类研究。没

关键词：6Sr 1 RNA;菌；定；类细鉴分传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，取的主要方法是对细菌进行纯培采性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁

而 2 R 3Sr NA含有的核苷酸数几乎是 1 R 6Sr NA的 2,析较困难。与此相比，1 R倍分 6 S r NA的相

作 养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特对分子质量适中，为研究对象较理想。在相当长的进化过程中，RNA分子的功能几 r

而且其分子排列顺序有些部位变化非 琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、乎保持恒定，以致 R易于操作的分类鉴定方法，人们在一定程度上更常缓慢，保留了祖先的一些序列。即 r NA结使

又具有高变性。保守性能够反映加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微构既具有保守性，为系统发育重建提供线索；高生物资源的开发利用奠定基础。2 0世纪 6代开生物物种的亲缘关系， 0年是属种始，子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，分RN一菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方鉴定的分子基础。而且 r A在细胞中含量大，法在细菌分类学中得到广泛应用。C i 等n认个典型的细菌中含有 1 0 aHY ] 000个~2 0核糖体， 000个 可供为，R r NA基因序列己成为一个分子指标，以广泛易于提取，以获得足够的使用量，比较研究之可用。根据核糖体 1 RNA结构变化规律， 6Sr在所测

地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。际基因数据库，为对微生物鉴定分类非常有用的成

、、目前，大量已知微生物的 DNA都被测定并输入国定的区域中包括了 V1 V2 V3和 V4共 4个高变区，尤其是 V2这一高变区，于其进化速度相对较由类单位的比较分析。因此，o e 和 Nel F J h sSW lr e H

参照系统，而可以通过对未知微生物 D从 NA序列快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分的

测定和比较分析，到对其进行快速、效的鉴定达有分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完等报道测定 1 D 6Sr NA基因的部分序列即可达到

收稿日期：0 60一0 2 0—8i

基金项目：城大学博士科研启动基金项目( 10 )聊 38 5作者简介：刘文强( 97,山东临清人， 1 7一)男，讲师，博士，主要从事动物传染病学研究。

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动物医学进展

20 0 6年

第2 7卷

第 l期( 1总第 18期 ) 5

对分离物进行分子鉴定的目的]。

3种：①将 P R产物克隆到质粒载体上进行测序， C 进化树中的位置，而鉴定样本中可能存在的微生从

6Sr NA数据库中的序列进行比较，定其在确 2 l R 6S r NA序列分析鉴定细菌的基本原与 1 R

理和方法

该但通过比较各类生物 1 R 6Sr NA的基因序列，从物种类，方法获得的信息最全面，在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。②通过 1 6S序列差异计算它们之间的进化距离，以绘出生物可 r NA种属特异性的探针与 P R产物杂交以获得 R C进化树。因此，6Sr 1 RNA序列分析技术的基本原微生物组成信息。此外，针也可以直接与样品进探理就是从微生物样本中 1 R 6S r NA的基因片段，通行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生过克隆、测序或酶切、针杂交获得 l R探 6Sr NA序物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分列信息，再与 1 R 6sr NA数据库中的序列数据或其布该方法简单快速，主要应用于快速检测，但可能他数据进行比较，定其在进化树中位置，而鉴定确从出现假阳性或假阴性结果。③对 P R产物进行限 C样本中可能存在的微生物种类。 制性片段长度多态性 ( eti in f g n e g h r sr t r me tln t co a

2 1基因组 D . NA的获得

首先从微生物样品中直接提取总 D NA,易于对

p lmop i, F P分析，过观察酶切电泳图 oy rhs R L ) ms通谱、数值分析，定微生物基因

的核糖体型，同核确再糖体库中的数据进行比较，析样品中微生物组成分或不同微生物的种属关系。

培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体 R NA。一个典型的细菌含有 1 0~ 2 0 000个 O0 0个核糖体，基而因组 D NA中 rn操纵子 ( r NA序列 ) r即 D的拷贝数相对较少 (核生物一般为 1个~ 1原 O个左右 )因，此，RN在细胞中的含量很高，于获得较多的模 r A易板，是 RNA易于降解， NA的提取技术相对于但 R

3以 1 RNA为基础建立的各种方法及 6Sr其应用细菌培养、疫学方法等虽广泛应用于对病原免菌的检测，但都存在一定的不足，所需时间长、如敏感度低等。随着分子生物学及基因诊断技术的进

DNA的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总DNA,也可根据情况选择提取 r但 RNA。由于

步，分子水平检测微生物，在为感染性疾病诊断提供了新的检测手段。1 R 6 Sr NA为所有细菌共有，是

r NA在死亡的细胞中很快降解，取 r NA通过 R提 R反转录钓取 1 DNA序列的方法能够区分被检 6Sr测的细胞是否为活体细胞

细菌进化过程中最为保守的基因，些基因序列在有长期进化过程中始终保持稳定，另外，于其在细菌基染色体上存在多个拷贝，已作为标记基因广泛应现用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。以 1 RNA基因为基础， 6Sr建立的 P R、 C套式 P R、 C多重半套式 P R、 T— C以及寡核苷酸探针已应用 C R PR

2 2 1 RNA基因片段的获得。 6Sr过去常常将提取的总 D NA经酶切后克隆到噬菌体中建立 D NA库，一步通过 1 R进 6Sr NA通用探针进行杂交，选含有 1 D筛 6Sr NA序列的克隆 (鸟枪法)。由于 P R技术的产生和发展， C现在一般采用 1 R 6Sr NA引物 P R扩增总 D C NA中的 r RNA

于临床细菌的鉴定，列分析，菌的分子分类，序细确定系统发育等]。

序列，或通过反转录 P

R获得互补 C r NA序列后 C D再进行分析。采用 P R技术的优点在于不仅一次 C性从混合 D NA或 R NA样品中扩增出 1 R 6 Sr NA

Grie e n等设计了细菌共同引物对 16种菌株 s 7进行 1 RN基因高度保守序列 P R,获阳性 6Sr A C均结果。以 1 RNA的基因片段作探针， 6sr检测其在

序列，而且方便了后面的克隆和测序但也同样会出现 P R所固有的缺点， C尤其是采用 1 NA保 6Sr R守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩嗜性现象，响结果的分析。影

不同霍乱弧菌菌株中由于染色体 D A序列的变异 N而致杂交谱带差异的分子流行病学方法也有很多应用。以 1 RN的基因片段作探针对霍乱弧菌 6sr A

部分菌株 (括 E包 VC流行株和 VC 3 ) O 1 9进行了 l 6增，可能出现嵌合产物 ( h r rd c) C i i pout和扩增偏 Sr NA基因分型[。细菌 1 R me c R 8] 6Sr NA基因兼有保

守性和变异性，同志勇等建立了多重半套式聚合 2 3通过 1 RNA基因片段分析对微生酶链扩增 ( h pe smi e td P R) . 6S r mu ilx e se C的方法，脑 n对物进行分类鉴定脊液标本中细菌的感染进行检测。以 1 R 6sr NA

1 N 6 r A基因片段的分析方法主要包括以下作为引物， sR利用 P R技术来诊断麻风病， 2纪 C在 O世

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刘文强等：6 RN 1 Sr A在细菌分类鉴定研究中的应用

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往 9年代初期开始出现在国外有关杂志中。熊俊浩些可能含有相同或相似序列的菌种或亚种，往需 O等利用麻风分支杆菌的特异性分子片段 1 R 6S r NA P R诊断麻风病的特异性方面进行研究。吴雪琼 C等发现 1 RNA基因 1 32 5位核苷酸附近是原 6Sr 2 7

测序才能鉴定，就限制了其应用于临床快速鉴定这Sr NA设计的检测方案主要是： R将两条引物设计

作引物，用 P R技术， 1 R采 C对 6 S r NA分子片段病原菌的广泛性。为解决以上问题，内外利用 1国 6

在保守区成为通用

引物，而在中间的特异区中选择

6S r NA序核生物高度变异的区域，通过 P R S C C S P方法分析序列做探针进行进一步鉴定。由于 l R

分支杆菌 1 RNA基因片段， 6Sr根据其电泳图谱与列的保守性和存在的普遍性，及核酸序列本身的以标准株的相似性进行菌种的初步鉴定。用 1 稳定性， 6S序列分析的重现性极高，于当今分析技术基 r NA并结合限制性内切酶消化，得的限制性片 R获的改进，用 1 R应 6S r NA作为分子指标，以实现可段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析。从快速、量、微准确简便的对微生物进行分类鉴定。分 2 O世纪 7 O年代开始， ee和他的同事们用 1 子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随 Wo s 6S r NA寡核苷酸序列分析技术对 4 0多株原核生物 R 0着分子分类的理论和方法的日趋成熟，已逐步成其和真核生物进行分析。以细菌特异的引物扩增 1 为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力的 6S

r NA, R构建质粒文库，限制性内切酶消化获得 1工具。1 N基因 P R扩增与计算机分析相用 6 6Sr A R CS r NA基因型， R用基因型的种类及频率对细菌进结合已被证明是鉴定病原菌快速、效、确的方有准

行鉴定。刘文强等[对奶牛链球菌、萄球菌法，加上生物芯片的不断开发，信感染性疾病病 葡再相和附红细胞体的 1 R 6S r NA进行了 P R扩增和序原菌的检测将迈上更高的台阶。 C

列分析，并应用于相应疾病的诊断。

参考文献：1 3 C i Arhmb ut,Gye ,t .Moeua eei - a H Y, e a a lM 1 lsC L e 1 a lclr nt g cm eh d nt ee ia yciia a troo ylb r tr t o si hev t rn r l c lb ceilg a o ao y,c r n u—

4问题和展望环境中的细菌无处不在，以在试验中如何控所制细菌污染是一个关键问题。通过各个环节的严格无菌操作，择恰当的扩增循环次数， NA提取、选 D扩增和产物分析的隔离

措施，以及使用一次性吸头等， 可提高诊断的正确性和可靠性。一般 P R通常仅 C对特定病原体进行检测，在病原体未明时，而需用多种不同引物对多种病原微生物分别进行 P R扩增， C 往往费时费力，临床上根本不可能用 P R逐一探而 C测每种可能的病原菌来判断感染的病因，得 P R使 C 技术在临床病原体检测中的应用受到了限制。核糖体r RNA对所有生物的生存都是必不可少的。其中 1 R 6Sr NA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“子化石”同时其保守性又是分，相对的，在保守区之间存在着 9个~ 1 O个变异区

rn sg n tr p lain[] etuaea df uea pi t s J.Ant at e v u c o i HelhR sRe, a2 0, () 7—3 04 4 2 l39 .

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谧，云波.1 RNA在海洋微生物系统分子张 6Sr

分类鉴定及分子检测中的应用[]海洋水产研究，0 2 2 J. 20, 3( )l7 6 . 1 5 3

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[] C ot d . 0 5 4 ( ) 5 259 J. ra Mc 2 0, 6 4 l2-2 . J [] No e F,Hon .Th 0 b sma P s eafnt no 4 U rH a gL e3S r oo l i l u ci f i t o 1 RNA[] F er k K F B et 0 5 7 ( ) 5— 6S r J . rd i E S L t,20,5 9 4 l 5 c 88 8 5.

[] JnsnP H.d ni igt ed mia tsib ceila ai l 5 a se Ie tyn h o n n ol atr x n i f at—

bai f 6Sr NA a d 6Sr N ee[￣ 2 0,2 3 l rr s eo 1 R n A gn sJ . 0 6 7 ( ) 1 R1 1 - 7 8 7 912 .

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菌 1 N 6Sr A的 P RR L分析[] R C -F P J.微生物学报，0 0 4 ( ) 575 2 2 0, 6。—7 . 0 6 []李志岗， 7杨官品.水环境细菌 1 N 6Sr A限制性片段长度多态 R性及群落结构分析[]水生生物学报 .0 12 () 1 1 1 . J. 20 .52 z1— 4 1[] S k mooM,UmeaM,B n oY . lc lr n ls f u 8 aa t d en J Moeua a io— a ys h ma r co it[] P r d na Re,2 0,4 ( ) 7 - noa mi boa J . e o o t s 0 5 0 3 I 7 l r i l 22 5 8.

( 1 1)不同细菌的科、、 V~V o,属种间都有不同程度的差异， 1 R故 6Sr NA既可以作为细菌分类的标志，可作为临床病原菌检测和鉴定的靶分子。以又细菌核糖体 l R 6Sr NA基因为靶分子的 P R, C可早期判断细菌感染的存在，通过对扩增产物的进一并

步分析对病原菌的种属作出鉴定，弥补了以上不足， 是感染性疾病诊断的一个重要突破口，已成为国并内外细菌学家的主要研究方向之一。但是由于 1 6S r NA基因内所含的多态性位点较少， R即使与 S C SP或 RF P分析相结合，只能将细菌鉴定至种。一 L也

[]日志男， 9王斌，维奇， .重半套式聚合酶链反应检测脑苏等多

脊液中细菌 1 N 6S R A基因[]中华微生物学和免疫学杂志， r J.2 0, 1 4:3 6 0 1 2 () 7 .

[ 0刘文强，玉萍，宏坤，利用半套式 P R扩增 1 1]贾赵等. C 6S r A基因快速检测牛和猪附红细胞体[]中国兽医学报， RN J.2 0。 6( ) 622 4 0 6 2 3 2— 6 .

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动物医学进展 .0 6 2 ( 1:82 2 0, 7 1 ) 1— 1Pr gr s n Ve e i r e cne o e si t rna y M dii

猪圆环病毒感染的病理组织学和致病机理研究进展尹业师，伟坚，黄陈琼，海鹏，丽华，建远刘谢冯(广西大学动物科技学院，广西南宁 5 0 0 ) 3 0 5

中图分类号：8 8 2; 82 6 9 2￥ 5 . 8￥ 5 . 5 .

文献标识码： A

文章

编号：0 75 3 ( 0 6 1—0 80 1 0—0 8 2 0 ) 10 1—4

摘要：近年来，管国内外学者在猪圆环病尽 (C一) H rig 96 P V 2是 ad 9年首次从断奶后仔猪多系 n1 毒的研究方面取得了不小成就，到目前为但 统衰竭综合征( Mws猪中鉴定出来的病毒，目 P )但 止，仍还没有找到有效的A法和措施来控制 - 前回顾性抗体调查证明Ⅲ,C -感染猪的历史至 P V2 猪圆环病毒对养猪业的危害。文章对猪圆环病毒的病理组织学和致病机理进行综述，以便能进一步了解猪圆环病毒感染的正确诊断少已经历了 3年。近年来的研究表明， O多采用间接

免疫过氧化物酶测定 (P ) IMA和单克隆抗体竞争性E IA, 1 6 LS从 99年以后存档的血清中检测出 P V- C 2抗体。而且 P MW S也并不是第一次发生，Ti h r s e c

技术，为有效防控猪圆环病毒感染提供科学 等证实，西班牙、格兰 1 8就已有 P在英 9 6年 MWS,的参考依据但由于当时没有引起相关人员的注意，到 19直 97年关键词：圆环病毒 2型；理组织学；病 Cak才首次报道 P猪病致 l r MWS在加拿大的发生，命名并机理

为断奶仔猪多系统衰竭综合征 ( ot aigmut P s- nn l— we i

猪圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属的成员之 sse cwat gsn rmeP ytmi si y do, MW S。P V-与 n ) C 2除一，

它是一种小而无囊膜， 2呈 0面体对称，共价闭 P MWS相关外，与临床上很多疾病有关，繁殖还如障碍、呼吸道综合症、增生和坏死性肺炎、仔猪先天皮炎、死性淋巴结炎等。由于 P V-坏 C 2对外界环境

合，状单股 D环 NA病毒，毒粒子直径平均为 1病 7其致病性的不同，为非致病性圆环病毒 ( C 1分 P V- )

n是目 m,前兽医学上发现的最小的动物病毒。根据性震颤、猪皮炎肾病综合症、生性肠炎、增渗出性表和致病性圆环病毒 ( C 2。非致病性圆环病毒 P V一) (C 1是德国学者 T sh r 17 P v-) ice于 9 4年在多株连续传代的 P 1 K一5细胞中发现并于 1 8 9 2年鉴定的一种

的抵抗力

较强， p 的酸性环境中可存活很长时在 H3 间，在高温环境 ( 2℃)能存活一段时间，以 7也所P V一在世界各地的感染率都比较高。 C 2在亚洲、欧

新病毒，名为猪圆环病毒致病性圆环病毒命收稿日期：0 60一I 2 0— 7I基金项目：西科学研宛与技术开发项目(科攻 0 3 0 83和桂科攻 0 30 2 1广桂 57 0— 5720)

作者简介：尹业师( 9 2,湖南邵阳人， 1 8~)男，硕士研究生。主要从事动物传染病与分子病毒学研兜。 *通讯作者秆 常唯帝常秆许{唯许唯带错唯唯常唯帝 书唯咕咔 母牛帝咔带啼 许啼廿竹许带咔帝话帝谁讲译带诺 错帮谁秆惜常常常

Pr g e s0 d ntfc to a a sfc to o r s n l e i a in nd Cls i a in i i

o ce i y M e n s d Ol1 RNA fBa tra b a sBa e i S r 6L U e— in J A— i g,ZHA0 n - u。 I W n qa g,I Yup n。 Ho g k n( .。ig fAg i ut r l ce c fL a c e g Un v ri L a c e S a d n 2￣ 5, h n I 1C l e e o rc l a in eo i oh n ie st i o h n, h n o g。 5 0 9 C i a u S y,

2 Colg fLieS ineo h n o g U iest Jnn S a d n 2 2 O。 hn . leeo f cec fS a d n nvri y, ia, h n og,5 1 0 C ia3C l g o l e fAn ma ce c n trn r d c e S a d n e o i lS i e d n a e i a y Me ii, h n o gAg iu tr l i e s y, aa S a d n 7 0 8^n ) n rc l a v ri - Jn, h n o g 2 1 1 .c ia u Un t r

Ab t a t 1 RNA e e i wi l s d t ls i n e tf fb c e i e a s fis s e i l e u n ei sr c: 6 S r g n s l y u e o ca sy a d i n i o a t ra b c u e o p ca q e c d d y t s n

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Ke r s 1 RNA; a tra;d n iiain; ls iia in ywo d: S r 6 b ce i ie tf t c o ca sfc t o

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