课程论文

基于基因组测序的微生物次级代谢产物的发现

摘要

微生物次生代谢产物是新农药、新医药等功能性化学品的重要来源。经过半个多世纪的研究和开发，传统陆地微生物刺激代谢物资源已经挖掘殆尽。随着基因测序技术的发展，微生物基因组也在不断被解密，并发现了大量的具有潜在生物合成作用的沉默基因，激活这些基因，将会获得许多新颖有用的天然产物。通过基因组测序技术发掘微生物沉默的生物合成基因簇，再利用异源表达、基因敲除、调节基因过表达或阻断、核糖体工程、表观遗传学及单菌多次级产物策略等方法激活沉默的次级代谢产物合成基因簇，是进一步构建新结构次级代谢产物的方向。

关键词：微生物；次级代谢产物；基因组测序；沉默基因簇

微生物产生的次级代谢产物有着多种多样的生物活性，可作为抗癌药、抗寄生虫药、消炎药、除草剂、饲料添加剂、免疫抑制剂等等，在人类健康、病虫害防治以及食品安全方面发挥着重要作用[1]。自弗莱明发现青霉素以来，人类真正开始有目的地从微生物中筛选微生物次生代谢产物，进行药物的研究与开发，至今已从微生物中发现了2万多个具有生物活性的微生物次生代谢产物[2]，目前临床上使用的60%的抗癌药物和70%的抗生素是微生物次级代谢产物或者基于其研发的药物[3]。然而，随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。

近年来，新的生物新技术方法的应用彻底改变了传统的依靠单纯天然微生物培养的天然产物筛选模式。大规模基因组测序技术的推广, 增进了对微生物天然产物基因水平的认识。随着基因组测序技术的快速发展和微生物基因组规模测序项目的广泛开展，为发现新的微生物次级代谢产物提供了技术与信息保障。随着研究的不断深入，微生物基因组中存在的许多未被发掘的沉默途径被发现，研究表明其所具有的新活性次级代谢产物的合成潜力远远超过已发现的代谢产物数量，如何激活这些沉默途径，获得结构多样的代谢产物已成为当前研究中重要的问题。生物信息学分析是目前发现新型天然产物快速有效的方法，特别是进入基因组时代，越来越多微生物基因组测序的完成将增强对这些微生物遗传背景的了解，进而可以充分发掘微生物合成天然产物的潜力，从而对沉默生物合成基因簇的发掘起到关键的作用。本文将主要介绍基于基因组测序的基因簇的发现策略和沉默基因簇的激活途径及其研究进展。

1. 基于基因组测序的基因簇的发现

通过基因组测序获得的大量生物学信息，分析微生物的次级代谢潜能，利用生物信息学预测出可能产生次级代谢产物的沉默生物合成基因簇，进而预测产物大概的理化性质，然后对基因簇进行活化或者异源表达，最终分离并鉴定目的产物。目前比较清楚的是聚酮类（polyketides）和非核糖体肽类（non-ribosomal peptides）次级代谢产物，它们均由组装成模块的多酶复合体PKS/NRPS所催化，且常与调节基因和抗性基因成簇，所以通过对PKS/NRPS中结构域的分析，可预测新聚酮和非核糖体多肽的大致化学结构[4]。通过基因敲除或采用异源表达等多种方式，促使“沉默”的基因簇得到表达，最终获得新的天然产物，利用这种方法目的性比较强，获得的大多是新化合物，可以减少对已知化合物研究的浪费。

随着基因组测序技术的提高和成本的降低，越来越多的微生物中次级代谢生物合成基因

簇及其相关的新产物将会陆续被发现。多黏菌素是一种具有抑制多种耐药革兰氏阴性致病菌潜能的重要多肽抗生素, Choi等对Paenibacillus polymyxaE681 菌株进行了全基因测序, 确认了多黏菌素的合成基因簇[5]。Udwary等对海洋放线菌Salinisporatropica菌株CNB-440进行了全基因测序，鉴定出了大量的次级代谢合成基因簇，除获得了几条编码聚酮合成酶(Polyketide synthase，PKS)、非核糖体多肽合成酶(Non- ribosomal peptide synthetase，NRPS)途径的基因簇外，还鉴定出强效抗癌药剂salinosporamide A的合成基因簇sal[6]。杨慧林等[7]对一株对细菌和真菌都具有较强抗菌活性的东乡野生稻内生放线菌新种PRh5进行了全基因组测序，并对该菌株的次级代谢产物合成基因簇进行预测，共预测得到50个次级代谢产物合成基因簇，同时发现PRh5的尼日利亚菌素生物合成基因簇多出两个基因，推测可能是导致PRh5高产且分泌表达尼日利亚菌素的原因。 2. 沉默基因簇的激活途径

通过对产生已知抗生素的微生物菌株的基因组序列的分析，研究者发现，其中存在的与微生物次级代谢产物生物合成的基因簇的数量比其所产生的次级代谢产物要多得多[8]，大多数生物合成基因簇在常规培养条件下不表达或表达很低，仅在特定条件下被激活并表达天然产物，这些基因簇被称为沉默生物合成基因簇[9]。这些基因簇中包含了多种结构类型的微生物次级代谢产物编码信息，可提供丰富的合成生物学天然元件或模块，并可为未来设计和构建新型微生物次级代谢产物提供丰富的物质基础。1980年，Hopwood[10]提出激活沉默基因簇合成新的活性物质，为发掘新型次级代谢产物开辟了一条新的道路。随着基因组测序技术的快速发展，许多微生物的基因序列被逐渐掌握，从而可以更好地利用基因工程技术调控基因的表达，通过异源表达在非同源宿主中表达完整的基因簇、基因敲除改变沉默基因簇的调控基因、改变细胞间转录条件、改变蛋白质合成机制等方法实现沉默基因簇的激活，以发现更多的新型微生物次级代谢产物。基于微生物基因组信息，根据微生物次级代谢调控的途径特异性对沉默次级代谢基因簇进行定向激活，不但可以发现一些通过常规方法不能获得的新型化合物，而且为新型天然产物的研发提供了具有一定应用价值的先导化合物，为微生物次生代谢物多样性的研究及开拓微生物新资源提供了新的策略。 2.1. 异源表达

通过基因工程技术，将目的生物合成基因簇转移至不同的异源宿主中表达，不仅能够激活沉默的生物合成基因簇，而且可将异源表达体系作为一个非常有用的工具通过组合生物合成生产更多结构新颖、功能独特的化合物。基因簇的异源表达就是将整个沉默生物合成基因簇克隆至质粒、黏粒或者细菌人工染色体上，利用异源宿主表达，然后通过对含有该克隆质粒的表达宿主以及对照宿主的发酵液进行分析，最终完成对新代谢产物的分离、纯化与结构鉴定[11]。异源表达技术使得沉默基因在新的表达系统中无需原来的调控元素，对培养条件也无特殊要求，可克服天然生产菌株表达水平低、遗传操作困难、不容易规模培养等缺点，为工业化生产扫清障碍。

生物合成基因簇在异源宿主中的功能性表达并非一件易事，在异源宿主的选择上受到诸多因素的制约：生物合成基因簇与异源宿主基因组的GC含量、密码子使用频率的相似度；异源宿主在适宜时间内能否提供适宜的特异性底物（辅酶A激活的小分子羧酸和氨基酸等）；含有激活多酶复合体（PKS、NPRS）的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶系统；异源宿主是否含有相应的自身抗性机制以对抗该化合物对宿主菌产生的毒性。因此，目前仅有几种菌株被认为有可能发展成为良好的异源表达宿主，如链霉菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌和黄色粘球菌等[12]。将含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵茵红素产量提高,表明大肠杆菌ace基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成，并提高已有抗生素产量[13]。Müller研究小组[14]从橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)粘粒文库中分离出myxochromide S生物合成基因簇，并通过Red/ET重组技术在大肠埃希菌

中对其进行再构建及添加基因转移和异源表达所必需的基因元件，并将约60kb的myxochromide S生物合成基因簇整合至恶臭假单胞菌染色体上，重组菌株的产量高达40mg/L，是原始菌株的5倍高。 2.2. 基因敲除

在完成了对各种微生物基因组的测序以后，基因功能的研究变得尤为重要，研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活，基因敲除技术为此提供了有力支持。基因敲除是将位于沉默生物合成基因簇内的某个调控基因阻断，然后利用液质联用的方法分析突变株和野生株的发酵液代谢产物谱，仅在野生株中表达的代谢产物有可能是沉代谢途径所合成的产物，对该代谢产物进行分离、纯化和结构鉴定以确定其是否为新型天然产物[15]。Song 等[16] 用阿普霉素抗性基因替换天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中的Gcs(sco7221ORF)基因对野生株和阻断株的发酵液进行对比，发现了5种次级代谢产物，其中isogermicidin A、isogermicidin B和germicidin C为3 种新型天然产物。微生物基因敲除技术在农业方面有着广泛的应用，尤其是在农用抗生素生物合成相关基因方面的应用。阿维菌素是迄今发现的最有效的杀虫剂之一，对其生物合成相关基因功能的研究，有利于生物合成途径的明确，这使得人们可阻断特定基因表达构建新型菌株，以增加有效组分及新型的抗生素的产出，还可通过化学修饰的方法来提高阿维菌活性[17]。 2.3. 调节基因的过表达或阻断

微生物沉默基因簇中正调节基因，是控制次级代谢产物生物合成的开关，组成型表达或过表达同源正调控基因，使相关正转录因子过表达，从而诱导沉默基因簇的激活，合成新的次级代谢产物。黄凯等[18]利用苏云金芽胞杆菌野生株YBT-881,构建了过表达CodY蛋白的基因工程菌YBT-881-L1,结果野生株中沉默的cry2Ac4基因在工程菌中被激活,并产生大量的Cry2Ac4蛋白。同时，沉默基因簇的表达也受到负调控基因的调控，阻断负调节基因也可实现沉默基因簇的激活。nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因，余贞等[19]根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物,扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77%~100%，其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA序列100%一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素,中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中重新引入野生型nsdA,又失去产抗生素能力，因此表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达。

2.4. 核糖体工程

核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA 聚合酶进行修饰和改造，引入特定的点突变或缺失突变，带来其结构和功能上的改变，进而激活次级代谢产物生物合成基因簇，最终导致次级代谢产物的过量表达或新的产物合成[20]。Shima等人[21]发现在变铅青链霉菌TK24 Str-6 的突变体中，由于其核糖体S12 蛋白中第88 位的Lys 被Glu替代(即K88E 突变) 从而产生放线紫红素(act)，而这种抗生素在野生型菌株中是不产生的，推测是核糖体结构的变化，激活了其相关沉默基因，从而能够使其表达产生放线紫红素。 2.5. 表观遗传学方法

表观遗传指DNA序列不发生变化，而基因表达发生可遗传改变的现象。表观遗传学通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA作用等方式改变基因的表达或沉默。表观遗传变异是环境和细胞内遗传物质间相互作用的结果，其效应通过调节基因表达，控制生物学表型来实现[22]。高婕等[23]利用变铅青链霉菌的DNA无甲基化修饰这一特点,将大肠杆菌dcm基因导入变铅青链霉菌,研究了5-甲基胞嘧啶修饰在变铅青链霉菌中的功能。结果发现,DNA的5-甲基胞嘧啶修饰不仅可影响变铅青链霉菌的形态和生理分化,而且还能激活放线紫红素沉默

基因的表达。丝状真菌产生的次级代谢产物是新药的重要来源之一，其生物合成过程受到众多因素的调控。研究表明，表观遗传对多种丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用。DNA 和组蛋白的甲基化与乙酰化修饰是目前所知的丝状真菌主要的表观遗传调控形式。周锐[24]等研究发现通过过表达或缺失相关表观修饰基因和利用小分子表观遗传试剂改变丝状真菌染色体的修饰形式，不仅可以提高多种已知次级代谢产物产量，而且可以通过激活沉默的生物合成基因簇诱导丝状真菌产生新型次级代谢产物。 2.6. 单菌多次级代谢产物(OSMAC) 策略

运用传统单一的培养方法,微生物中大量的代谢途径不能被表达,以至于许多代谢产物不能产生。因此,运用各种技术和方法激活这些沉默途径,获得结构多样的代谢产物已成为目前关注的热点。单菌多次级代谢产物（OSMAC）策略作为一种简便有效的研究手段,已成功应用于该领域的研究。OSMAC强调通过不断改变培养基成分、培养条件、共培养及添加酶抑制剂等方法，激活微生物沉默的生物合成基因簇，尽可能挖掘微生物合成次级代谢产物的能力，从而获得更多结构类型的次级代谢产物[25]。Hans等[26]通过改变培养瓶及通气条件，从链霉菌属Go40 /10 菌株的代谢产物中分离得到一系列化合物，并证明由于培养基的改变，之前沉默的生物合成基因簇被打开，出现了新的合成路径。Cichewicz等[27]人使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂suberoylanilidehydroxamic acid( SAHA) 干扰菌株Cladosporiumcladosporioides的正常生长，结果使其代谢产物发生根本性的改变，并得到了2 个全新的化合物cladochromes F和G。OSMAC策略就是一系列的激活沉默基因的方法，随着基因组学以及生合成路线研究的深入，有明确目标的OSMAC策略必将为药物前体化合物的开发提供有力的支持。 3. 结语

微生物次级代谢产物在人类健康、农作物病虫防害等方面一直发挥着重要作用，但是仅依靠传统的筛选技术所发掘的天然产物越来越不能满足人类的需要，这使得微生物来源天然药物的开发遇到了严重的技术瓶颈。然而，随着基因组测序技术的快速发展，逐渐地突破了传统技术的缺陷。同时基因工程技术、生物信息学、蛋白质工程和代谢工程等生物技术的兴起，为微生物次级代谢产物的发现带来了一场新的革命。基因组测序技术的广泛应用，使得越来越多的微生物的生物信息被掌握，大量未知的次级代谢生物合成基因簇将被发现，通过各种有效的激活沉默基因簇的手段将发掘更多的新型天然产物。发现与激活微生物沉默基因簇将是发现新型次级代谢产物的重要方向之一，因此要合理高效的利用各种激活方法，实现新型产物发掘的最大化。在新兴生物技术的推动下，越来越多的方法被发明以及改善，沉默的生物合成途径将会成为新药开发的宝贵资源，新型天然产物的发现将迎来广阔的前景,这将促进人类医疗和农业防害等方面的突破性发展。

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