基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

生物技术通报

技术与方法

ＢＩｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ

ＢＵＬＬＥＴｌＮ

２０１１年第５期

基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌

基因功能组学研究中的应用

冀颖

李梅蒋细良

（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京ｌＯ００８１）

摘要：随着丝状真茵模式生物基因组测序工作的进行，其提供的大量未知功能的基因序列，为研究丝状真菌的基因

功能开辟了新的方向，并已成为生命科学领域研究的热点。对基因功能研究中最新的两种方法——基因打靶和ＲＮＡｉ技术的原理、技术路线和特点以及应用情况进行综述。

关键词：

功能基因组学

基因打靶

ＲＮＡｉ融合ＰＣＲ

ＡＴＭＴ

ＡｐｐＩｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＲＮＡｉｉｎ

ＦｕｎｇｕｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ

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随着大量丝状真菌基因序列信息的测定，以基因功能鉴定为目标的功能基因组学已经成为目前生命科学领域研究的热点。转基因、基因打靶和ＲＮＡ干扰等反向遗传学技术是系统地分析基因的功能、基因间的相互作用、基因组的时空表达以及发现和寻找新的功能基因的有效方法。其中基因打靶、ＲＮＡ干扰技术能够有效和特异性地抑制目标基因的表达，操作简单易行，故在基因功能研究中应用十分广泛。

构已知功能未知的基因，从分子水平设计试验，将该基因去除或者用其他序列相似的基因取代，从而定点突变靶基因，最后从整体观察目标生物，推测相应基因的功能。

１．１基因打靶技术的原理

此技术主要是应用同源重组（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ

ｒｅ．

ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）原理，将转染的ＤＮＡ与细胞内的靶基因进行同源交换，以改变靶序列，从而研究其结构与功能或者进行基因治疗。应用此技术可以在分子水平上将目标基因进行定向修饰包括基因灭活、引入点突变、缺失突变和插入外源片段等，并将修饰后的遗传信息在生物体内表达，从而通过表型的变

１基因打靶技术

基因打靶技术是２０世纪８０年代末发展起来的一种新型的研究基因功能的技术。它是指对一个结

收稿日期：２０１０．Ｉｌ—１８

基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１４００），国家支撑项目（２００６ＡＤ０８Ａ０２），国家高技术研究发展计划（２００６ＡＡｌ０Ａ２１１），中国农业科学院

植物保护研究所基本科研业务费专项（２０ｌＯ－１５），植物病害生物学国家重点实验室开放基金（ＳＫＬ２０１００Ｐ１７）作者简介：冀颖，女，硕士研究生，研究方向：微生物学；Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｌ９８６０３１９＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：蒋细良，男，研究员。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘＵｉａｎｇ＠ｃＭ８．ｎｅＬ

ｃｎ

万方数据

２０１１年第５期

冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

６５

化揭示目标基因的功能。１．２基因打靶技术的技术路线

１９８５年，首次证实在哺乳动物细胞中存在基因同源重组，为基因敲除技术的创立奠定了理论基础。１９８７年，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ等…成功地构建了动物一小鼠敲除模型，为基因敲除技术的应用奠定了实践基础。近２０年来，此项技术已经由在酵母和哺乳动物中的应用，拓展到了植物、真菌基因功能的研究中。其大致要包括构建载体、真菌转化、筛选突变体和分析表型等步骤。

１．２．１

构建打靶载体打靶载体由３部分组成，包

括两端与靶基因两侧同源的同源臂序列以及中间的选择性标记序列。

真菌中打靶载体的选择标记，通常采用营养选择性标记基因如ｐｙｒ４、ａｒｇＢ、ｔｒｐｃ和ａｍｄｓ等，以形成互补受体菌的营养缺陷型。由于工业丝状真菌中相应营养缺陷型作宿主很难获得，因此后来又开发出显性选择标记，主要是抗生素标记基因，典型的如潮霉素、新霉素或腐草霉素和氨基糖苷类抗生素Ｇ４１８等旧。，携带此类抗性基因的质粒均可转化到真菌中，并表现出选择性抗性。此外，对化合物苯菌灵显示抗性的一些Ｂ．微管蛋白突变基因，绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）近年来也被作为报告基因在丝状真菌基因工程中得以应用旧－。

通过基因重组进行基因敲除要求已知靶基因两侧的侧翼序列，但不同生物中所要求的侧翼序列长度不同。在酵母菌中，仅需要５０ｂｐ的同源臂序列，就可以完成与目标基因的融合；但对丝状真菌而言，则通常需要至少５００一１

０００

ｂｐＨｌ。这就要求将同

源臂序列与抗性基因序列融合的过程中，根据所需要的靶序列的长度，采用适宜的方法，以提高融合的效率。

早期，人们通常采用多次克隆，纯化等步骤构建基因替换盒。对于背景简单的靶基因而言，这种方法比较实用。但对于丝状真菌而言，要求扩增较长的同源序列，就需要多次克隆步骤，增加了序列扩增中碱基突变的可能性，导致克隆效率降低，因此需要

建立一种简单快速的构建打靶载体的技术——融合

ＰＣＲ技术应运而生。

融合ＰｃＲ又称为双接头ＰｃＲ”’，是一种基于

万方数据

ＰｃＲ技术的高效地构建打靶载体的方法。其原理是采用末端具有反向互补序列的引物进行ＰｃＲ，形

成具有互补链——“尾巴”的序列，从而依赖这段互

补序列，将同源臂序列和抗性基因序列连接起来。这样将省去多次克隆、酶切和连接等复杂的步骤，提高效率。

融合ＰｃＲ技术构建打靶载体通常需要３个连续的ＰＣＲ反应，第一轮ＰＣＲ反应：通常以基因组为模板，分另Ⅱ以５’．Ｆｏｒ。５’．Ｒｅｖ＋ｍａｒｋ．ｔａｉｌ；３’．Ｆｏｒ＋

ｍａｒｋ－ｔａｉｌ，３’－Ｒｅｖ；５

７．ｍａｋｅｒ，３’．ｍａｋｅｒ（图１）为引物进

行扩增得到的ＰＣＲ产物分别为５７．侧翼序列（带有与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），３’．侧翼序列（带有与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），以及选择性标记基因（图２）。经电泳检测后，直接进行第二轮ＰｃＲ：不加任何引物，将５’．侧翼序列，３’．侧翼序列和选择性标记基因以等摩尔数依次加入反应体系中（要求３个片段的ＤＮＡ含量在１００一

１

０００

ｎｇ），进行ＰｃＲ获得３个片段融合的片段（图

２）；第三轮ＰｃＲ：以３’一ｎｅｓｔ；５’－ｎｅｓｔ为引物（图１）进行ＰＣＲ富集３段基因融合的终产物（图２）。终产物可以直接用于连接等后续操作，无需进行纯化。

＋５ＬＦ∞…６二Ｒｅｖ＋ｍａｒｋ一诅ｉｌ…．ｍａｒｋ—ｔａｉｌ＋３：Ｆｏｒ…．３ＬＲｅｖ＋

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图１特异性引物的设计

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图２基因替换盒的构建过程

融合ＰＣＲ法构建打靶载体具有操作简单等优点，但也存在以下几个问题：（１）３个特异性片段（用高保真的死ｇＤＮＡ聚合酶扩增），能否成功地融合关键在于互补序列的长度，一般来讲，互补序列越

生物技术通报Ｂｆ口缸幽ｎＤｚＤ叠ｙ

ＢＨ胁疗ｎ

２０１１年第５期

长，融合成功的机率越大，但同时也会影响特异性片段扩增的准确性，增加特异性引物设计的难度，可以多设计几条末端携带互补序列（长２５—３０个碱基）的特异性引物进行试验，以提高成功率。（２）李敏等”ｏ实验室要求待融合的片段以等摩尔加入进行第二轮ＰＣＲ反应；Ｙｕ¨１实验室采用的是同源臂序列与抗性选择序列之间比例为１：３。笔者认为最重要的是保证各个片段ＤＮＡ的含量为１００—１

０００ｎｇ，

等量加入即可。（３）在第三轮ＰｃＲ反应中采用巢式引物扩增双接头产物，可以提高试验的成功率。

ＹｕＨ

３实验室在敲除构巢曲霉功能基因时曾设计两

对引物进行扩增，发现巢式引物几乎可以１００％获得目的产物。此外，退火温度的选择，延伸时间的设定等也是重要的影响因素。

迄今为止，应用此种方法，已经成功地敲除了３类丝状真菌中的３１个基因。如２００４年，Ｙｕ等”１分别以ａｒｇＢ、ｐｙｒＧ为选择性标记与构巢曲霉、烟曲霉和禾谷镰刀菌中的目标基因的上下游序列相连，成功构建了７个突变体；２００７年，李敏等＂１利用此项技术成功将哈茨木霉中Ｂ一微管蛋白基冈的上下游序列与苯并咪唑抗性基因，潮霉素抗性基因融合在一起，成功地构建了敲除微管蛋白的打靶载体。

另一种基于ＰＣＲ技术的高效地构建打靶载体的方法是引入酶切位点，这种方法被称为连接介导ＰＣＲ。６１。这一方法主要是通过带有特定酶切位点的引物扩增靶基因的两侧序列，将产物回收后，用相同的限制性内切酶酶切，然后在连接酶的作用下将３条片段连接起来，最后用巢式引物扩增整个片段，从而进行后续操作。这样就减少了一次ＰｃＲ反应，但增加了一步酶切一连接反应。这种做法的优点在于减少了反复扩增中产生突变的可能，但是由于酶切一连接的过程中，酶切的效率是一个不确定因素，因此这两种方法各有利弊，在具体试验中可以采用不同的策略，以提高打靶载体构建的成功率。

１．２．２

打靶载体的真菌转化丝状真菌的ＤＮＡ转

化方法，如ｃａｃｌ：／ＰＥＧ介导的原生质体的转化法、基因枪转化法、电穿孑Ｌ转化法、限制酶介（ＲＥＭＩ）的转化法和根癌农杆菌介导（ＡＴＭＴ）的转化法等都已成功用于丝状真菌打靶载体的转化。其中农杆菌介导法同源重组效率较高，故在丝状真菌中应用较为

万方数据

广泛。与其他转化方法相比，ＡＴＭＴ法最大的特点在于真菌受体的选择比较灵活，可以是原生质体、菌丝、孢子或者菌体组织。这样就减少了制备原生质体等复杂的步骤，并且转化效率高，转化子遗传稳定性好，这就为其广泛应用带来了优势。自１９９５年，Ｂｕｎｄｏｃｋ等…首次成功将这一技术应用到酿酒酵母菌的遗传转化以来，到目前为止，已有２０多个种的真菌利用该方法成功地实现了遗传转化¨ｏ。１９９８年，ｄｅＧｒｏｏｔ等。９１首次利用ＡＴＭＴ法对丝状真菌（包

括里氏木霉ｎｉｃ＾ｏｄｅｍⅡＭｅｓ西等）进行转化，发现其

转化效率是ＰＥＧ／ｃａｃｌ：介导的原生质体转化法的６００倍。２００８年，乔建军等¨叫利用ＡＴＭＴ法成功地构建了烟曲霉的尿嘧啶缺陷突变体；龙朝钦等…１成功地构建了烟曲霉几丁质合成酶ｃｈｓＣ基因缺失突变体；马彦等¨２１构建了烟曲霉ｐｂｓ２基因的缺失突变体。虽然ＡＴＭＴ法成功地介导了多种真菌的转化，但是，影响根癌农杆菌介导真菌转化的效率的因素较多，不同根癌农杆菌菌株及不同的双元载体都直接影响着转化的成败。

１．２．３转化子的筛选根据选择性标记，通常是抗生素标记，如潮霉素、新霉素或腐草霉素等，或者营养缺陷型标记，如精氨酸等，对转化子进行筛选，找到假定转化子，然后采用ｓｏｕｔｈｅｍ杂交技术或者ＰｃＲ扩增选择性标记基因的方法进行验证。

１．２．４转化子的表型分析通常采用转化子与野生型对照的方式，观察表型差异，或者检测某些成分的含量变化，最终验证此基因的功能。

１．３

基因敲除的作用特点

基因敲除是以同源重组为理论基础的先进的转基因技术，它克服了随机整合带来的盲目性和偶然性的缺点，具有整合位点确定、精确，转移基因频率较高的优点，在生物体中通过目的基因克隆、序列改造、导人靶载体、同源重组和培育受体细胞等一系列连贯步骤成功地敲除某一基因，通过对表型的分析进而对基因的功能进行研究，为基因功能的分析开辟了一条新的有效途径。但是在基因敲除过程中，如果被破坏的只是染色体中靶基因的某一个或几个外显子而非该基因的整个编码区，残留的编码序列有可能获得新的未知的功能¨３１；而大规模的染色体片段删除导致其他基因的编码区或者调控元件的删

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除，从而造成多基因删除或者死表型¨“，这些将给表型分析带来麻烦。ＲＮＡ干扰技术是从ＲＮＡ水平抑制基因的表达，从而避免了这一问题。

２

ＲＮＡ干扰技术

ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是将与靶

基因的ｍＲＮＡ同源互补的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）导入细胞，特异性地降解该ｍＲＮＡ，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，属于转录后水平的基冈沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ

ｇｅｎｅ

ｓｉｌｅｎｃｅ，ＰＴＧｓ）。

２．１

ＲＮＡ干扰技术的发现

１９９０年，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等【１纠在研究矮牵牛花（ｐ““．

ｎ缸＾ｙ６ｒｉｄ口）转导色素合成基因时首先发现了基因沉默现象。１９９２年，Ｒｏｍａｎｏ等一６ｊ研究粗糙链胞菌

（肫ｕｒｏｓｐｏｒ口ｃｍｓｓ口）时，在真菌中首次发现基因沉默

现象，当时被称为基因的压制（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）现象。１９９５年，Ｇｕｏ和ＫｅｍｐｈｅｕｓⅢｏ在研究秀丽线虫（Ｃ口ｅ—ｎｏ以口６ｄｎ诂ｅＺｅｇ口ｎ５）时也发现了基因沉默现象，并发现注入反义链ＲＮＡ可以阻断ｐａｒ．１基因的表达，但在对照中注入正义链ＲＮＡ也发生了类似的现象，这显然不能用反义ＲＮＡ的作用模式加以解释。直到１９９８年，Ｆｉｒｅ等、１引对基因沉默现象进行深入研究，发现注入与靶基因ｍＲＮＡ同源的双链的ＲＮＡ比单独注入单链ＲＮＡ有更高效的沉默作用，而且发现分别注入负／正义链ＲＮＡ能产生类似现象很可能是由于污染了少量的正／负义链ＲＮＡ。此后，人们将这一现象称为ＲＮＡ干扰。

随后，在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等真核生物中发现都存在基因沉默机制，并有试验表明，ＲＮＡ干扰与植物中的共抑制、真菌中的基因抑制很可能有共同的分子机制。这说明在进化的早期阶段，生物可能就获得了这种机制，并且在对抗病毒的入侵、抑制转座子的活动以及生物体的发育和基因调控等方面都有重要的意义。

随着转基因技术的广泛应用，研究还发现转入的基因可被机体当作外源遗传物质诱导其自身沉默，其机制是通过转录后基因沉默（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃ却

ｔｉｏｎａｌ

ｇｅｎｅ

ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）或共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓ—

ｓｉｏｎ）作用引起同源基因的沉默。”１。这就为人类应用ＲＮＡ干扰技术研究基因功能提供了可能。

万方数据

２．２

ＲＮＡ干扰的作用机制

随着ＲＮＡｉ技术的不断发展，对其分子机制的

研究也一直是热点。随着研究的深入，科学家们对ＲＮＡ干扰的作用机制取得了初步的共识。

ＲＮＡ沉默存在两种既有联系又有区别的途径：

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａＵｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ）途径ｍｉＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏ

ＲＮＡ）途径。前者ＲＮＡ产生干扰作用是以存在与目的基因同源的ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ）为前提的，其作用机制包括两个主要的阶段：ａ起始阶段：加入的ｄｓＲＮＡ被Ｄｉｃｅｒ酶切割为２１—２３ｎｔ的小分子干扰ＲＮＡ片段（ｓｉＲＮＡ）口…．ｂ效应阶段：ｓｉＲＮＡ双链结合一个核酶复合物从而形成所谓ＲＮＡ诱导沉默复合物（ＲＩＳＣ）旧１｜。然后在ＡＴＰ的作用下将ｓｉＲＮＡ双链降解进而激活ＲＩＳｃ。激活后的ＲＩＳＣ通过碱摹互补配对定位到同源ｍＲＮＡ转录本上，并在距离ｓｉＲＮＡ

３

７端１２个碱基的位置切割ｍＲＮＡ，以阻

止ｍＲＮＡ翻译成蛋白质。研究还发现，ｓｉＲＮＡ可作为一种特殊引物，在ＲＮＡ依赖ＲＮＡ聚合酶（ＲｄＲｐ）的作用下以靶ｍＲＮＡ为模板合成ｄｓＲＮＡ，后者可被降解形成新的ｓｉＲＮＡ，同时新生成的ｓｉＲＮＡ又可进入上述循环。这种过程称为随机降解性多聚酶链反

应（ｒａｎｄｏｍｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅＰｃＲ）。新生的ｄｓＲＮＡ反复

合成和降解，不断产生新的ｓｉＲＮＡ使靶ｍＲＮＡ渐进性减少，从而发挥强大的诱导基因沉默现象““”。。而ｍｉＲＮＡ途径是由ｍｉＲＮＡ，即不编码小ＲＮＡ（２ｌ一２４个核昔酸）引发的。不编码小ＲＮＡ是由Ｄｉｃｅｒ酶切割内源性表达的短发夹结构ＲＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎ

ＲＮＡ，

ｈｐＲＮＡ）形成的。ｍｉＲＮＡ同样可以与蛋白因子形成ＲＩｓｃ蛋白复合物，结合并切割特异的ｍＲＮＡ而引发ＲＮＡ沉默‘“１。与前者不同的是ｍｉＲＮＡ途径调节基因表达具有细胞、组织及时空的特异性，故可以更加精确地调控内源基因的表达。随着丝状真菌中ＲＮＡｉ作用机制的研究，发现丝状真菌稻瘟病菌中基因沉默需要两种类似Ｄｉｃｅｒ的蛋白作用∞５｜；构巢曲霉中基因沉默也需要一种依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶（ＲＤＲＰ）的作用旧叫等，这些试验均证明真菌中也存在与线虫、植物中类似的基因沉默机制，但也有试验证明在真菌中存在一些特殊的机制。例如，Ａｒａ．ｍａｙｏ等口川在研究粗糙脉孢菌Ａｓｍ．１基因时还发现一种新的非配对ＤＮＡ介导的减数分裂沉默机制

生物技术通报曰幻抛ｃ．Ｉｌｎｏ肠秽

曰Ｈ№疗肛

２０１１年第５期

（ｍｅｉｏｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙｕｎｐａｉｒｅｄＤＮＡ，ＭｓｕＤ）。随后

ｓｈｉｕ等的研究揭示了ＭｓｕＤ的原理即异宗接合形成的接合子在减数分裂时产生非配对的ＤＮＡ，非配

对的ＤＮＡ转录时产生异常的ＲＮＡ（ａｂｅ眦ｎｔ

ＲＮＡ），

由于这种异常的ＲＮＡ与基因组有同源性，继而也可

介导产生类似作用Ⅲ－。

２．３

ＲＮＡ干扰技术的技术路线

ＲＮＡ干扰技术一般包括以下步骤：根据目的基因设计ｓｉＲＮＡ序列，获得产物ｓｉＲＮＡ，进而将其进行转染，最后进行ＲＮＡｉ效果检测。下面将对其主要步骤进行详细阐明。

２．３．１

设计ｓｉＲＮＡ序列ＲＮＡｉ成功的关键就在于ｓｉＲＮＡ能否与目的ｍＲＮＡ特异地结合并将其有效地分解，因此确保ｓｉＲＮＡ序列高度同源于靶基因而绝不与其他基因同源，是ｓｉＲＮＡ设计的基本原则。目前，设计ｓｉＲＮＡ序列主要有两种方法：根据文献的报道，使用已经确定的ｓｉＲＮＡ序列；也可以根据ｓｉＲ—ＮＡ序列设计软件输入靶基因序列，进行比对后，选择其提供的若干个序列，以筛选特异性较好的序列进行试验。

２．３．２

获得产物ｓｉＲＮＡ目前获得ｓｉＲＮＡ常用的

方法包括以下几种：（１）化学合成法：主要适用于目前已知最有效的ｓｉＲＮＡ，并且需要大量ｓｉＲＮＡ进行研究的情况。（２）体外转录法：利用盯ＲＮＡ聚合酶体外转录ＤＮＡ，直接产生小片段的ｄｓＲＮＡ，然后使用Ｄｉｃｅｒ酶消化，产生短的ｓｉＲＮＡ。此法主要用于筛选ｓｉＲＮＡｓ，特别是需要制备多种ｓｉＲＮＡｓ。（３）长片段ｄｓＲＮＡｓ酶解法：以２００一ｌ０００个碱基的靶ｍＲ—ＮＡ为模板，用体外转录的方法制备长片段双链ｄｓＲＮＡ，然后用ＲＮａｓｅＩＩＩ／Ｄｉｃｅｒ酶在体外消化得到ｓｉＲＮＡｓ混合物。由于含有不同的ｓｉＲＮＡｓ，通常能够保证目的基因被有效地抑制，提高了成功率，故目前应用较多。此法适用于重点研究某个基因功能的缺失。（４）ｓｉＲＮＡ表达载体法：使用质粒载体或者病毒载体合成。前者首先要合成具有发卡结构的ＤＮＡ，构建到含有ｕ６或Ｈ１启动子的质粒中，将之转入细胞，在下游启动子的作用下转录生ｓｉＲＮＡ；后者主要是在病毒骨架上进行转录。目前成功的有通过构建表达ｄｓＲＮＡ的载体ＰＴｚＵ６＋１，ＰＴｚｕ６＋２１等进行转染，具有稳定性高等优点。此法主要适用

万方数据

于已知一个有效的ｓｉＲＮＡ序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达ｓｉＲＮＡ的细胞的情况。这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达。（５）ＰＣＲ方法构建ｓｉＲ—ＮＡ表达框架（ｓｉＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓ，ｓＥｃｓ）：应用ＰｃＲ法构建含有特定的启动子和终止子及靶序列的表达元件，之后转染入细胞中使得ｓｉＲＮＡ进行表达。此法适用于筛选ｓｉＲＮＡ序列或在克隆到载体前筛选最佳启动子。

２．３．３

ｓｉＲＮＡ转染将足量的ｓｉＲＮＡ转染入细胞

是决定ＲＮＡｉ成败的又一关键步骤。在转染的过程中有以下几点需要注意：（１）针对不同的靶细胞类型，选择不同的转染试剂并优化转染步骤，对ｓｉＲＮＡ试验的成功至关重要。尽量选择专门针对ｓｉＲＮＡ的高效、低毒转染试剂；（２）同时设置阳性对照以确认整个试验体系的有效性，阴性对照以排除非特异沉默现象；（３）由于ｓｉＲＮＡ的纯度直接关系到转染效率和沉默效率，故ｓｉＲＮＡ转染需要选用高纯度的

ｓｉＲＮＡ。

２．３．４

ＲＮＡｉ效果检测ＲＮＡｉ的效果可从ｍＲＮＡ

和蛋白质两方面进行分析。ｍＲＮＡ水平：应用ＲＴ—ＰｃＲ、定量ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交等方法检测ｍＲＮＡ的转录水平；蛋白质水平：应用Ｗｅｓｔｅｍ杂交、ＥＬＩＳＡ和免疫荧光等方法检测蛋白表达量。此外，细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数的变化也是ＲＮＡｉ效果最终和最大的体现。

２．４

ＲＮＡｉ技术的特点

ＲＮＡ干扰技术本身具有以下特点：（１）由于ｓｉＲＮＡ序列作用的范围比较大，２１—２３ｎｔ中任何一个核苷酸的改变，都会影响ｓｉＲＮＡ对靶标ｍＲＮＡ的作用，故可应用于抑制单个核苷酸突变的基因表达。（２）试验周期短，一般抑制靶基因表达４８ｈ后就可以对其生物学现象进行分析。（３）只有针对编码区的ｄｓＲＮＡ才能产生有效和特异性地干涉，针对内含子区域的ｄｓＲＮＡ序列则不能产生，并且选择靶序列应避免高度同源序列之间的交叉干扰，故ＲＮＡｉ的靶序列需慎重选择。（４）ＲＮＡｉ的效率还受到ｄｓＲ．ＮＡ的长度的影响嵋…。

此外，与基因敲除相比，将ＲＮＡ干扰技术应用

２０１１年第５期冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

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于丝状真菌基因功能的研究，还有以下优势：（１）ＲＮＡ干扰是在ｍＲＮＡ水平上起作用，这样基因沉默的成功率将不受多合体中多拷贝基因或非转化核苷酸的影响。（２）对于一些看家基因，如果直接突变将会造成致死性，但通过ＲＮＡ干扰技术下调其启动子的表达来达到抑制此基因表达的作用就可以避免这一缺陷¨０１。（３）通过诱导启动子或者组织特异性启动子还可以实现真菌特定生活阶段或特异性组织的基因沉默，并且可以据此跟踪此基因在不同时期不同组织的表达情况。

虽然，基因沉默技术有许多优势，但也有一些局限性。例如对于不同基因，要达到表型差异所需要的表达量不同，而ＲＮＡｉ技术并不都能达到引起差异的水平。因此，应用此技术并不一定产生表型上的差异，这就给突变效果的检测带来了困难。此外，采用基因沉默而产生的基因突变，不可以进行基因回救，这也是限制其广泛应用的一个瓶颈。

３

展望

随着大量真菌基因组序列信息的测定，基因功

能的研究将成为基因组计划完成后的重大课题，阐明基因功能逐渐成为研究热点，而如何选择适宜的基因功能研究方法无疑是真菌基因功能组学研究的一个决定性因素。这就要求研究者们在实际工作中，根据特定基因制定特定的基因功能研究方案，以对其功能进行快速、全面和系统的研究。相信在不久的将来，人类将全面了解生物基因组的功能，乃至其在整个生命过程中的相互作用。

参考文献

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万方数据

基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

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中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京100081生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN2011(5)1次

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/hwgj.html