食品中转基因成分检测(大豆)

食品中转基因成分检测

第12章

ELISA方法定量检测抗农达® (Roundup

Ready®) 转基因大豆

F．Eyquem

  转基因大豆 ELISA方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®)2 

目 录

第12章

ELISA方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大

豆

引言 3

酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术 7 实验部分 10

参考文献 20 食品中转基因成分检测 第12章

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引言

本章介绍一种用免疫学技术检测转基因植物的方法，这种方法是基于对转化事件中转入基因产生的新蛋白的检测。但是，值得注意的是，基因修饰并不总是直接特异地对应于产生新蛋白，蛋白表达量水平也并不总是足够用于检测的目的。另外，某些蛋白可能仅在植物的特定部位表达 (如：组织特异性启动子)，或者在不同部位或不同生理时期其表达量水平也不一样。

有报道称植物中转基因产物表达量水平占总可溶性蛋白的0~2%，甚至在一些强启动子植物中也是如此 (Longstaff，1995)。然而，在许多情况下，文献资料报道的转入基因蛋白表达量水平 (如：批准的GM作物) 一般低于2%的表达上限 (henner，1997)。

免疫学分析是一种用抗体作为检测试剂的分析测定系统。抗体是一种从动物血清中分离得到的特异性蛋白，它可特异性地结合于诱导它们产物的底物，即抗原。抗体的制备是通过将待检测的底物 (如：CP4 EPSPS，是一种产生农达除草剂抗性的蛋白) 注射到动物如兔子或者老鼠体内，然后动物体内的细胞会将此底物识别为外来物质并产生抗体与之对抗。抗体经过纯化，并用可检测的标记与之连接，然后可作为检测目标底物的试剂。

免疫学检测方法发展和应用的先决条件是：得到可直接和待检测新蛋白作用的高特异性抗体。另外，目标样品或蛋白不能有明显的降解。

在对复杂基质中的抗原进行定量的检测中，抗体是一个很有用的生物学工具。所有的免疫学分析都是基于抗原和抗体之间的特异性结合。

抗体-抗原相互作用

当免疫学家将抗体的本质确定为蛋白质时，对于抗体的大多数描述都包括：这些分子具有将抗原从溶液中沉淀出来的能力，尽管现在抗体沉淀性质已经很少用于实验性分离和检测抗原，除了在一些自身免疫疾病中抗体也很少在体内沉淀抗原。抗体沉淀反应的作用，如图1所示，地说明了抗体分子基本和普遍的特性。这个实验同时说明了其他的一些问题：

·血清抗体 (IgG) 在与抗原反应时是二价的，它与抗原可以发生交联 (cross-link)； ·抗原与抗体反应时一般是多价的；

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·血清抗体在自然情况下都以多克隆形式存在；

·抗体可以高度特异性地识别抗原分子的结构。

图1. 单抗原及其抗体系统的沉淀曲线

以抗体沉淀量和逐渐增加的抗原浓度 (抗体总量恒定) 作沉淀曲线，可分为3个区域 (图1) ：

“抗体过量区”，在这个区域，抗体沉淀被抑制，可在上清液中检测到过量的抗体。 “等价区”，在这个区域，沉淀量达到最大，抗原抗体形成大的不溶性抗原抗体复合物 (蓝色显示)，上清液中检测不到抗原和抗体的存在。

抗原抗体沉淀反应能很好地描述多克隆抗体和多价抗原之间的相互作用，但一般地，它不适合于描述抗原和单克隆抗体之间的相互作用，除非抗原表现出多种一致的抗原决定簇 (如，在多糖中发现的重复碳架结构)，只有在这时，特异性的单克隆抗体才能交联并沉淀抗原。尽管如此，单克隆抗体有更简练的方法来描述其生物学特征，这些方法提供了关于抗体抗原相互作用的一些详细信息，如平衡常数和动力学开关速率。

抗体能非常有效的用来检测和分离抗原。化学修饰可以改变抗体的结构但是不破坏它们与抗原结合的能力，使得抗体的相对稳定性增强，从而使抗体的应用也大大加强。抗体食品中转基因成分检测 第12章

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可以通过化学方法，用荧光、磁性、放射性或其它化合物进行标记，使其在不同的实验条件下实现对抗原的检测和分离。

如何制备单克隆抗体

抗原对于人体来说是外源物质，如致病性细菌和病毒，以及其它侵染性物质，它们可被人体的免疫系统作为入侵者而被识别。抗体是我们体内抵御这些侵染性物质的天然防线，可以识别抗原并有助于破坏抗原蛋白。

抗体非常有用的两个性质是，首先，它们是高度特异的；即每个抗体只能特异地结合和攻击一个特定的抗原。其次，有些抗体一旦被一种疾病激活，它将持续对这种疾病产生抗性。

利用抗体的第二个特点就可以发展疫苗。疫苗是一种弱化或者灭活的细菌或病毒，当它们被接种到人体中时，可以激活人体产生抗体抵御它所携带的抗原。

抗体的特异性使单克隆抗体技术变得价值非凡。抗体不仅仅可以用于医疗，抵御疾病；它们也可以帮助诊断一系列的疾病，检测药物、病毒和细菌产物、以及血液中其它不常见或不正常的物质。

由于这种抗病物质 (即抗体) 的多样化使用，抗体的纯化质量一直以来都是科学研究所关注的焦点。抗体制备传统的方法是向实验动物注射抗原，等抗体形成后，从动物的血清中回收抗体 (含有血清的抗体称为抗血清)。这种制备方法存在两个问题：它产生的抗血清中包含有其它一些不需要的物质，而且这种方法所产生的抗体的量是非常少的。

通过使用一种能在自然条件下产生抗体的细胞，和一类在培养条件下可以持续生长的细胞，单克隆抗体技术可以产生大量的高纯度的抗体。如果我们能将这种“不死”的特性，和这种可以产生我们需要的抗体物质的特性结合起来，实际上，我们就得到了一个连续工作的生产抗体的工厂。

在单克隆抗体技术中，有连续繁殖能力的肿瘤细胞，和产生抗体的哺乳动物细胞融合。这种融合细胞称为“杂交瘤细胞”，它可持续产生抗体。因为它们都是来源于同一类型的细胞-杂交瘤细胞，这些抗体就被称为单克隆抗体；另一方面，由传统方法产生的抗食品中转基因成分检测 第12章

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体是来源于多种类型的细胞，因此它们称为多克隆抗体。下边介绍一个单克隆抗体制备的例子。

单克隆抗体的制备

骨髓瘤细胞是一种骨髓中的肿瘤细胞，它可以在细胞培养中不停的生长。当骨髓瘤细胞和产生抗体的哺乳动物脾细胞融合，其结果产生杂交的细胞，称为杂交瘤细胞，它可以产生大量的单克隆抗体。这种细胞融合的产物集合了两个不同类型细胞的特性：持续生长的能力和产生大量高纯度抗体的能力。

因为选择性的杂交细胞只产生一种特异性抗体，其纯度比传统方法产生的多克隆抗体高很多。在对抗疾病方面，它们与传统的药物相比具有更高效的潜力，因为药物不仅攻击外来物质，同时也会攻击人体自身的细胞，有时也产生一些不期望的副作用如过敏反应。单克隆抗体仅仅攻击目标分子，它不会产生副作用，或使副作用大大减少

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酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术

定义

酶联免疫吸附分析 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 是指：应用一个酶标记的免疫反应物 (抗原或抗体) 和一个免疫吸附剂 (结合在固体支持物上抗原或抗体) 的酶免疫分析，通过不同的方法 (如：在标记的反应物和未标记的未知样品之间的竞争结合)，可用于测定未知样品的浓度。

ELISA (Clark and Adams，1977) 依赖于抗原抗体之间的特异性反应。ELISA中的关键试剂是抗体，它是免疫系统应答于外来物质 (抗原) 侵染而产生的一种可溶性蛋白。对于转基因的检测，抗原则是新产生的蛋白。

在转基因植物中，插入的基因会产生新蛋白。可以用ELISA的方法来评估此蛋白在转基因植物中表达量的水平。关于特异性抗体的生产和应用的信息，在许多报道转基因植物发展的文章中可以找到 (Mohapatra et al.，1999)。

至今，商业化的能够直接应用于批准的转基因作物插入基因蛋白产物的特异性抗体还很少：有一些抗体是针对于nptII基因产物NPTII或APH (3') II，和针对gus基因的产物。

下图是进行ELISA检测的3种不同方法：

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基于ELISA的抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆特异性检测的方法由Lipp等 (2000) 建立、测试和验证。

此方法的建立是基于CP4-EPSPS (5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，此酶来源于Agrobacterium sp.strain CP4) (Padgette et al.,1995) 蛋白特异性抗体的使用。CP4-EPSPS蛋白赋予Roundup Ready®大豆抗农达®除草剂的特性。初步结果表明，此方法 (操作中使用商业化的ELISA试剂盒) 可以检测大豆原料中的转基因成分含量范围在0.3%到5%之间。 原理

下图表示的是用于检测CP4-EPSPS蛋白的三明治式ELISA示意图：

微量滴定板的表面包裹着特异性单克隆捕获抗体。

当加入含有待检测蛋白的样品时，捕获抗体与抗原结合。

样品中没有结合的成分可被洗脱除去。

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洗脱之后，加入一种与辣根过氧化物酶 (HRP) 共价偶联的多克隆抗体，该抗体可与CP4 EPSPS蛋白的另一个抗原位点特异结合

洗脱后，加入辣根过氧化物酶的显色底物四甲基联苯胺 (TMB)。辣根过氧化物酶可催化底物产生颜色反应，颜色信号与抗原浓度在线性范围内呈一定的比例。显色一定时间后，加入终止液终止反应。在450 nm波长处测量每一孔的光密度。

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试验部分

(转基因食品成分检测，大豆试剂盒使用说明 (1999)。Srategic Diagnostics, Inc., Rev. 052099, Vers.1.8.) 1

引言

下面的程序详细描述了基于ELISA法检测农产品原材料及其加工产品中抗农达®大豆表达的CP4 EPSPS蛋白，如大豆粉和大豆蛋白分离物。

此方法应用于只经少许处理或未经处理的CP4 EPSPS蛋白未变性的样品。例如，食品成分经高温处理可能会影响到蛋白检测结果。数据显示食品成分在温度不高于65℃下处理少于60分钟时，其检测结果是可信的。

此方法已经验证可作为CP4 EPSPS蛋白的检测方法，若应用特异的参考物质，其样品中CP4 EPSPS蛋白的检测浓度范围可从0.3%到5% (w/w)。使用一个修改的程序，试剂盒也可以检测低至0.05%到0.3%浓度范围的样品。

仪器设备

·15 ml锥形聚丙烯离心管

·12×75 mm玻璃试管

·塑料薄膜或铝膜

·塑料胶带或盘清洗机

·洗液瓶，如：500 ml的

·可分装20 μl到500 μl的精确微量移液器

·漩涡混合器

·称量纸

1本章中描述的试剂盒是在组织培训课程和编写手册时唯一验证可用的商业化程序，JRC和WHO并不推荐任何特定品牌的商业化试剂盒。

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·刮刀

·精确到0.01 g的天平

·转速达到5000到10000 rpm离心机

·可以读取450 nm吸光值的酶标仪

·37℃的恒温箱

·孔径450 µm的滤膜

·孔径150 µm的滤膜

·多通道移液器。如50 µl到300 µl (可选)

·可多通道分装的试剂容器 (可选)

·自动清洗机 (可选)

·15 ml离心管架 (可选)

试剂

概述

在分析中，除另有规定外，应使用达到分析级别的试剂和去离子水或蒸馏水。

对规定中操作标准的任何偏离都可能会影响到试剂的稳定性。应该丢弃基质成分由澄清变成蓝色的试剂。不能使用已经变混浊的缓冲液。

试剂盒中所有试剂都应该保存在2~8℃条件下。试剂盒成分的货架期与其成分的有效期相同。基于稳定性测试，试剂盒在2~8℃条件下其有效期为9个月。偶联抗体储藏液和偶联抗体工作液应该在其试剂盒有效期内保存在2~8℃条件下。稀释的工作洗脱液应该储藏于大约2~8℃条件下，不能使用超过有效期的试剂盒。

检测试剂盒通常提供的试剂

·大豆抽提缓冲液，硼酸钠缓冲液，pH 7.5

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·大豆分析缓冲液，磷酸盐缓冲液 (PBS)，Tween 20，牛血清蛋白 (BSA)，pH 7.4 ·包被有单克隆捕获抗体的酶标板

·大豆偶联抗体，冻干的兔抗CP4 EPSPS蛋白

·大豆偶联抗体稀释液，10％热灭活的小鼠血清

·显色底物，K-BlueTM，四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine，TMB)，过氧化氢，5%二甲基甲酰胺 (dimethylformamide) 作为溶剂。

·终止液，0.5%硫酸

·10倍浓缩的洗脱缓冲液，PBS，Tween 20，pH 7.1。

·阴性和阳性参照标准

程序

程序的使用范围

ELISA-GM检测体系只限于检测CP4 EPSPS蛋白表达与参照标准中GM材料含量相关的样品。

ELISA检测试剂盒最适操作环境温度在15~30℃之间。参照标准的最高吸光值应当高于0.8，吸光值不能落在分光光度计的线性范围以外 (不同的分光光度计有不同的线性上限)。应该考虑到吸光值 (OD) 在30℃以上会很快上升，因此，如果温度较高，就应该降低底物温育时间。而在温度较低时 (低于15℃)，应该加长底物温育时间。

样品制备过程中避免污染的方法

概述. ELISA GMO检测体系具有很高的灵敏度，非常少量的GM污染都会影响检测的结果。因此不同批次样品处理操作中必须对过程中使用的所有仪器进行彻底的清洗。以下程序包括：第一步尽量去除颗粒物质，第二步乙醇清洗，可使样品变性，这样可使留在仪器上的任何可检测的GM蛋白失去活性。 混合器或搅拌机清洗. 使用柔软的毛刷清洗。定期地清洗毛刷并在酒精中浸泡。使用之前将毛刷晾干。用柔软的衣物或实验室毛巾拭擦。

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用酒精冲洗，可用喷壶冲，建议冲洗两次。然后再用清水冲洗。在空气中干燥，如果急用的话，可以用吹风机吹干。

滤网清洗. 滤网容易被大豆粉堵塞，在硬的表面轻轻拍打滤网以去除堵塞物质。

使用柔软的毛刷清洗。定期的清洗毛刷并在酒精中浸泡至少一分钟。使用之前将毛刷晾干。用柔软的衣服拭擦。用酒精冲洗至少5 min，然后再用清水冲洗。在空气中干燥，如果急用的话，可以用吹风机吹干。

也可用超声波清洗，然后空气中干燥。

工作区域的清洁. 对于工作区域的清洁也是非常重要的。因为此分析方法灵敏度高，少量的转基因阳性粉末污染都可能造成假阳性的结果出现。应避免大豆粉末污染工作区域。不允许大豆粉末的处理污染后面过程中用到的仪器。为了得到最好的结果，样品混合和制备的区域和设施应该和实验分析的地方分开来，以避免可能存在的粉末污染。 样品制备

均质的子样品应取之于实验室样品。

如果实验室样品是大豆原材料，取500 g以上大豆，放在合适的搅拌机上粉碎大约三分钟，直至可通过微孔滤网过滤。定量检测的样品颗粒大小应小于150 µm，定性检测的样品颗粒大小应小于450 µm。过滤过程中应小心污染，并避免局部过热。搅拌机的作用是混合和粉碎样品。

从研磨的的材料中取大约100 g左右可通过450 µm微孔滤网 (40目) 的子样品，保证子样品的90％以上可通过450 µm微孔滤网。定性检测分析可直接使用筛选的样品，定量检测分析应进一步经孔径为150 µm的微孔滤网过滤筛选的样品。通过450 µm微孔滤网的材料大小可认为是均一的，因此筛选通过150 µm微孔滤网的最终样品只要够量就可以。

对于其它类型的材料，甚至颗粒更小的样品应采用类似的方法处理。

分析程序

所有的试剂在使用前都要先回复至室温。

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从铝箔包装袋中取出包被的酶标条和酶标条固定架，每次取出适量的酶标条后重新密封包装袋。检测条上的十个孔是用来做参照标准和空白对照的。每快板都应有一个标准和对照。如果使用手动清洗，将酶标条的边缘用胶带粘到固定架上以防止在清洗时检测条会突然掉下来。

偶联抗体的制备 偶联抗体储备液：从大豆偶联试剂瓶 (Soya Conjugate bottle) 中吸取1 ml的大豆偶联稀释液 (Soya Conjugate Diluent) 到大豆偶联连接液 (Soya Conjugate vial) 中，旋转混合大约10 s。 偶联抗体工作液：吸取240 µl重构大豆偶联液 (reconstitute Soya Conjugate) 到大豆偶联稀释液瓶 (Soya conjugate Diluent bottle) 中。标记日期，翻转混合20次。

洗脱缓冲液的制备

将10×的洗脱缓冲液回复到室温。

用去离子水稀释10×的洗脱缓冲液，制备成为洗脱缓冲工作液 (例如：50 ml的10×洗脱缓冲液加入到450 ml去离子中)。

将洗脱缓冲液工作液加入到自动清洗仪或洗瓶中。

样品和参考标准的抽提

实验样品、阴性及阳性参照标准品在相同条件下抽提，每个两次重复，可描述如下。 样品称量时，按照浓度由低到高的顺序先称取参照标准，然后是实验样品。

每一种参考标准和样品称取0.5 g±0.01 g，分别放入15 ml聚丙烯离心管中。为避免污染，每次称量前要擦净抹刀。

向每个离心管中加4.5 ml大豆抽提缓冲液，旋涡混合10 s。

5000 rpm离心15 min。

用移液器小心吸取上清液于另一干净的15 ml聚丙烯离心管中，并做标记，不要吸到粒子物质。

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开始检测前，用大豆检测缓冲液按照表1所列比例稀释样品和参考标准抽提物。 蛋白抽提物于2~8℃贮存，时间不超过一个工作日。

表1. 不同基质的稀释范围

基质 稀释

大豆 1:300

大豆粉

脱脂豆粉 1:300 1:300

蛋白抽提物 1:10

样品抽提物的稀释

对于抽提的阴性对照、阳性对照和样品的稀释需要用到两个12×75 mm的实验管完成。

吸取280 µl大豆检测缓冲液到其中的一个12×75 mm实验管。

吸取380 µl大豆检测缓冲液到另一个12×75 mm实验管。将280 µl的实验管标记为“1:15”，将380 µl的实验管标记为“1:300”。

每个样品吸取20 µl到标记为“1:15”的实验管，涡旋混匀。

从标记为“1:15”的检测板吸取20 µl到标记为“1:300” 的检测板，涡旋混匀。 同样的方法稀释阴性对照、阳性对照和样品抽提物。

ELISA操作程序

概述

ELISA检测试剂盒可以以不同的形式在8孔检测条上使用。建议使用随机加样方案。 所有的反应孔都应重复两次，然后计算其吸光值的平均值。每个程序都要包括分析缓冲液空白、阴性对照和阳性参照标准。

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当检测开始后，所有的步骤都应该连续进行而不能中断。

加样

加100 µl稀释的提取液和检测空白到对应的孔内。

每次移液使用一次性枪头以避免交叉污染。

使用胶带或铝箔封住酶标板，以免污染和蒸发。

样品温育

37℃，微量滴定板温育1 h。

洗脱

用300 µl洗脱缓冲液洗脱酶标板3次。 人工洗涤：将酶标板翻转，倒出微孔内液体。用装有洗涤工作液的500 ml洗瓶，将每孔注满洗涤液，保持60 s，然后翻转，倒掉洗涤液。如此重复操作3次。在多层纸巾上将酶标板倒拍数次，以去除残液和泡沫。

用胶带将酶标条固定以免滑落。 自动洗涤：温育完毕，用微量清洗器将所有孔中的液体吸出，然后在每孔内加满洗脱缓冲液。如此重复3次。最后，用微量清洗器吸出所有孔中洗脱液，在多层纸巾上将酶标板反放拍干，以去除残液和泡沫。

在此过程中，不要让酶标孔全干，否则会影响分析结果；

不管是人工洗涤还是自动洗涤，应确保每一孔用相同体积的洗脱液洗涤，不充分地洗涤会导致出现错误的结果。

加入偶联抗体

向每个孔加入100 μl偶联抗体工作液

盖上盖子防止污染和蒸发

温育

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37℃，微量滴定板温育1 h。

洗涤

温育结束后，重复前面用到的洗涤步骤。

加入底物

每孔中加入100 µl显色溶液。

轻轻摇动酶标板，室温温育10 min。

加显色底物时应连续一次完成，不得中断。

在移液操作中保持相同次序和时间间隔。酶标板应注意避光，防止颜色的亮度因受到光的影响而发生变化。

加入终止缓冲液

温育结束后，按照加入显色底物同样的顺序向酶标孔中加入100 µl终止液。

在加入终止液时应连续一次完成，不得中断，酶标板应注意避光，防止颜色的亮度因受到光的影响而发生变化。

测定吸光值

用酶标仪在450 nm波长测量每孔的吸光值 (OD)。

在加入终止液30 min之内读取吸光值。

记录所得结果，计算平均吸光值或用计算机处理。

评估

标准品用于制作标准曲线。实验样品及参照标准的数值需减去检测空白的数值，所测量的参照标准品的平均值用于生成标准曲线，实验样品的平均值根据标准曲线计算相应浓度。

结果可信度判断的原则

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每一轮检测都必须符合结果可信度判断的原则。每一轮反应应当包括：空白、阴性标准品、阳性标准品和未知样品。所有蛋白抽提物、空白对照都必须设置一个重复。如果不符合分析结果可信度判断的条件，所有检测实验需重新操作。

样品

空白对照 阴性标准品

2.5％阳性标准品

所有阳性标准品

未知样品 标准 A450 nm <0.30 A450 nm <0.30 A450 nm≥0.8 重复的CV≤15％ 重复的CV≤20％

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流程图

实验样品和参照标准抽提流程

程序

称量

加缓冲液

混匀 体积/质量 0.5 g 4.5 ml 说明 称量试验样品、空白、参照标准 加入抽提缓冲液 实验样品与抽提缓冲液充分混匀

以5000 rpm将样品离心15 min，吸取上清

离心 5000 rpm

到另一干净离心管中

稀释 根据不同基质以稀释实验样品和参照标准 1:300或1:10稀释

ELISA实验流程

程序

加样

温育

洗涤

加样

温育

洗涤

加样

温育

加样

测量吸光

值 体积 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 说明 微量移液器吸取已稀释的实验样品、参考标准的抽提液和空白至相应酶标孔 37℃温育1 h 用洗脱缓冲液洗涤3次 向每个酶标孔中加入偶联抗体 37℃温育1 h 用洗脱缓冲液洗涤3次 向每个酶标孔中加入显色底物 室温温育10 min 向每个酶孔中加入终止液 用酶标仪测量每孔在450 nm的吸光值

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参考文献

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/sx1j.html