WB完整步骤

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶

转移胶（转膜）

封闭和孵抗体 扫膜

一.配胶

这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶

均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，

二制胶

1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。30分钟

胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴

10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉 过硫酸铵（APS）(10%;w/v)

取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制

但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气

2.灌积层胶5%（统一） 40min

说明：可延长，宁长勿短。防止凝固不均匀，形成月牙状。

三．跑胶

1.配制running buffer 1) tris 3g；

2) Glycine:甘氨酸14.4g

在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键 的。Tris-甘氨酸系

：

统是目前使用最多的缓冲系统。

如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程 3) 10%SDS 10ml；

SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的

SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大

量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为 特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分 子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它 的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 4) 加双蒸水ddH2O至1000ml 不需调节pH

2.上样

上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。

所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积

3.电泳

加running buffer

其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳running Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。

电压及时间：70V 40min 大约到分离胶与浓缩胶的交界处。 100/120v 90min

当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。

电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.

样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。

低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通

以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳

注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液

凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，

四．卸胶

注意胶勿破！可根据自己所需要蛋白的大小选择胶的范围，maker为标志。

五.转移胶（转膜）

由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响

切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。

1. trans buffer电转移缓冲液调Ph

1) tris 5.8g 2) 甘氨酸 2.9g 3) SDS 0.37g 4) 甲醇 200ml

转移缓冲液中都含有适量的甲醇，对于分子量较小的蛋白质，甲醇能促进它们固定在固

相纸膜上，但对于大分子量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，在转移缓冲液中是不宜加入甲醇的。因甲醇使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白质从凝胶中转移出。由于甲醇能将结合在碱性蛋白质上面的SDS解离出来，而使其带正电或呈电中性，蛋白质也就更难从凝胶中转移出。

在印迹转移中，转膜成功与否，直接关系到整个Western Blotting 的成败：其中转移缓冲液，膜的选择至关重要。要使蛋白质组分能有效地从凝胶转移到固相纸膜上,缓冲液的pH很重要。有些分子量并不是很大的蛋白质区带，即使延长电转移时间也不能从凝胶转移到固相纸膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态所造成的，因此应适当改变转移缓冲液的pH以利于转膜。此外，膜的选择也很重要.硝酸纤维素NC膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜，重氮化膜和阳离子尼龙膜为最常用的膜，硝酸纤维素NC膜使用得最普遍。因其价格便宜，使用方便，吸附蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测。它的缺点是：与蛋白的结合为非共价性，膜干燥后很脆，易碎。重氮化膜则与蛋白形成共价结合，有较好的机械强度，但它只能在那些没有游离氨基的凝胶缓冲液中使用。阳离子尼龙膜与蛋白是通过离子键结合的，其结合容量很大，尤其对分子量较小的蛋白质结合特别有效。它有极好的机械强度，在冲洗和干燥中膜的大小不发生改变。PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质的最佳用膜。这种疏水膜呈均一控制的孔结构，具有极强的吸附生物分子的能力。与硝酸纤维素膜相比，Immobilon-P膜具有易于操作，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高的特点，提高了检测的灵敏度。其开放的孔结构使其容易接近被吸收的蛋白质，并去除背景上没有吸附的探针。可以说，它是免疫检测理想的印迹膜。此外，膜的孔径的大小也是需要考虑的重要因素。对于分子量大于20kD的蛋白质，需要选择0.45um的膜，分子量小于20kD，需要选择0.2um的膜。分子量小于7kD，需要选择0.2um的膜。有的蛋白质由于分子量太大，而很难转膜，针对这种情况，PIERCE专门推出了在胶上做Blotting的试剂盒。

将PVDF膜先在甲醇中浸泡几分钟,再转移到转膜缓冲液中处理15min。 PVDF膜，125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）

另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用 如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂； 切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下 ，孵抗体是正面朝下，使气泡往上走。正面充分的结合抗体，并且扫膜时扫正面。

膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的

半干电转移要防止过热

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好

切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了

六．封闭及杂交

可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。 一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。

为使抗体反复利用，抗体溶剂可不用脱脂奶粉配制

1. 脱脂奶粉封闭：5% 37℃ 50r 2h

为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，

传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景

某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，，请仔细阅

读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法

配制5脱脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脱脂奶粉或 BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒

封闭时，4°C摇动，封闭1 hour ，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育 TBST的配制

配制1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS 900超纯水 1ml Tween20

Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用Tris buffer.配成10的Tween20母液后使用

2. 一抗孵育后洗三次：1:10000(0.5微升抗体：5ml抗体容积)

?

第一次PBS 加吐温 （1：:1000）20℃ 130r 10min

一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试

? 同样方法洗第二次，第三次各10min

孵育Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一日本最好的贵族学校般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带

某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同

注：如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5 0.25脱脂奶粉或 BSA的封闭液来,稀释，可产生相对更强的信号条带

孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合

孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4oC进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）

3. 二抗的孵育 1:1000

洗膜两次，第二次时不加吐温

一抗孵育结束后，用TBST摇动洗膜3次，每次10min或更长，去除残留的一抗 孵育Buffer和稀释倍数：用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带亦可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同时导致特异性易简儿童理发器条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合

孵育时间和温度：室温、1-2 hours, 摇动

二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP碱性磷酸酶，因其不够灵敏

孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀C 转膜与显色（Western Blot）

C-1 胶中蛋白的检测

电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色

铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜

考马斯蓝法：用40双蒸水, 10 醋酸, 50甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5双蒸水, 7.5 醋酸, 25甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色

C-2 蛋白转膜

蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白

湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移

标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20甲醇，如果提亮肤色的粉底转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS使之终浓度为01

半干式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间胶于负极而膜置于正极半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04 SDS, 20

甲醇，

两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形

注：大蛋白和小蛋白的转膜

电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：

大蛋白（大于100 KD）

1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，

2 大蛋白易在凝胶里形成凑集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10或更低，以防止蛋白沉淀

3 降低电转移缓冲深圳水晶文具源发液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出

4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF需用甲醇活化

5 选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜 小蛋白（小于100 KD

1 SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS

2 保持20的甲醇浓度

对于大于500KD的蛋白，请参考下述文献：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185 192 (1997). 更多的转膜注意事项：

? 避免用直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生

背景污斑

? 排列三明治时，尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！

? 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效 ? 鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景

C-3 膜上蛋白的检测：丽春红

为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，

2的丽春红贮备液(20ML)：: 2丽春红(0.4克)溶于30三氯乙酸(6克)和30磺基水杨酸(6克)

丽春红染色工作液：2的丽春红贮备液1：10稀释，即加9 倍的ddH2O 染色方法：

将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟，大批的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭

10x TBS的配制 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl 加约 800 ml 超纯水 用纯HCl调pH 至7.6 定容至1 L. TBST的配制

配制1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS 900超纯水 1ml Tween20

Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用Tris buffer.配成10的Tween20母液后使用

C-4 膜的封闭 C-5 一抗的孵育

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