WB操作步骤

Western Blotting试验步骤

一， 组织蛋白提取

1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。

注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。

2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。

注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。

3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二， 提取液中总蛋白的测定

用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体

积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。

注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，

2. 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微

升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。

3. 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。

4. 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，使用温箱孵育时， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

注：1）标准曲线布板：（单位：微升） 试剂/孔1 2 3 4 编号 5 8 12 200 6 12 8 200 7 16 4 200 8 20 0 200 标准品 0 PBS 20 2 18 200 4 16 200 6 14 200 工作液 200

样品蛋白布板：

试剂/编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 样品 PBS 工作液 2倍稀释 4倍稀释 10倍稀释 9 11 200 9 11 200 9 11 200 4 16 200 4 16 200 4 16 200 2 18 200 2 18 200 2 18 200

空白对照布板：

试剂/编号 1 20 200 2 20 200 3 20 200 4 20 200 5 20 200 6 20 200 7 20 200 8 20 200 PBS 工作液

注：测蛋白浓度过程中，可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完，可拿一部分蛋白样品分装，5×SDS缓冲液，于沸水中煮5-10min使蛋白变性（也可以使用PCR仪进行变性，99℃，3-5min）。此处需确定待加入5×SDS的量。计算含20-50ug蛋白样品的溶液体积即为上样量。先根据所算出来的蛋白浓度确定含20-50ug蛋白样品的溶液体积，再按蛋白样品：5×SDS上样缓冲液=4:1（此时5×SDS的浓度为1×）的比例算出5×SDS的加入量。等算出这个，可以把蛋白样品按这个量分装好冻到-80℃，跑电泳时可以直接拿出来用已知蛋白含量的变性样品。

三，SDS-PAGE电泳

1. 制胶（分离胶8%，浓缩胶4%）（见附表）

2.清洗玻璃板，晾干备用。（洗衣粉-自来水-蒸馏水，至不挂水珠为止）

3．灌胶：在光线明亮处，装好垂直电泳槽模具，检验玻璃板不漏胶（可先灌进去一点分离胶，稍等片刻，观察其是否漏），用1ml移液器在玻璃板夹层中沿玻璃板一角缓慢添加分离胶（5ml），至玻璃板中上部，需缓慢进行，以确保玻璃板中无气泡产生。灌完分离胶后往玻璃板中继续添加超纯水，使制胶版完全被超纯水封闭。静置45min

（20-30min?），直至在超纯水与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线。将制胶版略微倾斜，用移液器吸出超纯水，并用吸纸吸去制胶版板壁上残留的水滴。用1ml移液器在制胶版右角上缓慢添加4%浓缩胶（2-3ml）至制胶版被完全封闭。将梳子垂直插入制胶版浓缩胶中，用移液器向梳子缝隙中缓慢加入浓缩胶，至空隙被完全填满。室温静置约50min，直至在浓缩胶与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线，将梳子缓慢垂直取出并将制胶版用电泳夹夹好放入电泳槽。 3．加足够的电泳液（加至淹没内面玻璃板）后开始准备上样。 4.上样

（1）蛋白变性：含20-50微克的蛋白样品中加该蛋白体积的1/4量的5×SDS上样缓冲液，装于200微升EP管中，混匀。插在小孔泡沫板上（管口不要离水面太近，盖子盖紧，不用封口），沸水煮5-10min,使蛋白变性，离心15-30s混匀。

（2）加样：用50ul的微量加样器上样，注意需缓慢轻柔，一次性加完，防止气泡产生或损坏凝胶，加每个样品前需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。

5.跑电泳：按黑红电极盖好电泳槽盖子。调节电压，浓缩胶：80-100V，（80V,20min）分离胶180-200V(100V 120min），及时观察防止条带跑出胶。

注：此过程发热，放入冰水浴中进行。待溴酚蓝迁移至凝胶最下端时，电泳完毕。（跑胶位置因目的蛋白的大小而异）。

四，转膜

1. 准备：制冰，和胶同等大小的PVDF膜一张（用甲醇侵泡10s，10min?），滤纸6张（也可以用2张？），将滤纸、夹子、海绵垫（2张）、玻棒浸放于加有转移液的搪瓷盘里。切膜和滤纸时需佩戴手套。

2. 将夹子打开，使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以排除气泡。将胶从玻璃板中剥下来，按海绵-2层滤纸-凝胶- PVDF膜-2层滤纸-海绵的顺序（每对齐覆盖一层，均需固定好位置排除气泡一次），合起架子并固定。

3. 将“三明治”放入转移液槽中，使夹子黑面对黑面，白面对红面，盖好盖子，接通电源，100V 2h，放入冰水浴中转移。

4. 拆下转移装置，用TBS从下向上浸湿转移好的膜，移至含有封闭液的平皿中（加盖防止水汽蒸发），室温摇床上封闭1h（2h或者4度过夜？）。

注：封闭液：2.5g奶粉+50mlTBST，混匀，现用现配。

5．洗膜：TBST溶液漂洗膜3次，10min/次（就是把TBST放平皿里，然后把膜浸泡在其中，摇床摇十分钟）。-有说封闭后不用洗膜 6.孵一抗：将一抗用TBST稀释至适当浓度，1:1000,10ul一抗+10ml稀释液（稀释液：2.5g脱脂奶粉/BSA+50mlTBST）,将膜放入倒入一抗的表面皿或者培养皿，室温孵育膜2h。

注：稀释的一抗里可以加入0.002g的0.02%叠氮化钠，可在4度长期保存，可是供货商建议仍然-20保存？ 7.TBST洗膜3次，10min/次。

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