HPLC方法验证

HPLC法测定水飞蓟素中各主要成分的含量

摘要 目的：建立一种测定水飞蓟素中各主要成分含量的HPLC方法。方法：使用岛津LC-20A型高效液相色谱仪；色谱柱：Betasil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇－水－冰乙酸（51.5：48.5：0.5）；检测波长：288nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃。结果：水飞蓟宾在0.02～0.15mg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9994),3个浓度的平均回收率分别为98.5％，97.9％，98.5％；RSD分别为0.4％，0.5％，0.5％。结论：本方法操作简便、准确、重复性好，适用于水飞蓟素中各主要成分的定量分析。

关键词：HPLC；水飞蓟素；水飞蓟宾A、B；水飞蓟亭；水飞蓟宁；异水飞蓟宾A、B；

水飞蓟素为菊科植物水飞蓟（紫花）[silybum marianum(Linn) Gaertn]的果实，经提取精制所得的淡黄色或黄色粉末，或结晶性粉末。无味、无臭。在热甲醇中溶解，乙酸乙酯中微溶，不溶于水，主要化学成分为水飞蓟亭（silychristin）、水飞蓟宁(silydianin)、水飞蓟宾(silybin)C25H22O10及其异构物等黄酮类物质。水飞蓟素具有保肝及降血脂作用，用于治疗慢性肝炎，早期肝硬变、代谢中毒性肝损伤及高血脂症，对人体无任何副作用。本实验采用HPLC法对水飞蓟素中水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾A、B和异水飞蓟宾A、B进行测定，为该原料药的质量控制提供科学的依据。 1 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪，紫外可见检测器，赛多利斯BT25S电子天平(0.01mg)，DC-DS2060型超声清洗器，上海亚荣生化仪器厂SZ-93型自动双重纯水蒸馏器。

HPLC级甲醇（TEDIＡ公司，批号：Lot608012)；HPLC级冰乙酸（sigma公司，批号：2014807）；对照品水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾均购自美国sigma公司，

供试品水飞蓟素为本公司生产（批号为140429）。 2 色谱条件

色谱柱：大连Elite公司Betasil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇－水－冰乙酸（51.5：48.5：0.5）；检测波长：288nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：5μl；柱温：25℃。 3 溶液制备

3.1 对照品溶液 （定性）分别精密称取对照品水飞蓟亭、宁1.00mg，置10mL量瓶中，加适量甲醇，超声15min，甲醇定容，振荡均匀。精密称取对照品水飞蓟宾10.00mg，置100mL量瓶中，加适量甲醇，超声10min，甲醇定容，振荡均匀，制得0.1mg·mL-1的对照品溶液。精密量取该溶液分别制成浓度为0.02，0.05，0.08，0.12，0.15mg·mL-1的系列对照品溶液。

3.2 供试品溶液 精密称取水飞蓟素0.11g，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声15min，甲醇定容，振荡均匀。精密量取该溶液5mL置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液即得。 4 系统适用性试验

吸取浓度为0.1mg·mL-1的水飞蓟宾对照品溶液5μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件记录色谱图，见图Ｃ，按水飞蓟宾峰计算理论板数为5000以上。水飞蓟宾Ａ、Ｂ峰的保留时间为10、11min左右，两峰的分离度良好（Ｒ>1.5)。（定性）分别吸取对照品溶液水飞蓟亭、水飞蓟宁各5μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件记录色谱图，见图A和B。 5 专属性

分别吸取浓度为0.1mg·mL-1的水飞蓟宾对照品溶液和色谱甲醇各5μl注入液相色谱仪，甲醇在对照品溶液主峰位置不出峰，即不影响样品检验。

A B

C D

图１ 水飞蓟亭（Ａ）、水飞蓟宁（Ｂ）、水飞蓟宾（Ｃ）、样品（Ｄ）色谱图 6 线性范围的考察

分别精密吸取按“3.1”项下制备的系列对照品溶液各5μl，注入液相色谱仪。以浓度(mg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算，得回归方程为： 序号 样品浓度mg/ml 样品峰面积mAu*s 范围mg/ml 1 0.00 0 2 0.02 285.00 3 0.05 682.03 4 0.08 1099.69 0~0.15 Y=13446x+14.073 R=0.9994 5 0.10 1390.50 6 0.12 1627.22 7 0.15 2005.80 回归方程 相关系数

.

结果表明水飞蓟宾在0.02～0.15mg·mL-1范围内线性关系良好。 7 精密度试验

精密吸取浓度为0.1mg·mL-1的水飞蓟宾对照品溶液5μl，连续重复进样5次，水飞蓟宾Ａ、B峰面积的RSD为0.4％。 8 稳定性试验

精密吸取供试品溶液5μl，分别于0，2，4，8，12h，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以水飞蓟宾A、B峰面积计算RSD为0.8％。表明该溶液在12h内稳定。 9 重复性试验

对同一批样品（140429），分别取样3份，按“3.2”项下的方法进行溶液制备，在上述液相色谱条件下进行分析测定，该批样品的水飞蓟亭和水飞蓟宾的含量为12.7%，RSD为0.32%；水飞蓟宾及异水飞蓟宾的含量为32.8％，RSD为0.24％。 10 回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：140429，含量：32.8％）共9份，每份约0.11g，分别加入0.1mg·mL-1的水飞蓟宾对照品溶液4，2，1mL，每种浓度各3份，按“3.2”

项下制备溶液，精密量取5μl进样测定，3个浓度的平均回收率分别为98.5％，97.9％，98.5％；RSD分别为0.4％，0.5％，0.5％。 11 样品测定

精密吸取供试品溶液5μl，分别进样3次，用外标法以对照溶液水飞蓟宾A、B峰面积计算水飞蓟素中水飞蓟亭和水飞蓟宁含量为12.7%，水飞蓟宾和异水飞蓟宾的含量为32.8％。 12 讨论与结论

水飞蓟亭、宁对照品溶液仅作定性用，国内目前对亭、宁含量没要求，国外计算亭、宁含量也以水飞蓟宾Ａ、Ｂ峰计算。水飞蓟素标准收载于《国家药品标准》第七册，标准中对照品溶液用流动相溶解，但实验时发现溶解效果不太理想，计算出的宾和异宾的含量较高，不太符合事实，也试验将供试品以流动相溶解，但因为流动相比例中有一半水，而水飞蓟素不溶于水，故改用甲醇溶解对照品水飞蓟宾，结果令人满意。

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