德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研究

山东农业大学

硕士学位论文

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研

究

姓名：宋凤香

申请学位级别：硕士

专业：兽医·兽医病原微生物学

指导教师：姜世金

20090606

东农、Ｊｋ大学硕Ｉ：专业学位沦文

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定

及灭活疫苗保护效力研究

中文摘要

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌所引起的猪的多发性浆膜炎、多发性关节炎、脑膜炎、支气管炎和败血症。ＨＰｓ是一种ＮＡＤ依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科（Ｐａｓｔｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）嗜血杆菌属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）。随着我国规模化养猪场的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，并给养猪业造成严重经济损失。

本研究主要分四部分进行：

１．本研究从德州地区３２个规模化猪场分离到副猪嗜血杆菌２０株，这些菌株在菌落形态、菌体形态、染色特性、生化反应等方面符合副猪嗜血杆菌的基本特征，ＰＣＲ检测也进一步证实分离菌株为副猪嗜血杆菌，证实了山东省德州地区规模化猪场中普遍存在副猪嗜血杆菌的流行。

２．药敏试验结果显示，这２０株副猪嗜血杆菌对上霉素、链霉素、四环素、林可霉素等药物不敏感，而对头孢他啶、头孢噻吠、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星等５种药物比较敏感。

３．对德州地区副猪嗜血杆菌ＤＺ０２分离株的生长曲线研究表明，副猪嗜血杆茼在ＴＳＢ液体培养基中培养到１３＂－１５小时菌体的数目达到最高峰，因此，副猪嗜血杆菌菌液在培养１５ｈ左右时是用于副猪嗜血杆菌灭活疫苗制备的最佳时机。

４．以副猪嗜ｍ杆菌ＤＺ０２分离株为抗原研制的副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗物理性状稳定，安全性良好，并具有较好的免疫保护效力。含菌数为８×１０“ｃｖｕ／头副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗加强免疫后１４天可有效保护免疫猪免受同源副猪嗜血杆菌菌株攻毒发病，在德州市五个规模化猪场

德州地区剐猪嗜阻杆菌的分离豁定及火活疫苗保护效力研究

实际应用可保护大群发病率降低至１．９％，比未免疫猪群发病率下降９．０％，且五个免疫猪群的副猪嗜血杆菌病的发病率均控制在２．５％以下。关键词：副猪嗜血杆菌，分离鉴定，药敏试验，生长曲线，灭活疫苗

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｎＤｅｚｈｏｕＣｏｕｎｔｙａｎｄＳｔｕｄｙ

ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｏｎＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＶａｃｃｉｎｅ

ａｇａｉｎｓｔＧｌａｓｓｅｒ’ＳＤｉｓｅａｓｅ

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

ＨａｅｍｐｏｈｉｌｕｓＰａｒａｓｕｓｉ（ＨＰｓ）ｉｓｔｈｅｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌａｇｅｎｔｏｆＰｏｒｃｉｎｅＧｌｓｓｅｒ，ＳＤｉｓｅａｓｅ，ｗｈｉｃｈ

ｂｙｃａｎｉｎｖａｄｅａｎｄｃａｕｓｅｓｅｖｅｒｅｓｙｓｔｅｍｉｃｄｉｓｅａｓｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｓａｆｉｂｒｉｎｏｕｓｐｏｌｙｓｅｒｏｓｉｔｉｓ，ａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ．ＨＰｓｋｉｎｄｏｆＮＡＤ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｎｏｎ－ｍｏｔｉｏｎ，Ｇｒｍａ．ｎｅｇｍｉｖｅ，ｒｏｄ—ｓｈａｐｅｄｂａｅｔｅｒｉｕｍ．ｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｆａｍｉｌｙｏｆＰａｓｔｔｅｕｅｒｌｌａｅｅａｅ，ｔｈｅｇｅｎｕｓＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｒｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＨＰｓｉｎｉｎｔｅｎｓｉｖｅｐｉｇｆａｒｍｓｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍａｉｎｒｅａｓｏｎｆｏｒｔｈｅｈｉｇｈｍｏｒｔａｌｉｔｙｏｆｙｏｕｎｇｐｉｇｓａｎｄｌｅｄｔｏｔｈｅｈｕｇｅｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓ．

ＴｈｒｅｅＰａｒｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｎｅｌｕｄｅｄｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：

１．Ｔｈｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｕｒｅｃｕｌｔｕｒｅ，ｄｙｅａｎｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ。ａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆ２０ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＨＰｓｆｒｏｍ３２ｐｉｇｆａｒｍｓｏｆＤｅｚｈｏｕｃｏｕｎｔｙｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｕｌｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐａｔｔｅｍｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｂａｓｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅ２０ｓｔｒａｉｎｓａｒｅｂａｓｉｃａｌｌＶ

ＰＣＲｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＨＰｓ．１６ｓｒＲＮＡ－ｂａＳｅｄ

ａｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａａｓｓｉｇｎｅｄｔｏＨＰｓ．

ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＨＰｓｉｓｐｒｅｖａｌｅｎｔｉｎＤｅｚｈｏｕｃｏｕｎｔｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．

２．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＡＳＴｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ２０ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＨＰｓａｒｅｉｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｆｏｒＴｅｒｒａｍｙｃｉｎ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅａｎｄＬｉｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｂｕｔｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｆｏｒＣｅｆｉａｚｉｄｉｍ，Ｃｅｆｌｉｏｆｕｒ，Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅａｎｄＣｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ．３．ＳｔｕｄｙｏｎｇｒｏｕｔｈｃｕｒｖｅｏｆＤＺ０２ｉｓｏｌａｔｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ

ｔｏＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕ括ｗｏｕｌｄａｃｈｉｅｖｅｍａｘｉｍｕｍｗｈｅｎｉｔｇｒｏｗｎ

ｔｏ１５ｈｏｕｒｓ．ｉｎｔｈｅｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍＴｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈｆｏｒ１３

３

德州地区副猪嗜血杆菌的分离豁定及火｝玉疫茁保护效力研究

４．ＴｈｅｉｎａｃｔｉｖｅｄｖａｃｃｉｎｅｍａｄｅｆｒｏｍＤＺ０２ｉｓｏｌａｔｅｐｏｓｓｅｓｓｅｄｇｏｏｄｓａｆｅｔｙ，ｈｉｇｈｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｅｎｏｕｇｈｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｔ１４ｄａｙｓａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｄｏｓｅｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕ必ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈ８×１０５ＣＦＵｐｅｒｐｉｇ．ｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｄｐｉｇｌｅｔｓｗｅｒｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄｆｒｏｍｌｅｔｈａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＡｔｆｉｖｅｌａｒｇｅｓｃａｌｅｐｉｇｆａｒｍｓｉｎＤｅｚｈｏｕｃｏｕｔ５ｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＰｏｒｃｉｎｅＧｌｓｓｅｒ’ＳＤｉｓｅａｓｅｏｆｖａｃｃｉｎｅｄｐｉｇｌｅｔｓｗａｓｄｒｏｐｐｅｄｔｏ

１０．９％ｏｆｕｎｖａｃｃｉｎｅｄ

ｖａｃｃｉｎｅｄｐｉｇｐｉｇｌｅｔｓ．ａｎｄＩ．９％ｆｒｏｍｉｎｅｖｅｒｙｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｆａｒｍｗａｓｕｎｄｅｒ２．５％．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨａｅｍｐｏｈｉｌｕｓＰａｒａｓｕｓｉ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＡＳＴ，ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ４

英文缩略词

缩写英文

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ

ＰＣＲｐｏｌｙ［］ｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ

ｋｂｋｉ１０ｂａｓｅ

ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ

ｔｅｓｔＡｍｐｉＣｉｌｉｎ

ｇｇｒａ［］

Ｓｓｅｃｏｎｄ

ｍｉｎｕｔｅ

ｈｏｕｒ

ｄｄａｙ

Ｕｇｍｉｃｒｏｇｒａｍ

ＵＬｍｉｃｒ０１ｉｔｅｒ中文副猪嗜血杆菌聚合酶链式反应一千个碱基药敏试验克秒分钟小时天微克微升ＨＰｓＡＳＴｍｌｎｈ

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引

副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ言ＨＩ’Ｓ）是常规饲养猪群上呼吸ｐａｒａｓｕｉｓ

道的一种常在菌，但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，该病又称为革拉斯氏病（Ｇｌｓｓｅｒ’ＳＤｉｓｅａｓｅ）。近年来，由于对饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合症，使得该病日趋流行，危害日渐严重，副猪嗜血杆菌已成为猪场保育猪死亡的一个主要原因，对全球范围内的养猪业造成巨大的经济损失。目前美国、日本、加拿大、德罔、澳大利亚、丹麦、西班牙等养猪业较发达的国家均已对本国的副猪嗜血杆菌流行病学进行了调杏，并开展了某些关于副猪嗜血杆菌诊断。２００３，－－－２００５年我国华东、华北及东南等地许多规模化猪场都先后发生此病，引起断奶前后及保育期仔猪持续高热，胸膜炎及腹膜炎等。病猪表现为不食，咳嗽气喘，呼吸困难，关节肿胀跛行，运动失调，死亡率很高；主要剖解病变纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。耐过猪被毛粗乱，皮肤发白，生长迟缓，并先后从北京、山东、上海、黑龙江、辽宁、河南、湖南、湖北及宁夏等省市自治区的病料中分离出副猪嗜血杆菌，肯定了此病在我国的存在。目前，该病在我国流行非常普遍，对我ｌ司养猪业造成了巨大损失。１病原学

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉斯氏病，曾一度被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌所引起。副猪嗜ｍ杆菌可以影响从２周龄到４月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于５．－－，８周龄的猪，发病率一般在１０％～１５％，严重时死亡率可达５０％。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。

早在１９１０年，德国科学家Ｇ１ｓｓｅＦ首次描述了发生浆液性纤维素性胸

德州地区副猪嗜ｍ杆菌的分离裕定及火活疫茁保护效力研究

膜炎、心包炎和脑膜炎猪的浆液性分泌物中的一种革兰氏阴性杆菌，而这种微生物可能是由Ｓｃｈｅｒｍｅｒ和Ｅｈｒｌｉｃｈ在１９２２年首次分离，在随后大量的临床病例分离的基础上，人们对ＨＰｓ的研究逐步深入。ＨＰｓ为革兰氏阴性、具多种不同形态的细菌，从单个球杆状到长的、细长的以至丝状菌体，常可见荚膜。该菌生长依赖炯酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ或Ｖ因子），不需要Ｘ因子（血红素和其它卟啉类物质）。其在巧克力培养基上培养２４～４８ｈ生长较差，为光滑型、灰白色透明、直径大约０．５ｍｍ菌落。如与金黄色葡萄球菌共同培养时，ｔｉＰｓ在葡萄球菌条状菌苔附近呈卫星生长，生长良好，菌落直径可达１～２ｍｍ。ＨＰｓ在血液琼脂上呈小而透明的不溶血菌落，在加ＮＡＤ、马血清和酵母浸｛Ｉ｛物的ＰＰＬＯ培养基上生长良好。生化反应：尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、Ｄ一核糖和麦芽糖等。

随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典犁细菌性疾病。西方发达国家在大量分离副猪嗜ｍ杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Ｋｉｅｌｅｔｉｎ—Ｒａｐｐ—Ｇａｂｒｉｄｅｓｏｎ（ＫＲＧ）琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜ｍ杆菌分为１５个血清型，另有２０％以上的分离株血清型不可定；根据德国、美国、加拿大、日本和两班牙等国家的血清流行病学调查，以血清型４、５和１３最为流行。

１．１ＨＰｓ分离鉴定与培养

副猪嗜血杆菌的生长依赖ＮＡＤ，对细菌的分离培养可按常规操作将病料接种于鲜血琼脂平板（在金黄色葡萄球菌划线附近生长），补充ＮＡＤ的ＰＰＬＯ液体培养基或巧克力琼脂平板。细菌的分离培养对确诊是必要的，但往往不能成功，这是冈为副猪嗜血杆菌十分娇嫩，相对于标本中可能同时出现的其它细菌，难以满足其生长需要。加拿大安大略省的诊断实验室用回归分析法（Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）分析表明副猪嗜血杆菌的真实发病率可能为报道的ｌＯ倍之多，部分原因是由于难以确认采集来的标本中是否存在副猪嗜血杆菌。副猪嗜血杆菌不易培养的特性经常影响这种细菌从临床样品的分离。对副猪嗜ＪｆＩＬ杆菌分离鉴定的研究表明使用平板稀释技术和在培养基中加入抗生素（例如林肯霉素和杆菌肤）可以提高从被污染病料中的细菌分离率。细菌分离鉴定时应当采集处于疾病６

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急性期的猪并且没有应用抗菌素的病料，最好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液，这样既可以减少杂菌的污染又可以增加分离到致病菌的机率。在送到诊断实验室之前接种到转移培养基上，也能由这种液体中获得副猪嗜血杆菌。有时其它的ＮＡＤ依赖的细菌（Ｌ类嗜血杆菌、猪放线菌、吲哚放线菌等）会被误认为副猪嗜血杆菌，这些细菌在鼻窦、扁桃体或肺脏中大量存在，但只有较低的毒力，因此在进行生化鉴定时需要特别注意与以上其它不溶血的Ｖ一因子依赖性细菌区分开来。

１．２ｔｉＰｓ菌体结构

副猪嗜血杆菌的芮体具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、丝状的菌体。副猪嗜血杆菌通常具有荚膜，但在体外培养时易受影响。Ｍｏｒｏｚｕｍｉ和Ｎｉｃｏｌｅｔ对分离自外观健康猪的鼻腔和分离自病理状态下的猪的不同副猪嗜血杆菌菌株进行比较，包括是否具有荚膜，在吖啶黄中或在煮沸后的细菌粘附能力，以及在聚丙烯酞胺凝胶电泳（ＡＰＧＥ）后的多肤图谱。通过十六烷溴化三甲铵（Ｃｅｔａｖｌｏｎ，塞太弗伦）处理，发光情况检测和荚膜染色等方式对荚膜进行检查，结果３２株分离自不同组织的副猪嗜血杆菌中有２０株具有荚膜。研究发现有荚膜的菌株更加趋向于球杆菌形态，相比之下那些不能检测出荚膜的菌株具有多种形态，具有从短杆菌到纤细的丝状菌的变化，其中后一种菌株吖啶黄染色或煮沸后粘附在一起。根据该抽提物电泳时向正极移动，并且经高压蒸汽灭菌，蛋白酶或胰酶处理后仍然稳定等特点，研究人员推测这些荚膜物质为酸性多糖。十六烷澳化三甲铵沉淀实验表明培养时间延长（４８ｈ）以后荚膜物质丢失。另外，所研究的这些菌株中有四分之一菌株的荚膜物质不能通过十六烷溴化三甲铵沉淀，由此表明它们的化学结构不同，还存在其它的多糖结构。可以和溴化三甲铵发生反应的有荚膜菌株的可溶性抗原有热稳定性并且可以抵抗蛋白水解酶，因此表明酸性多精的存在。吖啶黄染色阳性的菌株属于一种特定的ＡＰＧＥ图谱（ＩＩ型），这些菌株似乎比那些主要从表面健康猪群的鼻腔分离的有荚膜菌株更加与病理状态相关联。由此提出假设，在吖啶黄中的凝集能力连同ＡＰＧＥ图谱型ｒｌ型可能与毒力的特殊结构有关。除了与荚膜因素有关以外，副猪嗜血杆菌在鸡胚绒毛膜和尿囊膜培养时同样具有细丝状纤毛样的结构。

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及火活疫苗保护效力研究

巴斯德氏菌科中数种细菌的夹膜、纤毛和外膜蛋白（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＭＰ）与其在上呼吸道的定居有关，其中包括嗜血杆菌属的细菌。关于荚膜、菌体蛋白与副猪嗜血杆菌毒力之间的相关性仍争议。对副猪嗜血杆菌的菌体蛋白和外膜蛋白进行聚丙烯酞胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＡＩ，ＧＥ）的结果显示不同菌株之间的蛋白质图谱具有差异，在毒力和某种特定蛋白质之间可能存在着联系，潜在的致病性副猪嗜血杆菌分离菌株具有一群分子量主要在约３７ｋＤａ大小的蛋白质组，并将这些细菌分类为聚丙烯酰胺电泳（ＡＰＧＥ）ＩＩ型，而将缺乏这种特殊蛋白质组的副猪嗜血杆菌分离菌株分类为ＡＰＧＥＩ型。有一项研究中，分离自病料的菌株中有９０％以上属于ＡＰＧＥＩＩ型，而分离自鼻腔的菌株平均分布于ＡＰＧＥＩ型和ＡＰＧＥＩＩ型或者是四分之三为ＡＰＧＥＩ型而四分之一为ＡＰＧＥＩＩ型。这些结论在后来通过运用计算机对副猪嗜血杆芮茼体蛋白图谱的分析得到证实。Ｍｏｒｏｚｕｍｉ和Ｎｉｃｏｌｅｔ报道了分离白健康猪上呼吸道的大多数副猪嗜血杆菌具有荚膜，而从其它部位分离的菌株以无荚膜的占多数。但是，通过活体内传代的方法可筛选出荚膜化的副猪血杆菌克隆，而在培养基上经多次传代后有荚膜细菌的数量减少。聚丙烯酞胺凝胶电泳和单克隆抗体的免疫印渍试验还显示副猪嗜血杆菌的多糖具有多样性，有毒力菌株和无毒力菌株的脂多糖图谱相似，因此细菌脂多糖与其毒力之间是否有关系也还没有弄清楚。副猪嗜ｍ杆菌表面的细丝状结构是菌毛，细菌经活体内传代后形成纤毛样的结构，但其在粘附和致病方面的作用仍有待确认。由于从表面健康的鼻腔中普遍能分离出这种细菌，这对粘附于门户部位是细菌入侵开始的先决条这一经典概念提出了质疑。

１．３副猪嗜血杆菌的血清型

副猪嗜血杆菌血清型鉴定以传统方法的血清学（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ）方法为主，目前已经集中瓶清学实验可用于ｍ清型的鉴定，近年来，随着对该菌基因结构与功能的认识加深，已有不少学者尝试用ＰＣＲ进行进行基因分型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）。

１．３．１副猪嗜血杆菌血清学分型

大多数关于副猪嗜血杆菌的流行病学研究依赖于血清学分型。血清学分型传统上依赖于热稳定可溶性抗原和琼脂糖凝胶沉淀实验（ＡＧＰＴ），并己

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鉴定了１５种血清型。血清型４型和血清型５型在日本、德国、美围和西班牙田间分离株中最流行。澳大利哑分离株主要是血清型５型和血清型１３型。近来研究结果显示危害北美的ＨＰｓ血清型发生了改变。血清型４和未分型株（２７％）是美国猪场的最流行株，而血清型５不再是高流行株。副猪嗜血杆菌的未分型株很普遍，约占分离株的１５．２％～－－４１％。由于ＧＰＴ的局限性，建议用间接血凝（ＩＨＡ）和协同凝集试验（ＣＡ）作为血清学分型的替代。协｜一Ｊ凝集实验显示了交叉反应，而间接血凝有较高的特异性。通过问接血凝能将９０％以上的分离株进行血清分型，而ＧＩ，Ｔ只能达到６３％。Ｃ．Ｔｕｒｎｉ和Ｐ．Ｊ．Ｂｌａｃｋａｌ１用间接接血凝（ＩＨＡ）和琼脂扩散试验（ＧＤＴ）对副猪嗜血杆菌血清学分型进行比较。试验了１５个血清犁参考株、７２个澳大利亚分离株、９个中国分离株和７个来源于７个试验感染猪的分离株。用ＩｌｉＡ可以将１５个参考株中的１４个进行正确分型，将８５个分离株中的４５个进行血清学分型；而ＧＤＴ可以将１５个参考株中的１３个参考株进行正确分型，能将８１个分离株中的４８个进行血清学分型。有２９个分离株，ＧＤＴ和ＩＨＡ给出不一致的结果。因此，如果ＧＤＴ不能得到结果或交叉反应严重时，ＩＨＡ可以作为副猪嗜血杆菌血清学分型的一个很好的方法。

１．３．２副猪嗜血杆菌的基因分型

传统的血清分型方法足根据热稳定性可溶性抗原和琼脂扩散试验（ＧＤＴ），但是这种血清学分型方法仍然有１５．２％＇－－４０％的菌株不能分型。最近，多种基因分型方法应用于副猪嗜血杆菌的分型，基【大１分型的基本原理是基于相同菌株，而不同菌株则具有不用的ＤＮＡ指纹图谱。基因分型主要用以鉴别菌株问的差异，而不是用以确定不同菌株间的关系。其优点在于敏感性和特异性都较高，并且可将血清学方法不能分型的细菌进行归类。１．３．３肠杆菌科基因间重复（ＥＲＩＣ）

以肠杆菌科基因组问重复序列（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ

ＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＲｐｅｔｉｔｉｖｅＣｏｎｓｅｎｓｕｓ，ＥＲＩＣ）为引物的聚合酶链反应（ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）用于研究菌株之间的同源性。ＥＲＩＣ引物可直接扩增未知细菌的基因序列并产生具有菌株特异性的指纹图谱。该技术相对于血清分型用于菌株的描述和比较的区分能力更高。ＥＲＩＣ—ＰＣＲ可用于猪场内和猪场间副猪嗜血杆菌的流行病学研究。根据应用这种技术的研究结果表明，在发病猪场中只有几个９

德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及火活疫茁保护效力研究

（１～３）菌株与发病猪的死亡有关。此外，虽然危害美国猪场的副猪嗜血杆菌主要为血清型４的菌株，但经ＥＲＩＣ－ＰＣＲ检测，每个猪场都有一个不同的流行菌株。采用ＥＲＩＣ—ＰＣＲ对副猪嗜ｍ杆菌进行基因分型，要求使用细菌纯培养，抗生素的运用和该菌不易培养的特性都可能影响从临床病料分离这种细菌。

１．３．４重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）

重复序列ＰＣＲ（ｒｅｐ—ＰＣＲ）己被用于描述副猪嗜血杆菌分离菌株的多样性以及猪场内和猪场间副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究。ｒｅｐ—ＰＣＲ的原理是：设计与散在的重复序列互补的外向寡核普酸引物，进行ＰＣＲ对这些重复序列之间相应的不同长短ＤＮＡ序列进行扩增，产物经电泳后即可形成具有菌株特异性的ＤＮＡ指纹图谱。这些散在的重复序列中，有相当多的重复序列保存在不同种属的细菌，因此同一对引物可应用于多种不同的细菌。由于不同细菌菌株重复序列之间的ＤＮＡ序列长短不同，散在的重复序列探针和基因组指纹图谱可用于区分不同的细菌。自从ｒｅｐ—ＰＣＲ建立以后，重复性回文序列（ＲＥＰ）、ＥＲＩＣ以及ＢＯＸ序列已用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指纹图谱发获取ＥＲＩＣ—ＰＣＲ检测出相同血清型的菌株具有不同的基因型。

１．３．５限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）

现已建立一种聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）试验，作为副猪嗜血杆菌流行病学研究分型的另一种方法。以ＰＣＲ—ＲＦＬＰ法对编码转铁结合蛋白的基因ｈｔｐＡ进行分析从而对副猪嗜血杆前进行分型，结果表明１５种副猪嗜血杆菌标准菌株产生１２种不同的图谱。这些标准菌株中，血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切图谱。对１０１株副猪嗜血杆菌现场分离株的分型表现出３３种ＲＦＬＰ图谱，其中有１０株细菌与标准菌株产生的图谱一致。用琼脂扩散试验对６６个菌株进行血清型分型，发现其分属２５种ＲＦＬＰ群，表明在相同的血清型内具有遗传多样性，而２７株不能分型的菌株分属１４种不同的ＲＦＬＰ群。血清型与ＲＦＬＰ之间没有相关性。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型最为流行（占所研究菌株的２０．８％），其中包括血清型４、５、１３和１５以及不能分型的菌株。ｌＯ

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２流行病学

在分离的１５种血清型菌株中，保育猪发病率一般在１０％～１５％，严重时死亡率可达５０％。在应激情况下各年龄猪群都可发病，饲养环境不良、断乳、转群、混群或运输也是常见诱因。该病主要通过空气、猪与猪之间的接触或通过污染排泄物进行传播。病猪和带菌猪是该病主要传染源。在引进种猪时，副猪嗜血杆菌感染是个严重的问题。未免疫的猪场容易受到侵袭，首次感染该菌的猪，症状比较严重。

副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性。副猪嗜血杆菌主要存在于猪的上呼吸道、鼻腔、扁桃体和气管前段内，通过猪群间的接触和空气飞沫以及污染物而发，圭传播。带菌猪和慢性感染猪本病的传染源，副猪嗜血杆菌主要危害２周龄至４月龄的猪只，特别足断奶前后和保育期仔猪多发。通常见于５＂－８周龄，发病率一般在１０％＂５０％，病死率为５０％～９０％。

有些病原体可促进副猪嗜血杆菌的感染，已有证据表明，猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、呼吸道冠状病毒、肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、链球菌等都可促进或加重副猪嗜血杆菌的感染，而副猪嗜血杆菌的存在也会加剧原发病的临床表现，使病情复杂化，死亡率增加，经济损失更大。。该病常与ＰＲＲＳ并发，在猪群中存在ＰＲＲＳ感染时，副猪嗜血杆菌的分离率会增加，由副猪嗜血杆菌导致的死亡牢也大幅度增加。

各种应激冈素可诱发和促使本病的发生与流行，如气温突变、空气污染严重、通风不良、寒冷潮湿、不同日龄的猪只混群饲养、密度过大、管理不当、饲料质量差、长途运输等均可导致本病的发生。

引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌有３种，即胸膜肺炎放线杆菌（ＡＰＰ，过去称副溶血嗜血杆菌ＨＰ）、猪嗜血杆菌（Ｈｓ）和副猪嗜血杆菌（ｔｌａｅｍｐｏｈｉＪｕｓｐａＦａｓｕｉｓ，ＨＰｓ）。副猪嗜血杆菌自１９１０年以来就作为病原菌而被认为是猪Ｇｌａｓｅｓｒ病的病原体。然而，直到９０年代才对其发病和防制进行了深入研究。近年来，还从细菌性肺炎、化脓性支气管肺炎病变中分离至－ＩＪＮ猪嗜血杆菌，而且通常将此菌看作是继发性病原菌。在猪繁殖与呼吸综合征、ＩＩ型猪圆环病毒所致疾病（断奶猪多系统衰竭综合征）、伪狂犬病及猪流感等感染之后，这类菌分离的频率，甚至从浆液性一纤维蛋

德州地区副猪嗜血杆菌的分离举定及火活疫苗保护效力研究

白性多发性浆膜炎病例中的分离频率一直都在增高。按Ｋｉｅｌｓｔｅｉｎ—Ｒａｐｐ—Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ（ＫＲＧ）血清分型方法，目前副猪嗜血杆菌至少可分为１５个血清型，其中在德国４、５型最为流行，在澳大利亚５型、１３型最为流行，在美国５型最为流行。在我国，副猪嗜血杆菌在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，己从北京、黑龙江、辽宁、山东、河南、湖南、宁夏、湖北等省市分离出副猪嗜血杆菌。该菌引起的损失相当严重，如湖南某猪场，１９９９年发生该疾病后，母猪病死率３０％－－一４０％；仔猪病死率９０％以上；架子猪病死率２０％。然而，我国的地方分离株虽多次报道，但由于该菌的分离培养和保存极其困难，尚未有人对其进行过全面的生化鉴定，更未进行系统的血清分型研究。除了ＫＲＧ血清分型方法之外，研究者也尝试用整个细菌体裂解产物进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，对副猪嗜血杆菌进行分型，结果除ＫＲＧ血清型１型为ＳＤＳ—ＰＡＧＥＩＩ型外，其它血清型，如５型、６型、１０型均属ＳＤＳ—ＰＡＧＥＩ型。ＨＰｓ只感染猪，可以影响从２刷龄到４月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，通常见于５～８周龄，发病率可达４０％，严重时死亡率可达５０％。通常可从健康猪的鼻腔分泌液中分离出病菌，还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来。在分离的１５种血清型菌株中，１、５、１０、１２、１３、１４型毒力最强，患猪归于死亡或处于濒死状态；２、４、８、１５型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞；３，６，７，９和１１型毒力较低，患病猪没有明显的临床症状。此外，Ｍｏｒｏｚｕｍｉ等研究表明，２亿个ｌｉＰｓ可使小鼠致死，并能从肺脏中分离出ｌｉＰｓ；ｌ亿到１６亿个范围的ＨＰｓ可使豚鼠致死，并能从多个脏器甚至大脑中分离出ＨＰｓ，从而确立了小鼠和豚鼠可以作为ｌｉＰｓ研究的模型动物。最近的研究发现，ＨＰｓ感染猪时，伴随着急性和慢性肺炎症状。肺泡液中细胞囚子发生变化，在支气管接种ｌｉＰｓ２４ｈ后，血浆中白介素６的浓度迅速升高，从而影响了血细胞的功能。肺且庄的病变及多处器官的损伤严重阻碍了仔猪增重，也改变了育肥猪及肥猪的肉质性状。无论是急性感染造成的死亡还是慢性感染造成的增重缓慢，都会给猪场带来不少的经济损失。

３致病性与毒力１２

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副猪嗜血杆菌属巴氏杆菌科，其致病Ｉ大】子有很多，包括脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、神经氨酸酶，这些因子都可能引起疾病的发生。但是，副猪嗜血杆菌是否就产生这些毒力因子，以及它们与本菌的毒力是否有关，目前还知之甚少，彼此矛盾之处颇多。并且，人们尚不了解ＨＰｓ的基因组结构，更不知道它有哪些毒力因子和保护性抗原。零星的报道初步研究了外膜蛋白、菌毛和脂多糖在细菌感染与定植中的可能作用。最近Ｈｉｌｌ等用ＤＤＲＴ—ＰＣＲ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ

ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＤｉｓｐｌａｙＲｅｖｅｒｓｅＲｅａｃｔｉｏｎ）方法，以ＫＲＧ血清型５型为材料扩增Ｈｊ７条不同的差异表达基因片断，其中４条编码的氨基酸顺序分别与ｆａｄＤ（一个脂酞ＣｏＡ合成酶）、ａｐａＨ（二腺苷四磷酸酶）、ｐｓｔＩ（磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统的酶Ｉ）和ｃｙｓＫ（半肤氨酸合成酶）有很高的同源性，ｆａｄＤ，ｐｓｔｌＳＤｃｙｓＫ增量表达在２０倍以上，ａｐａｌｌ增量表达只有７倍。有证据表明这些蛋白在其它微生物的毒力上是重要的。同样的序列也在其他１４个血清型中存在，表明ｌｉＰｓ毒力可能与这些基因有关，但有待继续研究。

血清学分型通常要考虑到与毒力的关系，已通过接种ＳＰＦ动物或剖腹产初乳缺乏（ＣＤＣＤ）猪证明了１５种血清型中的不同血清型毒力存在差异。在这些研究中，一些血清型的菌株毒力非常强，而另一些血清型的菌株无毒力，分离的同一血清型野外菌株与标准菌株毒力一致，这表明血清型和毒力之间可能存在某种关系。ＳＰＦ猪腹腔内接种血清ｌ、５、１０、１２、１３矛ｌＪｌ４型以后在４日内发病或死亡，将这些细菌归类为高毒力芮株；接种血清２、４和１５型以后出现多发性浆膜炎但不致死，将这些细菌归类为中等毒力菌株；＋其它血清犁（３、６、７、８、９和ｌｌ型）接种ＳＰＦ猪后不出现临床症状，被认为没有毒力。

然而，副猪嗜血杆菌血清型与毒力之间并非存在着必然的联系，己有研究表明两个血清型均为１４型的菌株对ｉ！｝０腹产初乳缺乏（ＣＤＣＤ）猪的毒力不同，这表明存在着血清型之外的因子造成了菌株的毒力差异。对从病料分离的细菌的血清学分型表明，分离自呼吸道和分离自全身性组织的细菌当中血清２、４、５、１２、１３和１４型的菌株在数量上大致相等。最近对北美猪场的流行病学调查表明，分离自全身性组织的可疑致病性菌株为血清１、２、４、５、１２、１３和１４型，或者不能分型。从健康猪上呼吸道分离的

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菌株在遗传上同源（不同于分离自全身性组织的细菌），并且以血清３型和不能分型的菌株占多数。

３．１荚膜

荚膜抗原成分主要足多糖和磷壁酸，具有型特异性。据Ｌｉｔｔｌｅ以及Ｍｏｒｏｚｕｍｉ和Ｎｉｃ０１ｅｔ报道，分离自健康猪上呼吸道的大多数ｌｉＰｓ都有荚膜，而从其他部位分离的菌株以无荚膜的占多数。但是，通过活体内传代的方法可筛选出荚膜化的ＨＰｓ克隆，而在培养基上经多次传代后有荚膜细菌的数量减少。荚膜与其毒力之间的直接关系还有待进一步研究。

３．２脂多糖

菌体结构抗原包括外膜蛋白（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｒｔｅｉｎ，ＯＭＰ）和脂多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈｒｉｄｅ，ＬＰＳ）。ＬＰＳ可能是一个主要的毒力因子，血清ＬＰＳ似乎与ｊｆＩＬ栓形成、血管内凝集物的传播密切相关，其产生的超氧化物歧化酶有助于抗吞噬。Ｚｕｃｋｅｒ等研究了副猪嗜血杆菌合成的脂多糖，发现有毒力菌株和无毒力菌株的脂多糖成分相似。副猪嗜血杆菌经活体内传代后形成纤毛样的结构，但从表面健康猪的鼻腔中普遍能分离出这种细菌提出了这样一个问题：是否粘附于门户部位的经典概念是细菌入侵开始的先决条件。

３．３外膜蛋白

外膜蛋白（ＯＭＰ）与ｔｉＰｓ的毒力有关，健康仔猜与患病猪分离到的ｌｉＰｓ的ＯＭＰ不同，由多发性浆膜炎和关节炎症状的猪分离的ｔｉＰｓ的ＯＭＰ基本相同。应用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ技术发现，副猪嗜血杆菌的外膜蛋白（ＯＭＰ）具有２个完全不同的生物型：即生物１型和生物２型。由健康猪鼻黏膜分离到的菌株表达的是生物ｌ型ＯＭＰ，包括两个蛋白，其分子量一为约６８ｋｕ，另一蛋白的分子量在２３．－一４０ｋｕ之间。由副猪嗜血杆菌病病猪分离到的菌株通常含生物２型ＯＭＰ，其以约３７ｋｕ的优势蛋白为特征。后来，０１ｉｖｅｉｒａ平ＨＰｉｊｏａｎ通过全菌蛋白组分计算机分析证实了这些发现。

Ｍｃｖｉｃｋｅｒ等在副猪嗜血杆菌中发现了两个与流感嗜ｊｆＩＬ杆菌具有同源性的外膜蛋白Ｐ２矛ＨＰ５，该蛋白与细菌黏附有关，在毒力株和非毒力株中Ｐ蛋白的大小有所不同，在毒力株中为４８ｋｕ，而在非毒力株中却为５５ｋｕ，可通过Ｐ２蛋白来区分毒力株和非毒力株。

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３．４菌毛

Ｍｕｎｃｈ等证明，副猪嗜血杆菌在体内传代后能够生成菌毛样结构，但其致病作用不清楚。研究表明，ＨＰｓ血清５型Ｎａｇａｓａｋｉ株（从患脑膜炎病猪中分离），能够以非常高的水平黏附并侵入猪脑微血管内皮细胞（ＰｏｒｃｉｎｅｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌＳ，ＰＢＭＥＣ），电镜照片也证实了这种能力。比较从脑膜炎或肺炎病猪中分离的不同血清型ＩｔＰｓＸ寸ＰＢＭＥＣ的黏附和侵袭水平，发现血清４型和５型比其他血清型具有较高的黏附能力。抑制试验结果表明，ＨＰｓ侵袭ＰＢＭＥＣ需要肌动蛋白微丝和微管骨架重排，蛋白侵袭素在ＨＰｓ进入ＰＢＭＥＣ的过程中似乎并没有起到主要作用。侵袭血脑屏障的内皮细胞可能是ｔｔＰｓＺｊＩ起肺ｉ月莫炎的原因。

３．５转铁蛋白

铁是细菌生长不可缺少的元素，但是由于宿土糖蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白的络合作用，细菌外环境的铁含量很少。转铁结合蛋白（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｏｒｔｅｉｎ，ｔｂｐ）能够特异的捕获宿主的转铁蛋白，并将铁转运到细胞浆中，以提供细菌生长。Ｃｈａｒｌａｎｄ等证明猪血清中转铁蛋白受体的存在，并分析两种转铁结合蛋白（ｔｂｐ）的多肤结构。转铁结合蛋白由两种不同的蛋白构成，即转铁结合蛋白Ａ（ｔｂｐＡ）和转铁结合蛋白Ｂ（ｈｔｐＢ），它们对宿主的转铁蛋白具有特异性。ｈｔｐＡ很可能是一种穿膜蛋白，而ｈｔｐＢ靠Ｎ端脂肪酸残基镶嵌在外膜上，以提供细菌生长所需。通过ｔｂｐＡ和ｔｂｐＢ的协同作用，捕获宿主的转铁蛋白，通过ｔｂｐＡ把铁运送到外膜内并被胞浆周围的铁结合蛋白所结合。在ｔＰｂ的上游还有两个共转录基因ｅｘｂＢ、ｅｘｂＤ，表达产物ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ对于利用来自猪铁转运蛋白的铁必不可少。ｔｂｐ在ＨＰｓ感染宿主动物以引起发病起到决定性作用。３．６神经氨酸酶

神经氨酸酶是巴斯德菌科其它细菌的一种潜在的毒力因子，Ｌｉｃｈｅｔｎｓｔｅｉｇｅｒ和Ｖｉｍｒ的研究表明，９０％以上的田问分离菌株都产生神经氨酸酶（唾液酸酶），这种酶与透酶和醛缩酶协同作用，通过夺取宿主细胞的碳水化合物而增强细菌毒力。除了对营养方而的影响以外，神经氨酸酶还介导清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸，暴露出细菌与宿主细胞糖原结合的唾液酸，从而暴露出细菌定居或侵入宿主细胞所需的受体，并通过

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降低粘蛋白的粘性从而干扰宿主的防御系统。

４致病机理及病理变化

副猪嗜血杆菌病以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，而不具多发性浆膜炎的急性副猪嗜血杆菌性肺炎也有报道。副猪嗜血杆菌经常引起急性败血症，并且其内毒素可引起弥漫性血管内凝血，导致多个器官内形成微血栓。肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括腹膜、心包膜和胸膜，这些损伤也可能波及脑膜和关节表面，尤其是腕关节和跗关节。在显微镜下观察渗出物，可见纤维蛋白、中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。副猪嗜血杆菌也可能引起急性败血症，在尚未出现典型的浆膜炎时就呈现发绀、皮Ｆ水肿和肺水肿，甚至死亡。另据报道，副猪嗜血杆菌还可能引起筋膜炎和肌炎，以及化脓性鼻炎。Ｈｏｅｆｌｉｎｇ报道了原代ＳＩ，Ｆ母猪群与副猪嗜血杆菌相关的急性筋膜炎和肌炎，其中一头母猪发生急性化脓性下颌淋巴结炎，其炎性反应已波及咬肌肌束的肌外膜和肌内膜，咬肌和面颊部的浆液性纤维素性分泌物中含有大量中性粒细胞，淋巴细胞和巨噬细胞，并从中分离出副猪嗜血杆菌。ＳＰＦ猪经ｎ乎吸道感染后１６ｈ，精神变得沉郁，直肠温度稍ｕＬ高；３６ｈ后不愿行走：攻毒后６０～７０ｈ出现关节肿胀，粘膜化脓性渗出，随后卧地不起；攻毒８４～１０８ｈ后出现死亡。最早在攻毒后１２ｈ即可观察到肉眼病变，以中等量的胸水、腹水和心包液为特征；在攻毒后３６ｈ胸水、腹水和心包液中出现纤维块；在攻毒后９６ｈ和１０８ｈ剖检发现胸腔，腹腔和心包内含有大量机化的纤维素性化脓性分泌物。ＳＰＦ猪实验性感染后的血液学变化和微观病变表现为在感染后２４ｈ开始出现白细胞减少症，血糖下降，并且所有接种猪的凝血时间延长，纤维蛋白原一纤维蛋白性降解产物增加。从攻毒后１６ｈ开始血浆中检测出内毒素，并且在死亡前内毒素的浓度急骤上升。攻毒１６ｈ后从所自．接种猪的血液中分离到副猪嗜血杆菌。由于在肾脏、肝脏和肺脏中发现微血栓，研究人员推测弥漫性血管内凝血和内毒素性体克加重了具有败血症的仔猪的临床症状并加速其死亡。

为了阐明副猪嗜ＪｆＩＬ杆菌感染的发病机理，研究人员对人工接种模式进１６

ＩｌＩ东农、ＩＥ大学硕卜争业学位论文

行了改进。Ｖａｈｌｅ等人对剖腹产初乳缺乏猪鼻内接种猪嗜血杆菌的有毒菌株，观察此后的一系列反应。接种后１２ｈ即从鼻窦和气管内分离出了副猪嗜血杆菌；接种后３０ｈ，血液培养物中可以分离出该菌；接种后３６６．－１０８ｈ，全身各组织中可分离出该菌。由免疫组化法和透射电镜术证明在接种早期，鼻窦和气管中部和气管下部有细菌移生。这与化脓性鼻炎、病灶处纤毛丢失以及鼻粘膜和气管粘膜细胞的急性肿胀有关。将鼻甲移出体外接种该菌，也引起了纤毛活动的显著降低和纤毛上皮的损伤。研究者们观察到，副猪嗜血杆菌优先在鼻窦和气管内寄生，而不是在扁桃体内，这与该莳从鼻窦而不足从扁桃体或肺标本中分离出来的结果相一致。与此相反，有报道指出，用过氧化物染色法和电镜观察法检测，副猪嗜血杆菌抗原存在于扁桃体组织中而不是在鼻窦中。

副猪嗜血杆菌感染后侵入全身的因素多不清楚。Ｖａｈｌｅ等研究表明从鼻腔的中部分离的副猪嗜血杆菌与急性化脓性鼻炎，急性鼻腔和气管粘膜细胞的肿胀以及纤毛丢失有关，并推断这些粘膜的变化可能使副猪嗜血杆菌侵入机体并进入血液循环，但透射电子显微镜和免疫组化的结果均未显示纤毛丢失和细胞变性的部位有副猪嗜血杆菌。作者推测一种副猪嗜血杆菌的可溶性毒素可能与所观察到的细胞病变有关。在一个猪群中，副猪嗜血杆菌的毒力是影响全身性疾病严重程度和发生发展的因素。通常可以从猪上呼吸道分出该菌的一些血清型，这其中包含了一些很少能从全身其它各部位分离出的血清型。呼吸道中可能存在副猪嗜血杆菌的亚类，这些细菌能够侵入猪的全身并引发疾病。一些研究表明，从浆膜炎中分离出的菌株，各血清型之问有着明显的联系。粘膜损伤可能会增加细菌入侵的机会。目前尚不清楚有关全身感染和宿主因素的关系。然而，一些菌株的毒力是相当强的，气管内接种不足１００菌落形成单位（ＣＦＵ），就会引起全身病变，对于剖腹产初乳缺乏猪则会导致几天内死亡。在猪感染的早期，菌血症十分明显，肝、肾和脑膜上的癖斑和癖点构成了败血症损伤；血浆中可检测到高水平的内毒素，许多器官出现纤维蛋白性血栓。细菌随后在多处浆膜表面的繁殖导致典型的纤维蛋白化脓性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，这在自然感染的病例中可以观察到。肺炎在应激模型中并不明显，甚至即使副猪嗜血杆菌由肺分离出来，该猪的肺炎症状也不明显。研究结果表明

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导致肺炎的副猪嗜血杆菌毒力不同，是由于不同的动物感染模型，感染菌量以及感染菌株的差异引起的。Ｖａｎｉｅｒ等的研究表明副猪嗜血杆菌可侵入血脑屏障的毛细血管内皮细胞，对其引起猪的脑膜炎起重要作用。抑制试验研究表明副猪嗜血杆菌侵入脑血管内皮细胞需要其肌动蛋白纤维和微管细胞骨架元件的结构变化，而非活细菌ＤＮＡ、ＲＮＡ或蛋白质的合成；描述试验研究表明蛋白质侵袭素在副猪嗜血杆菌侵入脑毛细血管内皮细胞方面不起主要作用。即使是大剂量细菌，副猪嗜血杆菌财脑毛细血管内皮细胞仍然没有毒性。副猪嗜血杆菌在呼吸道疾病中的作用机制尚不清楚。化脓性鼻炎的发生与副猪嗜血杆菌有关联，这说明了其作为一种预先影响的囚素，对其它病毒或病原荫可能有作用。在肺炎中，副猪嗜血杆菌被假定为一种随机入侵的次要病原，只有在与其它病毒或细菌协同时才引发疾病。然而，一些最新的报道指出，副猪嗜血杆菌可能是引起纤维素性化脓性支气管肺炎的原发因素。

关于副猪嗜血杆菌与其它猪病的混合感染及其相互影响已得到研究。Ｎａｒｉｔａ等研究了伪狂犬病毒（ＰＲＶ）与血清４型副猪嗜血杆菌混合感染所引起的猪肺炎，猪感染伪狂犬病毒后发生坏死性支气管炎和肺泡炎；伪狂犬病毒抗原密集出现于坏死灶的中央，并且有时被大量的副猪嗜血杆菌抗原所包闸。伪狂犬病毒的感染可能破坏了呼吸道表皮细胞，使副猪嗜血杆菌得以在肺脏中大量繁殖。副猪嗜血杆菌与支原体结合在一起，从忠猪繁殖与呼吸综合征猪肺的检出率为５１．２％。但易感猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）后再经气管内接种副猪嗜血杆菌与仅仅接种副猜嗜血杆菌的实验组相比，并没有增加细菌性多发性浆膜炎的严重程度。对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染是否影响猪肺泡巨噬细胞（ＡＰＭＳ）清除副猪嗜血杆菌的研究表明，将仔猪短时间暴露于该病毒后肺泡巨噬细胞对副猪嗜血杆菌的摄入不受影响。不过，在感染后期（１６８和２１６ｈ），猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后，猪肺泡巨噬细胞被激活后杀死副猪嗜血杆菌以及产生超氧化阴离子的能力显著降低。肺泡巨噬细胞在体外实验性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌后的超微结构分析表明，双重感染细胞的吞噬体和溶酶体数目下降，但猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对肺泡巨噬细胞吞噬副猪嗜血杆菌的作用没有显著影响。Ｓｅｇａｌｅｓ等采用免疫组化研究了猪繁殖

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