第六章 微生物的生长繁殖及其控制

第六章 微生物的生长繁殖及其控制

计划学时：5

重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义。控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理。

微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分(constituent)与结构在量方面的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形式两个基本相的子细胞，子细胞又重复以上过程。在单细胞微生物中，由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖。在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。 在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。

微生物处于一定的物理、化学条件下,生长、发育正常，繁殖速率也高；如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。 第一节细菌纯培养的群体生长规律

大多数细菌的繁殖速度都很快。大肠杆菌的适宜条件下，每20分钟左右便可分裂一次，如果始终保持这样的繁殖速度，一个细菌48个小时内，其子代总重量可达2.2×10 31克，这是一个巨大的数字。然而，实际情况是不可能的。那么，细菌的群体生长规律到底怎样呢? 一、细菌纯培养的群体生长规律

将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，继而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到如图6-6的曲线，称为繁殖曲线，对单细胞微生物而言，虽然生长和繁殖是两个不同的概念，但由于在测定方法上，多以细菌数增加(即繁殖)作为生长指标，它们的繁殖也可视为群体的生长，所以，繁新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期。

（一）延迟期 处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。细胞体积增长较快，尤其是长轴，例如巨大芽孢杆菌，在延迟期末，细胞平均长度比刚接种时大6倍以上；细胞中RNA含量增高，原生质嗜碱性加强；对不良环境条件较敏感，对氧的吸收、二氧化碳的释放以及脱氨作用也很强，同时容易产生各种诱导酶等。这些都说明细胞处于活跃生长中，只是细胞分裂延迟。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。 延迟期出现的原因，可能是为了调整代谢。当细胞接种到新的环境(如从固体培养接种至液体培养基)后，需要重新合成必需量的酶、辅酶或某些中间代谢产物，以适应新的环境。 延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需几分钟，长的可达几小时。因此，深入了解延迟期产生的原因，采取缩短延迟期的措施，在发酵工业上具有十分重要的意义。在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。

在延迟期末，每个细胞已开始分裂，但并非所有的机体都同时结束这一时期，所以细菌数逐渐增加，曲线稍有上升，直至这一阶段结束，进入下一阶段。

(二) 对数期(log phase) 对数期又称指数期(exponential phase)。在此期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。这时，细菌纯培养的生长速率也就是群体生长的速率，可用代时(generation time)表示。所谓代时，即单个细胞完成一次分裂所需的时间，亦即增加一代所需的时间(也叫增代时间或世代时间)。在此阶段，由于代时稳定，因此，只要知道了对数期中任何两个时间的菌数，就可求出细菌的代时。

单细胞微生物，在对数期细胞数据按几何级数增加，1→2→4→8→……，若以乘方的形式表示，即2→2→2→2→2。很清楚，这里的指数\就是细菌分裂的次数或增殖的代数。也就是1个细菌繁殖\代产生了2个细菌。如果在时间t 0时菌数为x，经过一段时间，到t1时，繁殖\代后，菌数为y则代时(G)可以下式表示： 例如，设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100/个ml，经400分钟的培养，细胞浓度增至10ml，求该菌的世代时间和繁殖代数。 根据公式 G=t1-t0/3.3(lgy-lgx) t0为接种的时间 x=100 t1为培养时间(400分钟) y=1，000，000，000

n=3.3(lg10-lg10)=3.3×7=23.1 代入上式 G=400/23.1=17.3

即在上述培养物中，大肠杆菌的代时为17.3分钟，400分钟内共繁殖了23.1代。

不同的细菌，其对数期的代时不同，同一种细菌，由于培养基组成和物理条件的影响，如培养温度、培养基pH、营养物的性质等，代时也不相同。但是，在一定条件下，各种菌的代时又是相对稳定的，多数种为20-30分钟，有的长达33小时，而有的繁殖极快，增代时间只9.8分左右。表6-4示不同细菌的代时。 处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，所以是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，如果用作菌种，往往延迟期很短以至检查不出，这样可在短时间内得到大量微生物，以缩短发酵周期。 (三) 稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。

在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。

此阶段初期，细菌分裂的间隔时间开始延长，曲线上升逐渐缓慢。随后，部分细胞停止分裂，少数细胞开始死亡，致使细胞的新生与死亡速率处于动态平衡。这时培养物中细胞总数达到最高水平，接着死亡细胞数大大超过新增殖细胞数，曲线出现下降趋势。

稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。 从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为

9

2

n

0

1

2

3

n

产量常数，可用下式表示：

γ=菌体总生长量/消耗营养物质总量

式中γ值的大小可说明该种细菌同化效率的高低。根据这一原理，可用适当的微生物作为指示，对维生素、氨基酸或核苷酸等进行定量的生物测定。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关。生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

(四) 衰亡期(decline hpase) 稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了\负生长\，此阶段叫衰亡期。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称之为\对数死亡阶段\。这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。在学习细菌生长曲线的有关知识时，应注意各生长期之间的过渡阶段。从图6-6可以看到培养物是逐步地从一个生长期进入到下了个生长期的。也就是说，并不是所有细胞在接近某一生长期的末尾时均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长的整个周期，细菌数和培养时间，若以线性关系表示，往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线，而不是一个阶段分明的直线。

认识和掌握细菌生长曲线，不仅对指导发酵生产具有很大作用，而且对科学研究也是十分必要的。例如，为了得到研究材料，往往少不了要预计一细胞群体生长到一定数量水平需要多长时间，这就必须计算生长速率和代时。另外，正确认识正常生长曲线的完整意思也很重要，在某个生长时期细胞年幼而代谢活跃，哪个时期细胞老化并濒于死亡，因不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解了这些，就能根据需要进取样和收获。同时，在不同的生长期里理化因子对微生物的影响了可能不同。一般来说，对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。 二、微生物生长的测定

微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，测定它们的生长不是依据细胞个体的大小，而是测定群体的增加量，即群体的生长。例如用直接或间接的方法测定群体的增加量；或测定群体的原生质量；或测定细胞中某些生理活性的变化等。就一般单细胞微生物而言，尤其在对数生长期，像细菌的生长量与细菌的数目之间完成是一种正比例关系。因此，某些情况下，细菌的数目就表示了它的生长量。测定生长量的方法很多，概括起来有以下几种。

(一) 直接计数法(又称全数法)

1. 涂片染色法 将已知体积的待测材料，均匀地涂布在载玻片的已知面积上，经固定染色后，在显微镜下计算染色涂片上的细菌数。一般在载玻片一平方厘米的面积上，均匀涂布0.01毫升样品。很显然，在显微镜下要观察整个涂布区域是较困难的，因此，人们常常任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞的数量。如果借助镜台测微尺测得视野的直径，就可计算了。视野的面积(面积=πr2，r为视野的半径)，然后用一平方厘米内的视野数乘以每个视野中的细胞平均数，再乘以100(因只用了0.01毫升样品涂布)，就等于每毫升菌液的细胞数。其计算公式如下：

每毫升原菌液含菌数=视野中的平均菌数×1cm 2/视野面积×100×稀释倍数

2.计数器测定法 用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数。取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内。由于计数室的容积是己知的(总面积为1平方毫米，高0.1毫米)，并有一定刻度。因此，可根据计数器刻度内的细菌数，计算出样品中的含菌数。

根据计数器小格数目的不同，可概括成两个换算公式：

(1) 16个中格×25个小格的计数器：每毫升原菌液含菌数=100小格内菌数100×400×10，000×稀释倍数

(2) 25个中格×16个小格的计数器：每毫升原菌液含菌数=小格内菌数80×400×10：000×稀释倍数

上述两种计数器有一个共同特点，即每一个大方格均由16×25=400个小方格组成，故可将上面两个公式归纳成一个通式：

每毫升原菌液含菌数=每小格平均菌数×4，000，000×稀释倍数

3.比例计数法 将待测的细菌悬液与等体积血液混合后涂片，在显微镜下可以测得细菌数与红细胞数的比例。由于每毫升血液中红细胞数是已知的，如正常的男性每立方毫米血液中约含400-500万个，女性约为350-450万个。这样，通过细菌数与红细胞数的比例，就可计算出每毫升样品中的细菌数。如果测定空气和水中的微生物时，由于含菌数低，需将一定体积的样品通过特制的滤器进行浓缩。

上述三种方法都属于显微镜直接计数法。这些方法虽然较麻烦，但在许多有关微生物生长的研究工作中却很重要。然而也有一定的局限性，主要表现在：死、活细胞不易区分；小的细胞很难在显微镜下观察，有一些细胞可能被遗漏；浓度太低的细胞悬液也不能使用此法，可以计数的最低的群体细胞数与细胞大小有关，就大多灵敏细菌而言，群体数必须每毫升悬液中含菌10 6个以上；精确性也较差。

4.电子自动计数器计数法 电子计数器的工作原理，就是测定一个小孔中液体的电阻变化。 电子自动计数器具有一个特制的有孔玻璃薄膜，当定量的细胞悬液中的菌体高速地通过小孔时，由于悬液与菌体的导电性不同，使得小孔的电导下降，电阻强率明显增加，并形成一个脉冲，自动记录在电子记录尺标装置上。这样，一份已知体知的含有待测细胞的菌悬液，让其通过这一小孔，每当一个细胞通过时就就产一个脉冲被记录下来。此设备可以高速测定菌数，而且结果也较精确。但是电子计数器不能区别其他颗粒，因此，菌悬液中应无其他碎片。

5.比浊法 这是测定悬液中细胞数的快速方法。其原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。菌体是不透光的，光速通过菌悬液时则会引起光的散射或吸收，从而降低透光量。细菌越多，透光量越低。因此，测定菌悬液的光密度或透光度可以反映细胞的浓度。而光密度或透光度又可借光电池精确地测得。然后将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬 液相比，可以从已知悬液的稀释倍数，求出未知悬液所含的细胞数。此法比较简便。但使用时必须注意：样品颜色不宜太深；样品中不要混杂其他物质，否则不能使用；同时菌悬液浓度必须在10 7/毫升以上才能显示可信的混浊度。 (二) 间接计数法(又叫活菌计数法)

直接计数法测定的是死、活细胞总数。在多数情况下，人们所关心的是计算活菌数。间接计数法是基于每个分散的有机体在适宜的培养基中具有生长繁殖的能力，并且一个活细胞能形成一个菌藩。因此，菌落数就是待测样品的含的活菌数。此法所得的数值往往比直接法测定的数字小。

1.平皿菌落计数法 像稀释平皿分离法一样，先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间。然后将最后三个稀释度的稀释液各取一定量(一般为0.2毫升)与融化并冷至45℃左右的琼脂培养基一起，倾入无菌平皿中摇匀，静置，待凝固后进行保温培养，通过平皿上出现的菌落数，便可推算出原菌液含菌数。计算公式： 总活菌数/毫升=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

此法由于个人掌握程度的不同，结果常不稳定。其成败关键在于应使样品充分均匀，而且每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管，以减少吸管壁因存在油脂等物粘上细菌而影响计数的精确度(否则，有时误差高达15%左右)。为克服这一弱点，近年来有人对此法作了改进。

他们认为，对原菌液浓度为10-9/毫升的微生物来说，如果第一次稀释采用10-4级(即用毛细吸管吸菌液10微升至100毫升的无菌水中)，第二次稀释则采用10-2级(即吸1毫升上述稀释菌液于100毫升无菌水中)，然后再吸0.2毫升此菌液进行平皿菌落计数(采用表面涂布法)，其结果较为精确可靠(图6-4)。

平皿菌落计数法是教学、生产、科研中最常见的一种活菌计数法。它不仅适用于多种材料，而且，即使样品中含菌数量极少也可以测出。常用于测定水、土壤、牛奶、食品及其他材料中的活菌数。必须注意的是：并非所有生活有机体都要在实验条件下或实验期间内生长并形成菌落，如果在待测样品中含有不同生理类型的有机体时更是如此。此外，意外的损伤也可导致菌数减少，例如有些细菌，可能在稀释和倾倒平皿等过程中遭到损伤，造成人为的误差。处于融化状态的琼脂培养基温度较高，某些易受热力影响的微生物往往不能存活；加之人们无法看出产生菌落细胞，因而不能绝对肯定一个菌落仅来源于一个细胞，以致造成实验误差。 2.稀释法 奖待测样品作一系列稀释，一直稀释到该稀释液的少量(如1毫升)接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度(即临界级数)，再用\或然率\理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体的说，菌液经多次稀释后，一定量菌液中可以极少甚至无菌，然后将待测液于液体培养基中，按十倍稀释度作一系列稀释，每个稀释度取3-5次重复，培养后，将有细胞生长的最的三个稀释度中的出现细菌生长的管数作为数量指示，由统计分配表(表6-2)上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。例如：某一细菌在稀释法中的生长情况如下：

根据上述结果，其数量指标为\，查统计分配表得近似值为17。然后乘以第一位数的稀释倍数(10-5的稀释倍数为100，000)。那么，原菌液中的活菌数=17×100，000=10 5。即每毫升原菌液中含活菌数为1，700，000个。统计分配表根据重复次数不同分为三次重复测数统计表，四次重复测数统计表和五次重复测数统计表(又称五管最或然数表)。

在实践中，通常以五管重复为一个组，故这里仅列出了五次重复测数统计表。只要知道了数量指标，就可查知近似值。

例1 经巴斯德消毒的牛奶样品作10 0、10-1、10-2稀释，每个稀释度作五管重复，每个重复管中加入1ml小份样品接种，培养后，100五管均出现生长10-1有三管生长，而10-2没有生长，其数量指标为530，从表6-2查出近似值是7.9，则每毫升牛奶含活菌为：7.9×10个。

例2 牛奶样品作10-3、10-4、10-5稀释，同上法各取五个1毫升小份稀释的样口接种，经培养，10-3有四管生长，10-4有两管生长，而10-5没有生长。其数量指标为420。从表6-2查出近似值是2.2，由于数量指标的第一位数的稀释倍数是1，000，故每毫升牛奶中含活菌为：2.2×10 3个。此方法只有因某种原因不能使用琼脂平皿菌落计数时才采用。 从前面可看出，活菌计数法尽管有一定的局限性，但它却能提供其他方法不能获得的资料，所以在食品、奶品、医学及卫生微生物学中经常采用。为了消除上述方法的复杂性，现在不论是培养基、培养条件或是稀释方法、计算方法，以及结果分析和解释等方面，通过多年的实践，都制订了严格的标准。

如果测定量大而且含菌浓度很低样品(如空气、水等)中的活菌数时，则应将待测样品通过微孔薄膜(如硝化纤维素薄)过滤浓庥，再与膜一起放到培养基或浸透了培养液的支持物表面培养，然后根据菌藩数推知样品含菌数。 (三) 测定细胞物质量

1.测定细胞总含氮量来确定细菌浓度 蛋白质是细胞的主要物质，含量比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组成。其方法要点：从一定量培养物中分离出细菌，洗涤，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法法测定总含氮量，以表示原生质含量的多少。一般细菌的含氮

量约为原生质干重的14%。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：

蛋白质总量=含氮量%×6.25

此法只适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，故主要用于科学研究。

2.DNA含量测定法 利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的。将一定容积培养物的菌悬液，通过荧光反应强度，求得DNA的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据DNA含量计算出细菌的数量。因为每个细菌平均含DNA8.4×10-5纳克。

3.测定细胞干重法 单位体积培养物中，细胞的干重可用来表示菌体的生长量。将单位体积培养液中的菌体，以清水洗净，然后放入干燥器内加热或减压干燥。其菌体干重可直接用精密仪器测定。一般来说，细菌的干重约为湿重的20-25%，即1毫克干菌体=4-5毫克湿菌体=4-5×10 9个菌体。此法较为直接而又可靠，主要用于调查研究。但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中不含非菌体的干物质。

4.基他生理指标测定法 微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质，以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢产物也多。例如通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量、或测定谷氨酸在氨基脱羧酶作用下产生CO2的多少来推知细菌生长情况。这是一种间接方法。使用时必须注意：作为生长指标的那些生理活动项目，应不受外界其他因素的影响或干扰。 可以看出，每种方法都各有优点和局限性。只有在考虑了这些因素同要着手解决的问题之间的关系以后，才能对具体的方法进行选择。正如前面说过的，平皿菌落计数法是微生物学中应用最多的常规方法，掌握这一方法的原理和实际操作，很有必要。但此法在理论上仅能反映活细胞数。另外，当用两种不同的方法测量细菌的生长量时，其结果不一致是完全可能的，例如对静止期培养物进行显微镜计数时比平皿菌落计数法所得的数字高得多，因前者包括所有的活细胞与死细胞。而后者只能反映出活细胞数。 测定微生物生长量，在理论研究和实际应用中都十分重要。当我们要对细菌在不同培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时，就必须用量的术语来表示生长。例如，可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。生长快的条件，最终的细胞总收获量可能没有另一些条件下的收获量大。在另一些条件下，生长速率虽然较低，但它却可在一段较长的时间内不断增加。这种情况可用衅6-5表示。这是同一种菌在两种不同的培养基上生长情况的比较。这种菌在两种培养里都能生长。假如在A时测量生长，可以断定在培养基Ⅱ里生长快；若在B时测量，则在两种培养基上都生长得很好；可是在C时测量，却在培养基Ⅰ里生长好些。据此，我们就可以根据需要进行选择了。如果培养目的是要机体生长得早而快，就选用培养基Ⅱ；如果是要得到大量的细胞，就应选用培养基Ⅰ。因此，只有具备了有关生长的定量方面的知识，才能在实际应用中作用正确的选择，以利科研和生产。 三、连续培养

将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(batch culture)。通过对细菌纯培养的生长曲线的分析可知，在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长，培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流支量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。50年代出现的连续培养(continuous cultivation)技术就是据此原理而设计的，这种方法就叫连续培养法。连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。

最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入，培养物流出)的控制系统，必要时还装有通气、搅拌设备。连续培养装置的一个主要参数是稀释率(D)，它的定义为：D=FV=流动速率容积。控制连续培养的方法主要有两种： (一)恒浊连续培养

不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养，如图6-7，A。在恒浊连续培养中装中浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并由光电效应产生的电信号强弱变化，来自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。当培养室中浊度超过预期数值时，流速加快，浊度降低；反之，流速减慢，浊度增加，以此不维持培养物的某一恒定浊度。如果所有培养基中有过量的必需营养物，就可使菌体维持最高的生长恒浊连续培养，可以不断提供具有一定生理状态的细胞；可以得到以最高生长速率进行生长的培养物。在微生物工业中，为了获得大量菌体以及菌体相平行的代谢产物时，使用此法具有较好的经济效益。

(二)恒化连续培养 控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养。已知营养物黉度对生长有影响，但营养物浓度高时并不影响微生物的生长速率，只有在营养物浓度低时才影响生长速率，而且在一定的范围内，生长速率与营养物的浓度成正相关，营养物浓度愈高，则生长速率也高。

恒化连续培养的培养基成分中，必须将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着细菌的生长，限制固子的浓度降低，细菌生长速率受到限制，但同时通过自动控制系统来保持限制因子的恒定流速，不断予以补充，就能使细菌保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制的限制性营养物进行恒化连续培养，可以得到不同生长速率的培养物。 能作为恒化连续培养的限制因子的物质很多。这些物质必须是机体生长所必需的，在一定浓度范围内能决定该机体生长速率的。常用的限制性营养物质有作为氮源的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；以及生长因子、无机盐等。

恒化连续培养方法，多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲，它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤其是DNA、RNA及蛋白质合成的变化；同时它也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生物一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自然条件相类似。

连续培养法用于工业发酵就称为连续发酵(continuous fermentation)。我国已用于丙酮-西醇的发醇生产中，缩短了发酵周期，效果良好。在国外应用更为广泛。连续发酵的最大优点是取消了分批发酵中各批之间的时间间隔，从而缩短了发酵周期，提高了设备利用率。另外，连续发酵便于自动控制，降低动力消耗及体力过去强度；产品也较均一。但连续发酵中杂菌污染和菌种退化问题仍较突出，代谢产物与机体生长不呈平行关系的发酵类型的连续培养技术，也有待研究解决。 四、同步生长

如上所述，在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，也就是说，培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。例如，在一支试管或摇瓶中研究某种微生物的生长、生理生化特性，其结果实际上是培养物中所有微生在某一阶段时间内的总和。很显然，如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解

决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。

能使培养的微生物处于比较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法；利用上述实验室技术控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有的细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长；用同步培养法所得到的培养物叫同步培养或同步培养物。这样就可以用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。 获得同步培养的方法很多，最常用的有以下几种：

(一)机械法 (又称选择法)

1.离心沉降分离法 处于不同生长阶段的细胞，其个体大小不同，通过离心就可使大小不同的细胞群体在一定程序上分开来。有些微生物的子细胞与成熟细胞大小差别较大，易于分开。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。

2.过滤分离法 应用各种孔径大小不同的微孔滤膜，可将大小不同的细胞分开。例如选用适宜孔径的微孔滤膜，将不同步的大肠杆菌群体过滤，由于刚分裂的幼龄菌体较小、能够通过滤孔，其余菌体都留在滤膜上面，将滤液中的幼龄细胞进行培养，就可获得同步培养物。

3.硝酸纤维素薄膜法

A.将菌液通过硝酸纤维素薄膜，由于细菌与滤膜带有不同电荷，所以不同生长阶段拓细菌均能附着于膜上；

B.翻转薄膜，再用新鲜培养液滤过培养；

C.附着于膜上的细菌进行分裂，分裂后的子细胞不与薄膜直接接触，由于菌体本身的重量，加之它所附着的培养液的重量，便下落到收集器内；

D.收集器在短时间内收集的细菌处于同一分裂阶段，用这种细菌接种培养，便能得到同步培养物。

机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的生命活必然较为正常。但此法有其局限性，有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采用这类方法。 (二)调整生理条件的同步法

调整生理条件的同步法又称诱导法，主要通过控制环境条件如温度、营养物等来诱导同步生长。

1.温度调整法 将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，它们将缓慢地进行新陈代谢，但又不进行分裂。换句话说，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。人们利用这种现象已设计出多种细菌和原生动物的同步培养法。

2.营养条件调整法 即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同步生长。对营养缺陷型菌株，同样可以通过控制它所缺乏的某种营养物质而达到同步化。例如大肠杆菌腺嘧啶(thymine)缺陷型菌株，先将其培养在不含胸腺嘧啶的培养基内一段时间，所有的细胞的分裂后，由于缺乏胸腺嘧啶，新的DNA无法合成而停留在DNA复制前期，随后在培养基中加入适量的胸腺嘧啶，于是所有的细胞都同步生长。

诱导同步生长的环境条件多种多样。不论哪种诱导因子都必须具有以下特性：不影响微生物的生长，但可特异性地抑制细胞的分裂，当移去(或消除)该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。研究同步生长诱导生的作用，将有助于揭示微生物细胞分裂的机制。 3.用最高稳定期的培养物接种。从细菌生长曲线可知，处于最高稳定期的细胞，由于环境条

件不利，细胞均处于衰老状态，如果移入新鲜培养基中，同样可得到同步生长。

除上述三种方法外，还可在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质(如氯霉素)，诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用紫外线处理；对光合性微生物的菌体可采用光照与黑暗交替处理办法等，均可达到同步化的目的。芽孢杆菌，则可通过诱导芽孢在同一时间内萌发的方法，以得到同步培养物。

不过，环境条件控制法有时会给细胞带来一些不利的影响，打乱细胞的正常代谢。

(三)抑制DNA合成法 DNA的合成是一切生物细胞进行分裂的前提。利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤(amethopterin)、5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。1969年有人就进行了成功的试验，他在细胞的无性繁殖系的组织培养中，用10-6 mol/L的氨甲蝶呤或5-氟脱尿苷处理培养物，在16小时内可以抑制DNA的合成。这种药物主要通过抑制胸腺核苷酸合成酶而阻碍胸腺核苷酸的合成。当加入4×10-6 mol/L胸腺苷至培养物中，便能解除这种抑制，细胞即可进行同步化生长。

总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少，但对那些即使是相同的成熟细胞，其个体大小差异悬殊者不宜采用；而诱导同步分裂虽然方法较多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。因此，必须根据待试微生物的形态、生理性状来选择适当的方法。

应该明确，同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于由步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2-3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化，图6-9清楚地表明了这一点。

第二节 物理、化学因素对微生物生长与死亡的影响

生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，可能上能引起微生物形态，生理、生长、繁殖等特征的改变；或者抵抗、适应环境条件的某些改变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也使人们有可能制订增订增进或降低、甚至完全破坏微生物生命活动的有效措施。

本节将较多地涉及各种物理、化学因素对微生物生长的抑制与致死的影响，以及它们在实践中应用。先介绍几个有关的术语。

防腐 它是一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长、繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。

消毒 是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。例如将物体煮佛(100℃)10分钟或60-70℃加热处理30分钟，就可杀死病原菌的营养体，但绝非杀死所有的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。利用具有消毒作用的化学剂(又叫消毒剂，disinfectant)，也可进行皮肤、体膜或体内的处理。

灭菌 是指用物理或化学因子，使非于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施。通过灭菌的物品不再存在任何有生命的有机体。

化疗 是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。 死亡 对微生物来说，就是不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。要直接判断非活动细胞和死亡细胞是较困难的，因它们的形态、染色特性以及酶活力等方面，可能有所不同，也可能差别不大，因此，在检查理化因素对微生物的致死作用时，

通常是将处理后的微生物接种到适宜的固体或液体培养基中，看其能否再生长繁殖为标志。 必须明确：不同的微生物对各种理化固子的敏感性不同；同一因素不同剂量对微生物的效应应也不同，或者起灭菌作用，或者可能只起消毒或防腐作用。有些化学因子，在低浓度下是微生物的营养物质或具有刺激生长的作用。在了解和应用任何一种理化因素对微生物的抑制或致死作用时，还应考虑多种因素的综合效应。例如在增高温度的同时加入另一种化学药剂，则可加速对微生物的破坏作用。大肠杆菌在有酚存在的情况下，温度从30℃增至42℃时明显加快死亡；微生物的生理状态也影响理化因子的作用。营养细胞一般较孢子抗逆性差，幼龄的、代谢活跃的细胞较之老龄的、休眠的细胞易被破坏；微生物生长的培养基以及它们所处的的环境对微生物遭受破坏的效应也有明显的影响。如在酸或碱中，热对微生物的破坏作用加大，培养基的粘度也影响抗菌因子的穿透能力；有机质的存在也干扰抗微生物化学因子的效应，或者由于有机物与化学剂结合而使之失效，或者有机质覆盖于细胞表面，阻碍了化学药剂的渗入。

一、温 度

温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。从表6-5和图6-11就可看出这一关系。 就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。

最低生长温度 是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长完全停止。不同微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质的物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而改变。

最适生长温度 使微生物迅速生长繁殖的温度叫最适生长温度。不同微生物的最适合生长温度不一样。应该着重指出：最适合生长温度不一定是一切代谢活动的最好温度。其他微生物的试验也得到了类似的结果。

从上述可知，最适生长温度是指某微生物群体生长繁殖速度最快的温度，代时也最短。但它不等于发酵的最适温度，也不等于积累代谢产物的最适温度，更不等于积累某一代谢产物的最适温度。在较高温度条件下，细胞分裂虽然较快，但维持时间不长，容易老化。相反，在较低温度下，细胞分裂虽较慢，但维持时间较长，结果细胞总产量反而较高。同样，发酵速度与代谢产物积累量之间也有类似关系。所以，研究不同微生物在生长或积累代谢产物阶段时的不同最适温度，对提高发酵生产的效率具有十分重要的意义。现在，国外利用电子计算机，通过对发酵温度最佳点的计算，发现在青霉素发酵生产时，各阶段如采用变温培养比在25℃下进行恒温培养提高产量14%以上。变温培养的具体作法是：接种后在30℃下培养5小时，将温度降至25℃培养35小时，再下降至20℃培养40小时后放罐。

最高生长温度 是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。例如细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。

致死温度 最高生长温度若进一步升高，便可杀微生物。这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。致死温度与处理时间有关。在一定温度下处理时间愈长，死亡率愈高。严格地说，一般应以10分钟为标准时间。细菌脑10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。测

定微生物的致死温度一般在生理盐水中进行，以减少有机物质的干扰。

微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。

(一)低温型微生物 又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中，这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布在平均温度为5℃左右的海洋中，或分布在只有1-2℃的海洋深处；有的分布于冷泉。冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。

低温微生物可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。专性嗜冷微生物的最适生长温度是15℃或更低，最高生长温度约为20℃，可在零度以下甚至零下12℃的环境中生长。它们分布在常冷的环境中，即使短时受热以至室温条件，都会很快被杀死。因此，对这类微生在常规实验室研究就显得十分困难，所用的培养基和设备，使用前都必须预冷，而且还必须在冷室或冷柜中进行。而兼性嗜冷微生物则分布较广，但最适生长温度仍以20℃左右为好，而最高生长温度约35℃或更高。它们虽然也可在0℃，但生长不良，在培养基上几个星期才能观察到明显的生长。细菌、霉菌等类群中都有兼性嗜冷的种属。冷藏的肉类、鱼类、牛奶和其他乳制品、罐头、水果、蔬菜等，由于嗜冷微生物的生长，常导致食物变质以至腐败。温度愈低，腐败愈慢，只有当食物被坚实地冻结时，微生物的生长才是不可能的。定居和生长在冷藏食物上的微生物是兼性嗜冷菌，而专性嗜冷菌尚未在冷藏食物中发现。

但有些肉类上的霉菌零下10℃仍能生长，萤光极毛杆菌可在零下4℃生长，并造成冰冻食品弯质腐败。有的微生物能在低温下生长的机理还不大清楚，但至少可以认为：第一，它们细胞内的酶在低温下仍能有效地发挥作用，可能正是这个原因，嗜冷微生物的最高生长温度都较低，一般在30-40℃酶就很快失活；第二，与其他微生物相比，细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，因而推测，可能由于它们的细胞膜在低温下仍保持半流动状态，从而能进行活跃的物质代谢。

低温也能抑制微生物的生长。在0℃以下时，菌体内的水分冻结，生化反应无法进行而停止生长。0℃以上时，那些中温和高温型的微生物，因细胞膜内饱和脂肪酸的含量较高而被\冻结\，致使营养物质无法进入细胞而停止生长。此外，在细菌细胞内还含有许多复合体物质，如核糖体、异构酶等，它们是由两个或两个以上的高分子以疏水键结合而成。低温能使这种结合不稳定，复合体呈松散状态而失去活性，细菌便使止生长。

可是，有的微生物在冰点以下就会死亡，即使能在低温下生长的微生物，低温处理时，开始也有一部分死亡。主要原因可能是细胞内水分变成了冰晶，造成了细胞明显脱水；另外，冰晶往往还造成细胞尤其是细胞膜的物理损伤。在实践中，为了防止物理损伤，常采用快速冷冻和在细胞悬液中加入保持剂如甘油、血清或葡聚糖等。这样既可防止冰晶过大，又可降低细胞脱水。

由于低温对微生物具有抑制或杀死作用，故低温保藏食品已是最常用的方法。低温的作用主要是抑菌，如果食品中已经污染了病原微生物，则仍有传播疾病的可能，所以在冷藏食物的全过程中，要注意卫生，防止染菌。处于低温条件下的大多数微生物，虽然代谢活力降低，生长繁殖停滞，但仍维持存活状态，一旦遇到适合的生活环境就可生长繁殖，因此，又广泛用于保藏菌种。不同的微生物对低温的抵抗能力不一样。多数在4-7℃的冰箱内保存可存活较长时间，在零下196℃的液氮中酵母菌可存活三天，乳酸链球菌存活100天以上，而蓝细菌15分钟内即死去。可是芽孢和真菌孢子置于零下270℃的液态氦中一定时间后仍不丧失出芽力。但有些致病菌对低温特别敏感，如淋病奈氏球菌、脑膜炎球菌和流感杆菌等，在冰箱中比室温下更易死亡，故不能低温保藏。

中温性微生物在低温下只是停止生长，并非全部死亡。大肠杆菌在零下20℃比零下2℃存活率要高。有人试验，在零下20℃条件下保存了一年的乳酪，其中的细菌数仅以250万/毫升减少到68万/毫升。

幼龄菌对突然降低的温度很敏感。如大肠杆菌从45℃骤然降至10℃时，95%被杀死；如果逐渐降温，则死亡很少。这种现象被称为冷休克(Cold shock)。老龄菌对骤然降温不及幼龄菌敏感。冷休克的原因尚待研究。

应该注意的是：如以低温保藏菌种，切忌冷冻与融化交替进行。否则对细胞影响很大。 (二) 中温型微生物 绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在20-40℃之间，最低生长温度10-20℃，最高生长温度40-50℃。它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。室温性微生物适于20-30℃生长，如土壤微生物、植物病原微生物。体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限范围在10-45℃，最适生长温度与其宿主体温相近，在25-40℃之间，人体寄生菌为37℃左右。

中温型微生物为什么不能在低于10℃的条件下生长呢?有人以大肠杆菌为材料进行了试验，认为与蛋白质的合成和反馈抑制有关。低于10℃时蛋白质的合成过程不能启动，如果一旦启动，蛋白质便可继续延长，直至完成。另外，10℃以下的低温，使很多酶对反馈抑制变得异常敏感。

(三)高温型微生物 它们适于在45-50℃以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，如温朱、日照充足的土壤面、堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机物中，比如堆肥在发酵过程中温度常高达60-70℃。能在55-70℃中生长的微生物有芽孢杆属、甲烷杆菌属等；分布于温泉中的细菌，有的可在近于100℃的高温中生长。这些耐高温的微生物，常经罐头工业、发酵工业等带来麻烦。就整个生物来说，耐热能力并不一样，一般而言，原核生物能在比真核生物为高的温度下生长；非光合生物能在比光合作用类解这些结论时应该明确，一个类群中能生活于接近这一类型的温度上限，并能成功地进行使功能者只有少数种属。 高温型微生物能在如此高的温度下生存和生长，可能是由于菌体内的酶和蛋白质比起中温型微生物更能抗热，尤其蛋白质对热更稳定；同时高温型微生物的蛋白质合成机构--核糖体和其他成分对高温也具较大的抗性；更明显的是，细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，从而使膜在高温下能保持其稳定性并具正常的功能。同一类型的细菌，在一定的温度范围内，为了适应各种生活条件，常常改变自己细胞膜中饱和脂肪酸的比例，以保持膜的流动性。例如大肠杆菌ML30细胞膜中脂肪酸的变化情况，很能说明问题。

如果超过了最高生长温度则导致微生物死亡。不同微生物的致死温度不同。多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在50-65℃12分钟可致死；有的更敏感，如梅毒密螺旋体在43℃10分钟即死亡。有的却恰好相反，嗜热脂肪芽孢杆菌的抗热性很强，营养细胞可在80℃下生长，120℃经12分钟才能死亡；少数动物病毒亦具较强的抗热性，如脊髓灰质炎病毒，75℃分钟才致死。噬菌体较其宿主细胞抗热，一般在65-80℃失活。所以通常先用60℃处理15-20分钟致死宿主细胞而分离得到噬菌体。放线菌和霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，76-80℃10分钟才被杀死。但以细菌芽孢抗热性最强，100℃以下处理相当时间才能致死。各种芽孢的抗热能力不同。

同一菌种不同菌株或不同菌龄，其抗热性也可能不同。一般幼龄的比老龄的对热敏感，例如菌龄为1.75小时和2.75小时的大肠杆菌在53℃加热15分钟，其菌数分别下降10，000倍和2， 000倍，而菌龄为62小时，在同样条件下菌数只下降12倍。 培养基的成分对微生物的抗热性也有影响。例如在富含蛋白质的培养基上生长的细菌，可能由于在菌体周期形成了一层蛋白质膜而提高了抗热能力。

高温致死微生物主要是引起蛋白质和核酸不可逆的变性，或者破坏了细胞的其他组成，或者可能因为脂肪膜被热溶解而形成了极小的孔，使细胞内含物泄漏而引起死亡。

高温致死微生物的作用，现已广泛用于消毒灭菌，高温灭菌的方法分为干热与温热两大类。在一温度下，湿热灭菌比干热法好。例如肉毒梭状芽孢杆菌，采用湿热灭菌法121℃经

10分钟即可杀芽孢。如果在干燥状态下，用热空气杀菌，则需180℃10分钟才能杀死。所以干热灭菌常采用160-180℃经1-2小时才能达到完全灭菌的目的。 1.干热灭菌

(1)焚烧灭菌法 此法灭菌彻底，迅速简便，但使用范围有限。常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。

(2)干热灭菌法 主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌。通常160℃处理1-2小时便可达到灭菌的目的。如果被处理物传热性差、体积较大或堆积过挤时，需适当延长时间。此法只适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。其优点是可保持物品干燥。 2.湿热灭菌

(1)煮沸消毒法 物品在水中煮沸(100℃)15分钟以上，可杀死细菌的所有营养细胞和部分芽孢。如延长煮沸时间，并在水中加入1%碳酸钠或2-5%石炭酸，则效果更好。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。

(2)高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法是实验室及生产中常用的灭菌方法。在常压下水的沸点为100℃，如果加压则可提供高于100℃的蒸汽。加之蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。

高压蒸汽灭菌常在高压蒸汽锅中进行。它是一个密闭的系统，通常具有夹层，夹层和锅中可以充满饱和和蒸汽，并可在一段时间内使之维护一定温度和压力。使用时要完全排出锅内的空气而代之以饱和蒸汽。如有空气混存，则锅内温度将低于同样压力由纯饱和和蒸汽产生的温度。因为纯蒸汽的温度与其压力之间有一定的的关系。由此可知，高压蒸汽灭菌的蒸汽的高温致死微生物绝而非压力的作用。

此法适用于各种耐热物品的灭菌，如一般培养基、生理盐水等各种缓冲溶液、玻璃器皿、工作服等。常采用1千克/厘米2(15磅/英寸2)的蒸汽压，121℃的温度下处理15-30分钟，即可达到灭菌的目的。灭菌所需时间和温度取决于被灭菌物品的性质、体积与容器类型等。对体积大、热传导性较差的物品，加热时间应适当延长。 (3)间歇灭菌法 是用流通蒸汽反复几次处理的灭菌方法。将待灭菌物品置于阿诺氏灭菌器或蒸锅(蒸笼)及其他灭菌器中，常压下100℃处理15-30分钟，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度(28-37℃)保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。此法的缺点是灭菌比较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌设备时亦可用于一般物品的灭菌。

(4)巴斯德消毒法 即用较低的温度处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，但又不损害营养与风味。如用62-63℃则处理30分钟，若以71℃，只需15分钟。处理后的物品应迅速冷却至10℃左右即可饮用。这种方法只能杀死大多数腐生菌的营养体而对芽孢无损害。此法是基于结核杆菌的致死温度62℃15分钟而规定的。这种消毒法系巴斯德发明，故称巴斯德消毒法。

目前人们正在研究γ射线和高能电离辐射作为食品保藏剂是否合适的问题。在冷藏室中若装上能减少表面污染的紫外灯则保藏效果更好。罐头和包装食品常用适当的辐射剂量进行消毒，有人称之为\辐射巴斯德消毒\。此法是用中等剂量的辐射，能杀死98%以上的微生物，而不是100%。这种\冷消毒\只引起食物温度略有升高。

二、氢离子浓度(pH)

环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示。例如纯水的氢离子浓度是1×10-7，因此它的pH为7。小于7呈酸性，大于7的呈碱性。

环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的

可给性以及有害物质的毒性。

每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活，例如氧化硫杆菌能在pH1-2的环境中生活，有些硝化细菌能在pH11的环境下活动。

微生物在基质中生长，由于代谢作用而引起物质的转化，从而改变了基质的氢离子浓度。例如乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸，增加了基质中氢离子浓度，pH值下降，基质被酸化。尿素细菌分解尿素后产生氨，pH上升，基质被碱化。而肺炎克氏杆菌利用葡萄糖产酸，使基质pH下降到5，当葡萄糖耗尽后，菌体分解其酸性产物，并氧化它们成为CO2和H2O，结果，pH又回升至7。

随着环境pH值的不断变化，使得微生物继续生长受阻，当超过最低或最高pH值时，将引起培养物的死亡。为了维持微生物生长过程中pH值的稳定，不仅配制培养基时要注意调节pH值，而且往往还要加入缓冲物。最常用的是弱酸或弱碱的盐类。当培养基中氢离子浓度改变时，可吸收或释放氢离子以保持pH的稳定。不同的缓冲剂适用于不同的pH范围，pH6-8时磷酸盐(如K2HPO4和KH2PO4)是良好的缓冲剂，在培养基中广泛应用。在微酸性条件下，柠檬酸盐是一种良好的缓冲剂，而在碱性时则以硼酸盐和甘氨酸为好。缓冲剂有近百种，选用的主要原则是要确定它们对培养物没有直接影响。也可通过选用中性基质如蛋白质、氨基酸作为培养基的组成成分来调整环境pH。在工业发酵过程中，如果大量产酸，常以CaCO3作缓冲剂，以不断中和细菌产生的酸。有关冲剂的问题的第四章中已有介绍。 正如温度对微生物的影响一样，微生物生长繁殖的最适pH与其合成某种代谢产物的pH通常是不一致的。例如丙酮丁醇梭菌，生长繁殖的最适pH值是5.5-7.0，而大量合成丙酮丁醇的最适pH却为4.3-5.3。

同一种微生物由于液的pH值不同，可能积累不同的代谢产物。在不同的发酵阶段，微生物对pH的要求也有差异。例如黑曲霉在pH2-3的环境中发酵蔗糖，其产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当改变pH使之接近中性，则产生甘油和醋酸；如果使pH高于8时，发酵产物除乙醇外，还有甘油和醋酸。因此，在发酵过程中，根据不同的目的，常采用变支pH的方法，以提高生产效率。

此外，还可利用微生物对pH要求的不同，促进有益微生物的生长或控制杂菌的污染。例如栖土曲霉用固体培养法生产蛋白酶时，在基质中加入NaCO3使之呈碱性反应，能有效地抑制杂菌的生长，有利于提高蛋白酶的产量。

虽然微生物可在较广的pH范围的环境中生长，但是各种微生物细胞内的pH多接近于中性。细胞中很多组分如DNA、ATP、叶绿素等能被酸性pH破坏，而RNA和磷脂类则对碱性pH敏感；细胞内酶的作用最适pH也多接近于中性，而周质中的酶和胞外酶作用的最适pH则接近环境的pH。微生物细胞具有保持内环境接近中性的能力。

强酸与强碱具有杀菌力。无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大，实际上不宜作消毒剂。某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂。在面包及食品中加入丙酮可防霉。酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长，使之得以久贮存。

强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对革兰氏阴性细菌与病毒比对革兰氏阳性细菌作用强。耐酸性细胞如结核分枝杆菌抗碱力特强。实验室中对结核杆菌作检查前，先将待检查样品(如痰)以强碱(4%KOH)处理30分钟，使样品中的物质液化，这样的强碱条件是其他微生物所不能耐受的。 三、氧化还原电位

氧化还原电位( )对微生物生长有明显影响。环境中值与氧分压有关，也受pH的影响。pH值低时，氧化还原电位高：pH值高时，氧化还原电位低。通常以pH中性时的值表示，就是指在pH7时的氧化还原电位。自然环境中，氧化还原电位的上限是 +0.82伏，这是在环境中存在高浓度O2，而没有利用O2系统时的情况。下限是-0.42伏，则是一富于H2的环境。 各种微生物生长所要求的值不一样，一般好氧性微生物在值+0.1伏以上均可生长，以值为+0.3伏-+0.4伏时为适。厌氧性微生物只能在值低于0.1伏以下生长。兼性厌氧微生物在+0.1伏以上时进行好氧呼吸，在+0.1伏以下时进行发酵。

微生物生长过程中可能改变周围环境中的氧化还原电位。如微生物借代谢作用产生还原性抗坏血酸、H2S或有机硫氢化物［半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇］等可降低还原电位。O2的消耗也将使值下降。往培养基中通入空气或加入氧化剂可提高氧化还原电位以培养好氧微生物；于培养基中加入还原性物质能降低氧化还原电位，以培养厌氧微生物。 氧化还原电位影响微生物细胞内许多酶的活性，也影响细胞的呼吸作用。好气性微生物的氧化酶系的活动需要有较高的氧化还原电位。而厌气性微生物的一些脱氢酶系(包括辅酶I和电子传递体、铁氧还蛋白和黄素蛋白等)只能在氧化还原电位很低的环境中活动。 影响培养基中氧化还原电位的因素很多，分子态氧的影响(空气的影响)尤为重要。其次是培养基中氧化还原物质的影响。而环境的氧化还原电位取决于多种氧化还原物质的综合影响，例如微生物琼脂平皿培养在接触空气的情况下，厌气性微生物不能生长，如果在培养基中加入还原性物质(如半胱氨酸、硫代乙醇等)后同样接触空气，有此厌气性细胞就能生长。但是微生物在生长过程中也可使其环境中发生一定程度的改变。由于呼吸消耗氧和积累一些还原性物质，如抗坏血酸、H2S或有机硫氢化合物(半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等)，常导致环境中氧化还原电位降低，象好气性化脓链球菌在液体培养基中生长时，能使培养液的最初氧还原电位值由+0.3伏逐渐降至+0.15-0.2伏。因此，当好气性微生物与厌气性微生物生活在一起时，前者能为后者创造有利的氧化还原电位。 四、辐 射

辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一地方的能源。它们或是离子或是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和γ射线等。光量子所含能量随不同波长而改变，一般波长愈长，则所含能量愈低，反之则高。图6-4示不同波长辐射与杀菌作用的关系。在辐射能中无线电波最长，对生物效应最弱；红外辐射波长在800-1000纳米，可被光合细菌作为能源；可见光部分的波长为380-760纳米，是蓝细菌等藻类进行光合作用的主要能源；紫外辐射的波长为136-400纳米，有杀菌作用。可见光、红外辐射和紫外辐射的最强来源是太阳。由于大气层的吸收，紫外辐射与红外辐射不能全部到达地面；而波长更短的X射线、γ射线、β射线和α射线(由放射性物质产生)、宇宙射线(从外空到达地面)。这些辐射，往往引起H2O与其他物质的电离，对微生物亦起有害作用，故被作为一种灭菌措施。

(一)紫外辐射 紫外线是非电离辐射，它们使被照射物的分子或原子中的内层电子提高能级，但不引起电离。以波长265-266纳米的杀菌力最强。

紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂，已有专门制造的紫外杀菌灯管，在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，即使一薄层玻璃也会被滤掉大部分，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。

紫外辐射对细胞的有害作用，是由于细胞中很多物质对紫外线的吸收，例如细胞原生质中的核酸及其碱基对紫外线吸收能力特强，吸收峰为260纳米，而蛋白质的吸收峰为280纳米。当这些辐射能作用于核酸时便能引起核酸的变化，重则破坏其分子结构，妨碍蛋白质和酶的合成，轻则引起细胞代谢机能的改变而发生变异。微生物细胞经照射后，在有氧情况下，产生光化学氧化反应，生成的过氧化氢(H2O2)，能发生强烈氧化作用，引起细胞死亡。紫外辐

射的杀菌机制是复杂的，现知主要是由于它对DNA的作用，最明显的是形成胸腺嘧啶于聚体。详细情况将在第七章中介绍。

紫外辐射的杀菌效果，因菌种及生理状态而异，照射时间和剂量的大小也有影响。干细胞比湿细胞对紫外辐射抗性强，孢子比营养细胞更具抗性，带色的细胞能更好地抵抗紫外辐射。经紫外辐射处理后，受损伤的微生物细胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，称光复活现象。光复活的程度与暴露在可见光下的强度、时间、温度等条件有关。第七章中将进一步讨论。

(二)电离辐射 X射线与α射线、β射线和γ射线均为电离辐射。它们的波长很短，有足够的能量从分子中逐出电子而使之电离。换句说，电离辐射的杀菌作用不是靠辐射直接以细胞作用，而是间接地通过射线引起环境中水分子细胞中水分子在吸收能量后导致电离所产生的自由基起作用。这些游离基团能与细胞中的敏感大分子反应并使之并活。

电离辐射效应无专一性。α射线是带有阳电荷的氦原子核，具有很强的电离作用，但穿透力很弱，甚至纸片都能阻挡；β射线是中子转变为质子时放出的带阴电荷的射线，电离作用不太强，但穿透力比α射线大；γ射线是由某些放射性同位素如60Co发射出的高能辐射，具较强的穿透力，能致死所有的生物。考虑到γ射线的强穿力和强的杀菌效应，现已制出了用于不耐热的大体积物品消毒的γ射线装置。而α射线与β射线由于电离辐射作用较强，故具有抑有抑菌或杀菌作用。然后，某些化合物如碘化钾等对电离辐射具有保护作用。 五、干 燥

水分对于维持微生物的正常生命活动是必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。不同的微生物种类，干燥时微生物所处的环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。革兰氏阴性细菌如淋病球菌对干燥特别敏感，几小时便死去；结核分枝杆菌又特别耐干燥，在此环境中，100℃20分钟仍能生存；链球菌用干燥法保存几年而不丧失致病性。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如常用砂土管来保藏有孢子的菌中。生产或科研中常用真空干燥法来保藏细菌、病毒及立克次氏体达数年之久。此外，用于干菌苗、干疫苗的制造效果也颇有价值。在日常生活中常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。

真空干燥法，首先将细胞悬于少量保护剂(例如血清、血浆、肉汤、蛋白胨、脱脂牛乳)溶液中，分装在安瓿内，置于零下45℃℃至零下75℃低温中迅速冰冻，随即抽成真空，使达到真空干燥状态。 六、渗透压

水或其化溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象就是渗透。渗透是溶剂通过半透性膜时的压力即谓渗透压。其大小与溶液浓度成正比。

适宜于微生物生长的渗透压范围较广，而且它们往往对渗透压有一定的适应能力。突然改变渗透压，微生物常能适就这种改变。对一般微生物来说，它们的细胞若置于高渗溶液(如20%NaCl)中，水将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液(如0.01%NaCl)或水中，外环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。

由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用的高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。糖的浓度通常为50-70%，盐的浓度为10-15%。由于盐的分子量小，并能离解，在二者百分浓度相等的情况下，盐的保存效果好于糖。

有些微生物却能在较高渗透压的环境中生长，如嗜盐微生物(生活于死海或含盐量高的海水中)可在15-30%的盐溶液中生长。

在自然界，水中盐分浓度变化很大，即水的可利用率或者说水活性差异很大，为什么很多细菌能在水活性不同的条件下生长呢?例如淡水、蔬菜和水果的水活性接近100%，因此，

各类微生物都在其中生长。可是海水及盐湖的水活性为75%左右，所以只有一部分微生物(嗜盐菌)能生长。就目前所知，水的利用率(水活性)与其所含的溶质多少有关，一般来说，溶质浓度与水的利用率成反比。细菌能调节体内的离子浓度，以适应各种不同的渗透压力，钾离子与渗透压的调节作用最密切。当菌体处于高渗溶液(如23.4%NaCl+0.24%KCl)内时，细胞中能大量积累钾离子(可高出外环境64-140倍)；反之则排出钾离子。

从以上叙述可知溶液中渗透压的大小与水的利用率(可给性)有密切的关系。如果环境溶质中溶质浓度过高，溶液的渗透压很大，这时，环境中的水对微生物失去了可给性，形成了生理干燥，从而失去了生理活动的能力。 七、超声波

超声波(频率在20000赫兹以上)具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。淋病奈氏球菌对其极为敏感，而发光细胞却要处理1.5小时才死亡。病毒的抗性较强。一般来说，高频率比低频率杀菌效果好，球菌较杆菌抗性强。细胞芽孢具更强的抗性，大多数情况下不受超声波影响。

超声波致死微生物是引起细胞破裂，内含物外溢，因此，科研中常用此法破碎细胞，以研究其化学组成及结构，发细胞结构、抗原结构和酶的活性等。

八、重金属及其化合物

一些重金属离子是微生物细胞的组成成分，当培养基中这些重金属离子浓度低时，对微生物生长有促进作用，反之会产生毒害作用；也有些重金属离子的存在，不管浓度大小，对微生物的生长均会产生有害或致死作用。因此，大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是Hg、Ag和Cu。它们的杀菌作用，有的易与细胞蛋白质结合而使之变性；有的在进入细胞后与酶上的-SH基结合而使酶失去活性。重金属盐类是蛋白质的沉淀剂，能产生抗代谢作用，或者与细胞内的主要代谢产物发生螯合作用，或者取代细胞结构上的主要元素，使正常的代谢物变为无效的化合物，从而抑制微生物的生长或导致死亡。

汞 汞化合物有二氯化汞(HgCl2)、氯化亚汞(Hg2Cl)、氯化汞(HgCl)和有机汞。二氯化汞又名升汞，是杀菌力极强的消毒剂之一，1∶500-1∶2000的升汞溶液对大多数细菌有致死作用，实验室中曾用0.1%的HgCl2消毒非金属器皿。由于汞盐对金属有腐蚀作用，而且对人及动物有剧毒，其应用受到较大的限制。现已合成了许多汞有机化物，如硫柳汞、袂塔酚(metaphen)等。这些化合物对大多数细菌有效，而对人及动物毒性较低，故常用消毒剂、植物保护剂或用于血清和疫苗的保存。红汞(汞溴红)也是最常用的消毒剂之一。

银 长期来作为一种温和防腐剂而被使用。0.1-1%硝酸银(AgNO3)用于皮肤消毒。新生婴儿常用1%硝酸银滴入眼内以预防传染性眼炎。蛋白质与银或氧化银制成的胶体银化物，刺激性较小，也可作为消毒剂或防腐剂。

铜 硫酸铜是主要的铜化物杀菌剂，对真菌及藻类效果较好。在农业上为了杀伤真菌、螨以至防治某些植物病害，常用硫酸铜与石灰以适当比例配制成波尔多液使用。

砷、铋、锑等 曾用作化学疗剂来医治梅毒病和某些原生动物所引起的疾病。特别是三价砷的有机化合物，如砷凡纳明(606)、新砷凡纳明(914)，对人及动物毒性轻微，曾经是治疗梅素病的特效药。这些化学疗剂，由于对人及动物毒性大，故不宜作为消毒剂。 九、有机化合物

对微生物具有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性， 是常用的杀菌剂。

酚及其衍生物 酚又名石炭酸。它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白变性，同时又有表面活性剂的作用，破坏细菌膜的透性，使细胞内含物外溢。当浓度高时是致死因子，反之则起抑菌作用。例如：0.5-1%的水溶液可用于皮肤消毒，但具刺激性；2-5%的溶液可用于

消毒痰、粪便与用具；3-5%的溶液有很好的杀菌效果；5%的则用作喷雾以消毒空气。芽孢与病毒比细菌营养细胞的抗性强，细菌的芽孢在5%的石炭酸溶液中仍可存活几小时。 酚的另一用途是常用来作为比较其他化学消毒剂杀菌能力的标准。通过酚系数(石炭酸系数)来表示。将某一消毒剂作不同的稀释，在一定的条件、一定时间(一般10分钟)致死全部供试微生物(常用金黄色葡萄球菌或伤寒沙门氏菌)的最高稀释度与达到同样效果的酚的最高稀芭的比值，即为酚系数。酚系数越大，表明该消毒剂杀菌能力愈强。酚系数测定可作表6-19表示。

利用此方法可测知不同杀菌剂的杀菌能力，但它只适用于杀菌以及在人含有机质的条件下使用。

甲酚 它是酚的衍生物。杀菌力比酚强几倍。甲酚在水中的溶解度较低，但在皂液与碱性溶液中易形成乳浊液。市售的消毒剂煤酚皂液(来苏尔)就是甲酚与肥皂的混合液，常用3-5%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。

醇 它是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞而具杀菌能力。50-70%的乙醇便可杀死营养细胞；70%的乙醇杀菌效果最好，超过70%以至无水酒精效果较差。无水乙醇可能与菌体接触后迅速脱水，麦面蛋白质凝固，形成了保护膜，阻止了乙醇分子进一步渗入。使用时应根据消毒物品干燥与否来确定使用凝浓度。

乙醇是普遍使用的消毒剂，常用于实验室内的玻棒、玻片及其他用具的消毒。 甲醇的杀菌力较乙醇差，而且对人，尤其是对眼睛有害，不适于作消毒剂。

此外，醇类物质，随着分子量的增大，杀菌力增强。例如戊醇＞丁醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇。那些高级醇虽杀菌力强于乙醇，由于丙醇以上的醇不易与水相混，故一般不用作消毒剂。 甲醛也是一种常用的杀细菌与杀真菌剂，效果良好。纯甲醛为气体状，可溶于水，市售的福尔马林溶液就是37-40%的甲醛水溶液。

由于甲醛具有腐蚀性而且刺激性很大，有宜人体使用，一般用10%的溶液进行熏蒸以消毒厂房、无菌室或者传染病患者的家具、房屋等。甲醛既有杀菌作用又有抑菌作用，也不受有机物质的影响。

十、卤族元素及其化合物

碘 是强杀菌剂。3-7%碘溶于70-83%的乙醇中配制成碘酊，是皮肤及不伤口有效的消毒剂。另外以2%碘与2.4%碘化钠溶于70%乙醇，刺激性较小，而仍有杀菌效能。5%碘与10%碘化钾水溶液也是有效的皮肤消毒剂，但不如碘酊那样易于浸透皮肤。现已发展到用有机碘化物杀菌。

碘一般都作外用药。据试验，1%的碘酒或1%碘油溶液，10分钟内可杀死一般的细菌和真菌，并使病毒灭活。

关于碘的杀菌机制还不清楚，有人认为，它的作用可能是碘不可逆地与菌体蛋白质(或酶)中的酪氨酸结合。

碘的杀菌作用还可能由于它是氧化剂。

氯气或氯化物 这是一类最广泛应用的消毒剂。

氯气用于饮用水的消毒。自来水厂和游泳池中常用0.2-0.5ppm的氯气消毒。

氯化物有次氯酸盐等。5-20%次氯酸钙［Ca(OCl)2］的粉剂或溶液，常用作食品及餐具、乳酪厂的消毒。

氯气和氯化物的杀菌机制，是氯 结合产生了次氯酸(HClO)，次氯酸易分解产生新生态氧，这是一种强氧化剂，对微生物起破坏作用。

病毒比细菌抗性强，在400ppm氯的条件下，10分钟内仍然存活。 十一、表面活性剂

具有降低表面张力效应的物质称为表面活性剂。这类物质加入培养基中，可影响细胞的生长与分裂。

纯水的表面张力为72达因/cm2，如果其中存在着营养物质，则常使表面张力降至46-65达因/cm2，在些范围内，大多数细菌可生长良好。如果在培养基中加入表面活性剂，则显著影响其生长繁殖，以及形态、革兰氏染色反应、运动性、芽孢形成与萌发等。

肥皂 它是温和的杀菌剂，为脂肪酸钠盐。对肺炎球菌或链不球菌有效，但对葡萄球菌、革兰氏阴性菌、细菌芽孢、结核分枝杆菌无效。一般认为，肥皂的作用是机械性地移去微生物。微生物附着于肥皂泡沫中而被水冲洗掉。

合成去垢剂 由于去污力强，在硬水中不形成沉淀，其应用范围越来越广，其中有些也用作消毒剂。

合成去垢剂分为阳离子去垢剂、阴离子去垢剂和非离子型去垢剂三种。十六吡啶氯化物(即漂白粉)消毒能力较强；十二碳硫酸钠(洗衣粉)和肥皂都是阴离子表面活性剂，其杀菌效力相当于石灰酸的2-3倍，对致病性球菌非常有效，所以是很好的杀菌剂；非离子型表面活性剂对微生物无作用。

十二、染 料

染料，特别是碱性染料，在低浓度下可抑制细菌生长。例如碱性三苯甲烷染料

(triphenylmethane dye)，包括孔雀绿、亮绿、结晶紫等。革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对其敏感。结晶紫1∶200000-1∶300000的稀释液可抑制革兰氏阳性细菌，而抑制革兰氏阴性细菌则要浓十倍才行。1∶100000浓度的孔雀绿可抑制金黄色葡萄球菌，而1∶30000就可抑制大肠杆菌。由于这些染料具有选择性抑菌的特点，故常在培养基中加入低浓度(1∶100000)的染料配制成选择培养基，只有革兰氏阴性细菌可以生长。此法可用于大肠杆菌的鉴别试验。

结晶紫也是杀真菌剂，1∶10000的浓度可致死念珠霉与圆酵母等真菌，1∶1000000则表现为抑制作用。

三苯甲烷染料作用机理不大清楚，可能是干扰了细胞的氧化过程；有人认为，可能是离子交换作用，即细菌的离子与染料的离了交换，使细菌的蛋白质失去了活性。

吖啶染料包括吖啶黄(acriflavine)、二氨基吖啶基，亦称原黄素(proflavine)，对革兰氏阳性细菌较为有效，它们可用来处理伤口、冲洗眼部与灌洗膀胱等。 常用的表面消毒剂种类很多，见表6-20。

第三节 化学疗剂对微生物的作用

能直接干扰原微生物的生长生繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学疗剂。它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。但对人体细胞毒性较小，故常用于口服或注射。化学疗剂种类很多，按其作用与性质又分为抗代谢物和抗生素等。

一、抗代谢物

有些化合物在结构上生物体所必需的代谢很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。抗代谢物如果与正常代谢物同时存在，能产生一种竞争性拮抗作用，即竞争性地与相应的酶结合，只有当正常代谢物的量少或不存在时，抗代谢物才有作用。

抗代谢种类较多，如叶酶对抗物(磺胺类药物)、嘌呤对抗物(6-巯基嘌呤)氨基酸对抗物(5-甲基色氨酸)、吡哆醇对抗物(异烟肼)等。

磺胺类药物是最常用的化学疗剂，抗菌谱较广，能治疗多种传染性疾病，能抑制大多数革兰氏阳性细菌(如肺炎球菌、β-溶血性链球菌等)和某些革兰氏阴性细菌(如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等)的生长繁殖，对放线菌也有一定作用。磺胺类药物都是氨苯磺胺

的衍生物。磺胺分子中含有一个苯环，一个对位氨基和一个磺酰胺基，前者与抗菌作用密切关系。

磺胺衍生物与磺胺相比，化学治疗特性更优良，因为它们对细菌的毒性大而以人及动物毒性较弱。现有一种磺胺增效剂［甲氧苄氨嘧啶(TMP)］，它不仅能增磺胺的作用，也能增强多种抗生素的作用，同时它本身的抗菌能力也较磺胺强，所以又称抗菌增效剂。 磺胺类药物广泛用于临床，是由于它们与微生物生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸(PABA)间的竞争性抑制作用，细菌生长所必需的对氨基苯甲酸可以自行合成，也可从外界环境中获得。若自行合成时，正常情况下，对氨基苯甲酸则和二氢喋啶在二氢叶酸合成酶的作用下，合成二氢叶酸。二氢叶酸。二氢叶酸再通过二氢叶酸还原酶的作用，生成四氢叶酸。然而磺胺的结构与对氨基苯酸极其相似，在一定条件下，它们竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基甲酸掺入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶酸的合成(图6-15)。而叶酸是一种辅酶，在氨基酸、维生素的合成中起生要作用，缺乏此酶，细菌细胞活力受到明显破坏。磺胺抑制细菌的生长是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长。由于人和动物可利用现成的叶酸生活，因此不受磺胺的干扰。叶酸，亦称蝶酰谷氨酸 已知的抗代谢物的种类较多，作用机理各不相同，另外，异烟肼又名雷米封，是吡哆醇抗代谢物，是最有效的抗结核杆菌的药物之一。它能渗入机体细胞，并作用于细胞内的结核杆菌。其杀菌机制尚待研究。有人认为，异烟肼能与体内的醛、酮体、丙酮酸等结合成腙，其中吡哆醇或丙酮酸是细菌代谢所必需的物质，异烟肼可能是通过与其结合而影响了结核杆菌的生长繁殖。

二、抗生素

抗生素是另一类重要的化学疗剂。大多数抗生素是由某些生物合成或半合成的化合物。具有低浓度时就可抑制或杀死其他微生物的作用，是临床上经常使用的重要药物。早在三千多年前，我国劳动人民就用长了霉的豆腐处理脓肿、溃疡以及用霉来控制脚部感染，实际上是抗生素化疗的开端。随着现代科学技术的发展，现已发掘、报道了几千种抗生素，试制生产了几百种，经常使用的也有几十种之多。对抗生素的化学性质、结构，抗生素的生物合成途径以及抗生素的合理使用，扩大应用等方面都开展了广泛的研究，而且对其抑菌和杀菌作用方式也进行了深入地探讨。

抗生素的作用对象有一定的范围，这种作用范围就称为该抗生素的抗菌谱。氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等可抑制多种微生物，故称为广谱抗生素，而青霉素主要作用于革兰氏阳性细菌，多粘菌素只能杀死革兰氏阴性细菌，所以称为窄谱抗生素。

抗生素的作用方式也随抗生素而异，或是可逆的(抑菌)，或是不可逆的(杀菌)。同时也与抗生素使用浓度有关，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌。现知它们的抗菌作用，总起来讲，主要是阻止微生物新陈代谢的某些环节，钝化某些酶的活性。一切代谢活动几乎都由酶催化。可是，各种微生物细菌的化学组成不同，因而催化合成细胞物质的酶也各不相同，由于抗生素只作用于某一特定的酶，这种酶对某些微生物是必需的，而对另一些微生物则不然，从而导致抗生素对生物的作用对象也具有选择性。据研究，抗生素的作用位点大致有以下几种：有的抑制细菌壁的形成，有的影响细胞膜的功能；胃的干扰蛋白质的合成；有的阻碍核酸的合成等。

(一)抑制细胞壁的形成 细菌壁的生理功能之一，是保护细胞在高渗条件下不致破裂或崩解。能抑制细胞壁合成的抗生素有青霉素、杆菌肽、环丝氨酸等。用青霉素处理革兰氏阳性细菌，最后会引起菌体的膨胀或崩解。

青霉素的作用机制，主要是抑制细胞壁的重要组分--肽聚糖的合成。革兰氏阳必细菌的细胞壁主要是由肽聚糖组成。例如金黄色葡萄球菌的细胞壁，它是由N-乙酰葡萄胺和N-乙酰胞壁酸交叉连接成多糖链，每人胞壁酸上连接着一条短肽链，肽链之间再通过五甘氨酸间桥相

互连接，从而构成了细胞壁肽聚糖的多层网状立体结构。五甘氨酸间桥的一端与肽链的L-赖氨酸连接，另一端则与倒数第二位的D-丙氨酸连接，而肽链最后的一个D一丙氨酸，通过转肽作用而被解脱。因此，完整的细胞壁中，N-乙酰胞壁酸上的短肽链只带有四个氨基酸(即L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-赖氨酸-D-丙氨酸)而不是一条五肽链(即L-丙氨酸-D-谷氨酸-L赖氨酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸)。

青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构很相似，从而能够占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链彼此之间无法连接，因而抑制了细胞壁的合成(图6-17)。细胞壁失去了防止渗透压破坏的保护作用，在低渗透环境下，菌体溶解死亡。这一作用可在实验室观察到，在有青霉素存在的条件下，细菌的形态、大小往往很不正常。对人和高等动物细胞却无影响，而且青霉素主要作用于活跃生长的细菌。

多氧霉素(polyoxin)是一种效果好的杀真菌剂，其作用是阻碍细胞壁中几丁质的合成，因此对细胞壁主要纤维素组成的藻类就没有什么作用。这一族抗生素中，象多氧霉素D是防治植物病害最好的农用抗生素之一，多氧霉素A对烟草花叶病素有抑制作用。在农业上，多氧霉素用于防治水稻纹枯病、苹果斑点落叶病及蔬菜丝核病有极好的效果，对人及鱼类无毒害，这是一种很有前途的抗生素。

总之，能抑制细胞壁肽聚糖合成的抗生素主要作用于革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌效果较差；另外，这类抗生素对生长旺盛的细菌有明显效果，而对静息细菌细胞则不明显，这是因为这些抗生素对完整的细菌壁无作用。

(二)影响细胞膜的功能 某些抗生素，尤其是多肽类抗生素，如多粘菌素、短杆菌素等，主要引起细胞膜损伤，导致细胞物质的泄漏。象多粘菌素能与细胞膜结合，使脂多糖解体，脂蛋白部分改变，因而对革兰氏阴性细菌有较强的杀菌作用。在多粘菌素分子内含有极性基团和非极性部分，极性基团与膜中磷脂起作用，而非性部分则插入膜的疏水区，在静电引力作用下，膜结构解体，菌体内的主要成分如氨基酸、核苷酸、和钾离子等漏出，造成菌体死亡。这种抗生素对人和动物毒性较大，常作外用药。

作用于真菌细胞膜的大部分是多烯类抗生素，如制霉菌素、两性霉素等。它们主要与膜中的固醇类结合，从而破坏细胞的结构，引起细胞内物质泄漏，表现出抗真菌作用，但对细菌无效。

(三)干扰蛋白质合成 能干扰蛋白质合成的抗生种类较多，它们都能通过抑制蛋白质生物合成来抑制微生物的生长，而并非杀死微生物。不同的抗生素抑制蛋白质合成的机制不同，有的作用于核糖体亚基，如卡那霉素、链霉素、春雷霉素等主要作用于30S亚基，而氯霉素、林可霉素、红霉素等则作用于50S亚基，以抑制其活性；但不同的抗生素之间，常表现出拮抗作用，有的抗生素可以阻止另一种抗生素与核糖结合而失去抗菌作用。此外，有的抗生素是蛋白质合成的不现阶段上起作用。不管哪种方式，最终都是抑制蛋白质的生物合成。由于细菌的核糖体与人及高等动物的核糖体有差别，故这类抗生素具有选择毒性，被用作化学疗剂。

(四)阻碍核酸的合成 这类抗生素都对细菌有毒。它们主要是通过抑制DNA或RNA的合成来抑制微生物细胞的正常生长繁殖。核酸是合成菌体蛋白质的基础。不同的抗生素作用的机制也不相同：有的通过与核酸上的碱基结合，形成交叉连接的复合体以阻碍双链DNA和解，从而影响DNA的复制，如丝裂霉素(自力霉素)；有的则可切断DNA的核苷酸链，使DNA分子量降低，以干扰DNA的复制，如博莱霉素(争光霉素)；有的作用于核苷酸，导致酶活性降低或丧失，如利福霉素能与RNA合成酶结合，抑制RNA的合成酶反应起始过程；放线菌素也能与双链DNA结合而抑制其酶促反应。此外，丝裂霉素可以引起DNA酶活性提高，导致DNA部分地裂解。

放线菌素D(更生霉素)也是一种抗癌抗生素，属多肽类。它的作用是干扰RNA聚合酶的

转录过程，使RNA链停止延长。但放线菌素D只能与双链DNA结合而不能与单链DNA结合，而且只能阻止依赖于DNA和RNA合成，而无碍于DNA的合成，所以对单链RNA病毒无效果。同时它们也是研究大分子生物合成的有用工具，用它可以区别RNA的合成是否依赖于DNA。 有的抗生素可嵌入到DNA分子上，破坏DNA分子的立体构型，影响DNA聚合酶同DNA结合，影响RNA聚合酶在DNA链上的移动，从而抑制DNA的复制和转录。

此外，有些抗生素可作用于呼吸链，影响能量的有效利用，从而妨碍了微生物的生长。尤其是好气性微生物，通过呼吸以产生ATP。可是有的抗生素如抗霉素是呼吸链电子传递系统的抑制剂，使微生物呼吸作用停止；有的是能量转移的抑制剂，使能量不能用于合成ATP，如寡霉素；有的则是一种解偶联剂，在它的作用下，呼吸虽可进行，但不能合成 ATP。 三、微生物的抗药性

微生物与周围环境之间，关系十分复杂。虽然不良的环境条件对微生物的生长会产生不良影响，但是，微生物对于不良的环境条件也能产生主动反应，例如趋避运动，或产生适应性而赖以生存。

适应性是微生物在有害条件下能够生存的一种能力，并受遗传信息的控制。不同的微生物往往能适应不同的环境条件，有的对某些化学药物具有适应性，有的对高温或低温有适应性，有的则对pH、辐射、重金属离子等不良理化因素具有适应性。下面着重介绍微生物对药物的适应性(或称抗性)。

随着化学疗的广泛应用、某些病原微生物如葡萄环菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌等日益严重地出现抗药现象，给传染病的医疗带来了困难，而且有可能继续成为一种威胁，引起了各方面的重视。

临床上重要的抗药性菌的抗药性主要表现为以下几种：

(一)菌体内产生了钝化或分解药物的酶，将有活性的药物转变成没有抗菌作用的产物。例如葡萄球菌的有些菌株能抗青霉素，就是由于它们产生了青霉素酶(β-内酰胺酶)，使青霉素分子中的β-内酰胺环开裂而丧失了抑菌作用。类似的抗生素如头孢霉素类也因遭受类似的作用而换失效。现在通过半合成青霉素来改变青霉素分子结构，以保护β-丙酰胺环，使其难以受到β-内酰胺酶的破坏，从而克服某些病原菌的抗药性。

另外，有些病原微生物产生了某些其他的酶类，通过乙酰化、磷酸化和腺苷化作用，使抗生素的分子结构发生改变。例如有些肠道细菌、葡萄球菌能产生转乙酰基酶，此酶在乙酰辅酶A的参与下，先使氯霉素侧链上的第三位羟基乙酰化，接着又将第一位羟基乙酰化，其结果，具有抗菌活性氯霉素转变成无毒性的1，3-双乙酸氯霉素。

氯霉素是今日疗伤寒病的常用抗生素之一，由于耐药性菌株的产生，严重地影响了对伤寒病患者的治疗。

抗卡那霉素的微生物，往往在细胞内产生了卡那霉素-磷酸转移酶，在ATP的参与下，将卡那霉素转变成3-磷酸卡那霉素而失活；抗链霉素的菌株，则在细胞内形成了链霉素-磷酸转移酶和链霉素-腺苷转移酶，在它们的作用下，使这些抗生素失去活性。其反应过程如下：

卡那霉素+APT卡那霉素-磷酸转移酶3-磷酸卡那霉素+ADP

(二)改变细胞膜的透性而导致抗药性的产生 这类抗性菌株具有阻挠抗微生物剂进入或排出已进入细胞的药物的能力。现已观察到抗四环素的肠道细菌的细胞内，四环素积累量减少，试管内产生的人工抗药菌株也有这种情况。因而认为这是由于细胞膜通透性降低的结果。详细情况尚待继续研究。

(三)细胞内被药物作用的部位发生了改变 目前最典型的例子就是核糖体发生了改变。例如对链霉素敏感的菌株，由于链霉素与其核糖体(30S亚单位)结合，干扰了蛋白质的合成，从而起到了抑菌或杀菌作用。后来在大肠杆菌中得到了抗链霉素的菌株，其核糖体(30S亚单

位)发生了改变，链霉素再不能与之结合，从而使链霉素对该菌株失效。

有的微生物改变了对某种药物敏感酶的性质，使之获得了抗药性。据报道，有的抗磺胺药物的菌株，通过突变，改变了二氢叶酸合成酶的性质，合成了一种对磺胺药物不敏感的酶, 总之，在抗药性机制方面还可能存在着其他多种方式，有待进一步研究。 小结

 1.微生物个体生长是细胞物质按比例不可逆的增加，使细胞体积增加的生物学过程；繁殖是生长到一定阶段后，通过特定方式产生新的生命个体，使机体数量增加的生物学过程。微生物特别是细菌生长与繁殖两个过程很难绝然分开，同时接种时往往是接种成千上万的群体数量，因此它们的生长一般是指群体生长。群体生长是细胞数量或细胞物质量的增加。  2.单细胞微生物在适宜的液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下培养，微生物群体生长可分为迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。生长的数学模型和参数对于微生物的理论研究和实际应用都越来越重要。

 3.采用机械方法和环境条件控制可以获得同步培养，通过及时补充营养物质和及时取出培养物降低代谢产物，导致对数生长期或稳定生长期相应延长达到连续培养。

 4.微生物生长分别可以用单细胞计数、细胞物质的重量和代谢活性等三类方法进行测量。  5.微生物可以通过各种各样的无性或有性的方式进行繁殖。例如细菌主要以等二分裂法、酵母菌以出芽或裂殖方式、丝状真菌以无性或有性孢子或以菌丝断裂片进行繁殖。

 6.每种微生物的生长都有各自的最适条件、营养物质的种类和浓度、温度、pH、氧、水活性(或渗透压)等，高于或低于最适要求都会对微生物生长产生影响。利用各种化学物质和物理因素可以对微生物生长、繁殖进行有效地控制，能够对微生物进行兴利除害方面发挥重要作用。

思 考题

 1.细菌的生长繁殖与高等动、植物的有哪些异同?与丝状真菌又有哪些异同?  2.试分析影响微生物生长的主要因素及它们影响微生物生长繁殖的机理。]

 3.说明测定微生物生长的意义、微生物生长测定方法的原理及比较各测定方法的优缺点。  4.控制微生物生长繁殖的主要方法及原理有哪些?

 5.细菌耐药性机理是哪些?如何避免抗药性的产生?

 6.试举例说明日常生活中防腐、消毒和灭菌的实例，及其原理。

 7.细菌肥料是由相关的不同微生物组成的一个菌群并通过混合培养得到的一种产品。活菌数的多少是质量好坏的一个重要指标之一。但在质量检查中，有时数据相差很大。请分析产生这种现象的原因及如何克服。

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