第七章 微生物的生长繁殖及其控制

第七章 微生物的生长繁殖及其控制

重点与难点剖析

一、微生物生长繁殖的概念

微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。当细胞个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即繁殖。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、很难划分，因此，微生物的生长繁殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。 1、 细菌一般没有有性繁殖，多采用二分裂方式。

2、 真菌除了进行无性繁殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行

有性繁殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。

纯培养技术

1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。获得纯培养物涉及的相关技术包括：

无菌技术、 微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。 2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。

3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理

纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体-即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。

固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：

（1）划线平板法

将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：

细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。

平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个

（2）倾注平板法和涂布平板法

这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。

稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。

稀释倾注平板法操作较麻烦。在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基

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中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。在进行微生物计数时，该方法细胞分散均匀，计数较准确。

稀释涂布平板方法的操作是：首先将灭完菌冷却到50-55°C的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上，培养。

稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和培养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使用的常规分离方法。其存在的问题是有时会由于菌液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响计数结果和分离纯化效果。

（3）稀释摇管法

主要用于厌氧微生物的分离纯化，是稀释平板法的一种变通。其基本操作流程为：试管培养基融化 ? 50度保温 ? 样品梯度稀释后加入试管培养基中 ? 摇匀冷却凝固 ? 石蜡油封闭 ? 培养。细胞固着于试管的琼脂柱中，再加以石蜡覆盖，就可以进行厌氧菌的分离纯化。由于氧的存在对严格厌氧微生物有毒害作用，因此严格厌氧菌的培养往往需要专业的厌氧操作设备。因此，稀释摇管法在虽然观察和挑取菌落时比较困难，但是在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一项方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成本方法。

所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。

4、液体培养基分离纯培养的原理

液体培养基分离纯培养物仍然基于稀释的基本原理，但是需要高度稀释，致使一支试管中分配不到一个微生物细胞，至多只有一个细胞，这样才能够在液体培养基中获得纯培养物。因此根据统计学原理，采用稀释法进行液体分离纯培养物时，必须要求在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）试管中表现为不生长，这时表现为生长的试管中为纯培养的可能几率就增大（据统计计算，若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，在有细菌生长的试管中培养物来源于一个细胞（即纯培养）的几率为97.5%。来源于两个细胞的几率为2.44%，来源于三个细胞的几率为0.04%）

5、选择培养分离与富集培养

所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。非数量优势微生物类群的分离纯化则可以首先通过选择培养与富集培养的方式使其数量增加，成为数量优势菌群后，再通过上述各种平板法进行分离和纯化。

选择培养就是通过添加抑制剂，抑制大多数其它微生物的生长；或者选择特定的营养物，使得需要的微生物易于快速生长。

——没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

富集培养就是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

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二、微生物生长的测定

微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化

个体计数

微生物生长的测定： 群体重量测定

群体生理指标测定

（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定

通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。

1、培养平板计数法

样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。注意： 1） 同一稀释度三个以上重复,取平均值；

2） 每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；

一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。 2、膜过滤培养法

当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。 3、The most probable number method（液体稀释法） 1）未知样品进行十倍稀释；

2）取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养； 3）长菌的为阳性，未长菌的为阴性； 4）查表推算出样品中的微生物数目； 4、显微镜直接计数法

采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

（二）以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。多应用于单细胞微生物的培养。 2、重量法

以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量。或通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；

该方法适合于测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 3、 生理指标法

微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。

样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。 三、生长曲线(Growth Curve)：

细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。一条典型的生长曲线可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个生长时期。 1、 延缓期（Lag Phase）:

将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零，该时期又称延迟期、适应期。 迟缓期出现的原因：

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微生物接种到一个新环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段

(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子；

(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量

2、指数生长期(exponential phase)：

以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。

几个重要的生长参数：

代时(Generation time)通常以G表示，是指在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time）。

n

Nt= N0 X 2

繁殖一代所需的时间：

t1 – t0 0.639

G = —————— = ————— n μ

μ：比生长速率：单位时间内生长的速度。 纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；

3、稳定生长期(Stationary phase)：又称恒定期或最高生长期：

由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定生长期是细胞重要的分化调节阶段。

1） 开始储存糖原等内含物；

2） 形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）；

3） 发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期 4、衰亡期（Death phase）

营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。 衰亡期特点：

1） 细菌代谢活性降低； 2） 细菌衰老并出现自溶；

3） 产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。

4） 菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴

性反应 5、二次生长：

不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。 四、同步培养(Synchronous culture)

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使群体中的细胞处于一致，生长发育均处于同一阶段，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。

获得同步培养细胞的方法：

离心方法

机械方法 过滤分离法

硝酸纤维素滤膜法

温度

环境条件控制技术 培养基成份控制

其他（如光照和黑暗交替培养）

同步培养常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。 五、连续培养 (Continous culture )

在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。

恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定。 连续培养

恒化连续培养：保持恒定的流速

六、环境对微生物生长的影响

影响微生物生长的外界因素很多，除营养条件外，还有许多物理条件。其中最主要的有温度、pH和氧气。 1、 营养物质

2、水活性 微生物在生长过程中对培养基的aw有一定要求。

细菌 0.91；酵母菌 0.88；霉菌 0.80；嗜盐细菌 0.76；嗜盐真菌 0.65；嗜高渗酵母 0.60

3、温度

最低生长温度（一般为-5~-10℃，极端为-30℃） 嗜冷菌（≤20℃） 生长温度的三基点 最适生长温度 中温菌（20~45℃）

嗜热菌（≥45℃）

最高生长温度（一般为80~95℃，极端为105~300℃） 4、氧气

专性好氧菌：在正常情况下（0.2巴）进行好氧呼吸和产能 好氧菌 兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵产能

以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能

微生物与氧 微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大气压下生活。

厌氧菌 耐氧菌：只能以发酵产能，分子氧无毒害。

厌氧菌：只能生长在无氧或基本无氧的情况下，氧剧毒。

表6-1氧气对微生物的作用 微生物 好氧和兼性厌氧 SOD H2O2酶 + + - - 5

耐氧性 + 专性厌氧菌 - 5、 pH

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微生物作为一个整体，生长的pH极广，绝大多数种类生长在pH5~7之间。 嗜碱性微生物，如硝化细菌、尿素分解菌、根瘤菌和放线菌。 PH生长微生物 耐碱性微生物，链霉菌 嗜酸微生物，如硫杆菌，

耐酸微生物，如乳酸杆菌，醋酸杆菌。 同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程，有不同的pH值要求。如Aspergillus niger在pH2~2.5范围内有利于产柠檬酸，在pH2.5~6.5范围内以菌体生长为主;在pH5.5~7.0范围内,以合成草酸为主.

微生物的外环境中pH变化很大,其内环境中的pH却相当稳定,一般都接近中性. 由此避免了DNA、ATP和叶绿素等重要成分的破坏。

一般胞内酶的最适pH都接近中性，而周质空间的酶和胞外酶则接近环境的pH。pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。 七、微生物生长繁殖的控制 （一）控制微生物的化学物质

一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质

非选择性 消毒剂(Disinfectant) （对所有细胞均有毒性） 防腐剂(Antisepsis)

抗微生物剂 抗代谢药物

有选择性 抗生素

（对病原微生物毒性更强） 中草药有效成分

1、防腐剂和消毒剂

消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。

防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。

各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：

石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。 石炭酸广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌。 2、抗代谢物(Antimetabolite)

有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物相似，以至可以和特定酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。 磺胺药物作用机理：

磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物.磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。 3、抗生素(Antibiotic)

由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。

半合成抗生素：通过微生物发酵生产母核，再通过化学修饰在母核上连接不同的侧链。 作用机制：

根据抗生素作用的部位可划为不同种类：

抑制细菌细胞壁合成：青霉素、杆菌肽、D-环丝氨酸、万古霉素 破坏细胞质膜：多粘菌素是细胞膜上的蛋白质释放。 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化：短杆菌肽

抑制蛋白质和核酸合成：链霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、嘌呤霉素 最终结果抑制或杀死微生物的生长和繁殖。

青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼此连接，抑制了细胞壁的合成。

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由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同抗生素的抗菌谱各异。 （二） 控制微生物的物理因素

1、干热灭菌 烘箱内热空气灭菌，160℃，2小时

火焰灼烧

2、湿热灭菌：借助于水蒸气的灭菌方式。

湿热比干热灭菌更好：1）更易于传递热量；2）更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构； 湿热灭菌常见以下几种方式：

1）巴斯德消毒：60-85℃处理15秒至30分钟 2）煮沸消毒：100℃ 30min 3）间歇灭菌：杀死芽孢

4）常规高压灭菌：121℃，15分钟；或115℃，30分钟；

5）连续加压灭菌：135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基；135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品 3、辐射作用

辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。

用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等 4、过滤作用

空气和不耐热的液体培养基的灭菌

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