枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验
更新时间:2024-04-11 10:46:01 阅读量: 综合文库 文档下载
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验
化学与生命科学学院
摘要:以枯草芽孢杆菌(BacilusSubtilisBF—7658)为实验菌株,通过种子扩大培养,选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活,来初步估计发酵最佳时期和终点。
关键词:枯草芽孢杆菌,α-淀粉酶,液体摇瓶发酵,酶活
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称,包括α-淀粉酶、β-淀粉
酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶,其中α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶,能够切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键,将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖;而异淀粉酶又称淀粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶,此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1,6-糖苷键,将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验,我们可以以酶活为依据,初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
实验材料和方法
一、实验材料:
(一)实验菌株:以枯草芽孢杆菌(BacilusSubtilisBF—7658) (二)培养基: 1、种子培养液
葡萄糖 1%
Tryptone(胰蛋白胨):1%, Yeast Extract(酵母提取物):0.5%, NaCl(氯化钠):1% 调pH7.2
若配置固体培养基,则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液
玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 %
MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0
(三)0.02M磷酸缓冲液(pH6.0) (四)实验仪器
离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管
二、实验
1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。 2、种子斜面及种子液准备
– A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养
基,37℃,24h作菌种(3支/组)。
– B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于
250mL三角瓶中灭菌( 100KPa 20min )。
– C. 在无菌操作条件下,将活化的菌株接种于以上培
养液中(每支斜面接两瓶),37℃ 120r/min振荡培养16h作种子液。 (6瓶/组) 3、发酵培养
– 按15-20%的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵
培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。
– 在无菌操作条件下,每4h取样2mL,测定酶活。
40-48h酶活降低后结束实验。
三、α淀粉酶活性测定
(1)上清酶液:发酵液0.8ml 5000rpm/5min,吸取上清0.5ml备用。
(2)吸取0.1mL标准糊精溶液,转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中,以此作为比色的标准。
(3)在比色管中加入2%可溶性淀粉液20mL,加磷酸缓冲液5mL,在60℃水浴中平衡约5min,加入0.5mL上清酶液,立即计时,并充分混匀。 (4)定时(~15s)取出0.1mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板孔内,当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色,与标准孔色相同时,即为反应终点,记录时间t
四、计算酶活
计算淀粉酶活力
酶活力(U/mL) =(60/t×20×2%×n)÷0.5
? 式中t为反应时间(分), ? n为酶液稀释倍数, ? 0.5是使用的酶液量(mL), ? 20是可溶性淀粉溶液体积ml 五、溶液配制
碘原液:
– 1.1克碘化钾加少量水溶解,加入碘0.55克,溶解后定容至25ml,
贮于棕色瓶中;
0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)
– 称取45.23g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、8.07g柠檬酸,用水
溶解并定容至1000mL,配好后用pH计校正其pH至6.0。
比色用标准碘液:
– 取碘原液2ml,加碘化钾20g,蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中;
2%可溶淀粉:
– 称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状,在搅拌下缓缓加入约70mL
沸水中,然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水,继续加热煮沸至透明(约20min),冷却后加水定容至100ml。(当天配制)。
标准糊精溶液
– 称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀,倾入80-90ml沸水中,冷
却后加水定容到100ml
结果
α-淀粉酶产生的时间
在上述培养条件下,12小时之前蛋白酶活力较低,36小时达到高峰,继续培养至60小
时,酶活逐渐下降,结果见表1。 表α-淀粉酶活力与培养时间的关系 .
发酵时长 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 取样瓶号 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-1-1 1-1-2 1-1-3 1-2-1 1-2-2 1-2-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3
α-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强,进入对数期后,酶活显著提高。
pH 加入酶与溶液的量 发酵上清酶活测量 平均酶稀释倍反应时稀释倍反应时活 数 间 数 间 1 无终点 1 无终点 0 1 无终点 1 无终点 0 1 无终点 1 无终点 0 1 3'21'' 1 4'01'' 1.32 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2'58'' 4'12'' 3'58'' 2'02'' 1'33 49'' 1'08'' 58'' 3'49'' 1'25'' 1'44'' 2'07'' 2'30'' 2'11'' 4'18'' 2'38'' 2'30'' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3'33'' 4'47'' 4'32'' 2'14'' 1'27'' 1'02'' 1'20'' 57'' 0.74 1.074 1.134 2.256 3.204 5.262 3.918 9.2 44h酶活 6.77 6.73 0.5mL酶 2mL淀粉 6.43 6.64 0.5mL酶 2mL淀6.63 粉 6.73 6.78 6.74 0.5mL酶 2mL淀粉 6.77 6.53 6.58 0.5mL酶 2mL淀6.57 粉 0.5mL酶 3mL淀6.53 粉 0.5mL酶 4mL淀6.27 粉 6.85 6.57 7.05 0.25mL酶 2mL淀6.78 粉 6.61 6.54 6.77 4'57'' 1.392 1'40'' 2'07'' 2'49'' 2'25'' 2'22'' 4'30'' 2'15'' 2'44'' 3.92 3.148 2.482 2.441 2.642 1.364 2.473 2.298
培养至36小时,随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶,酶活达到高峰。
参考文献
1.唐丽江,王振华,王迪.安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53 62-5363,5371
2. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化[J]. 食品与生物技术学报, 1984, (02)
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