微生物工程实验报告 - 图文

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告

实验一 培养基的配制和灭菌

一、目的要求

1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。 4.每2人一组，每人一份实验报告。

二、实验材料

1、药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、1N HCl、1N NaOH。

2、设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。

3、材料：天平、药匙、电炉、pH试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签等。 移液器（1mL 0.2mL）。

三、实验内容

(一) 培养基的配制 1、培养基的配制方法和步骤

1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。 2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 3)调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。 5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。 6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。 7)灭菌：在高压锅中， 115 ?C高温灭菌30min。 2、培养基的配制

A. 富集培养基（液体）：

海水2216E液体培养基（g/L）：蛋白胨 5.0，酵母粉 1.0，海水1L，pH 8.0。

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取50mL分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸， 121 ?C高温灭菌20min。

B. 2216E斜面（固体）：

海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入3mL，121 ?C高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。2支/小组，共65组，130支。（15×150规格，带试管帽）300 mL。 C. 无菌生理盐水和保种液：

生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121?C高温灭菌20min。

保种液：生理盐水，加25%甘油。 D. 碳源优化培养基：

以海水2216E液体培养基（蛋白胨 0.5%，酵母粉 0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。

优化实验中每小组做1种碳源，即5个小组完成一个碳源优化实验。 每种碳源配12瓶（50mL/个三角瓶，共600mL。8层纱布封口，外包1层牛皮纸，灭菌。）

(二) 分离培养微生物常用器皿的准备

1、清洗一些玻璃仪仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿等。 2、制作8层纱布（108个），酒精棉（2瓶）。

3、Tip头（0.2，1ml，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）； 保种管（6支/包，共12包）

药勺（1把/包，共12包，包好，灭菌） 长竹签（6支/包，共12包，包好，灭菌） 4、卫生 （308实验室 超净台，实验台面） (三) 培养基和玻璃器皿的灭菌方法 1、加压蒸汽灭菌法。其步骤如下：

1)灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2)接通电源，进行加热。

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3)排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到将近零时，再关闭排气阀。

4)当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时,此时灭菌锅内的温度为121℃,维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。

5)灭菌时间一到，切断电源。待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。 2、紫外线灭菌

一般使用30W灯管，9m3空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此上适用于空气表面杀菌。 3、化学药剂消毒灭菌

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。

四、思考题

1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 答：固体培养基加琼脂后加热溶化时应该注意一下问题：

1) 在加热融化时要注意温度。因为琼脂是由从石花菜中提取的胶体多糖制成，

它在98℃水中能溶解，温度降至45℃时就凝成固体。所以温度太低时会使琼脂凝成固体，太高又会使其糊化；

2) 受热要均匀，可以垫上石棉网，在加热过程中，要用玻璃棒不停缓慢搅拌, 防

止糊底或者是溢出，加热溶化后要注意补充所失水分； 3) 加热完毕后，需在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。

2、培养基中加琼脂的作用是什么？

答：琼脂性质稳定，不能被大部分微生物水解利用。它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后（40℃以下）即凝固

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为固体状成凝胶。

培养基中加琼脂的作用是：

1) 用作凝固剂。琼脂是多糖类物质，性质较稳定，一般稳定后不易分解，所以

一般用作凝固剂而不引起化学成分的变化；

2) 具有支持作用。琼脂冷却后是固体，可用于配置所需的固体培养基，作用类

似于支架。

3) 用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种

时，也不致将培养物烫死。

3、如何检查培养基灭菌是否彻底？ 答：检验培养基灭菌彻底的方法：

把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。

1) 如果培养基基本无变化，说明灭菌效果良好；

2) 如果培养基上某一位置出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，

或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；

3) 如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，即灭

菌不彻底，应提高压力或延长灭菌时间。

实验二 产碱性蛋白酶海洋细菌的分离筛选

一、目的和要求

1、根据一定的实验目的如酶类的生产，建立合适、精确的筛选模型，并从特定的样品如海泥中筛选出高产菌株。

2、加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。

二、仪器与试剂

1、仪器设备：灭菌锅，培养箱，摇床，玻璃仪器。 2、需准备的培养基

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A.富集培养基（液体）：

海水2216E液体培养基（g/L）：蛋白胨 5.0，酵母粉 1.0，陈海水1L，pH 7.6。 取50mL分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸， 115 ?C高温灭菌30min。

B. 2216E斜面（固体）：

海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入5mL，115 ?C高温灭菌30min，灭菌后摆斜面。 C. 无菌生理盐水： NaCl 0.85% 去离子水配制。

每支试管加入4.5mL，盖上试管帽、包扎、115 ?C高温灭菌30min。 D. 碱性蛋白酶筛选培养基：

海水2216E-脱脂奶粉平板：A：4%脱脂奶粉，蒸馏水；B：海水2216E液体培养基中加4%琼脂粉，pH10.0。A和B 115 ?C高温灭菌30min后稍冷却，将A在无菌超净台中倒入B中，摇匀后倒入无菌平板。（B瓶要大）

三、实验方法

1、样品富集

取少量海泥样品加入富集培养基中，28℃，150rpm振荡培养24小时。 2、稀释涂平板

摇匀富集后的富集培养液，用无菌生理盐水作梯度稀释（注意：在管上做好标记），取0.5mL菌液加入到4.5mL的无菌生理盐水中得到的是10-1，然后从10-1的试管中取0.5mL加入到另一支含4.5mL无菌生理盐水的试管中，此时得到的是10-2，依次类推得到10-5，10-6的稀释液，至10-5、10-6后各涂1个筛选平板， 在28℃培养24小时。

注：前两步已在昨天完成，今天的主要任务是完成第三步。 3、产蛋白酶菌株的筛选

观察筛选平板上所产生的水解圈，拍照。每组选取1株水解圈大而明显的菌株，接在斜面培养基上培养。 实验照片：

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注：图片中所示的红色箭头表示该菌体生长较好。 四、思考题

1、分析本实验中富集培养的原理。

答：富集培养:利用不同微生物间生命活动特点的不同制定特定的环境条件使得仅适用于该条件的微生物旺盛生长，从而使目标微生物成为优势种而得到纯培养。

富集培养实质上是:一类使混合微生物群体中某特定微生物比例激增的培养方法。其一可用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件；其二可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。

在本实验中采用的富集培养原理为第一种，即促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养条件。从而使目的菌能利用所提供的营养原料而快速生长，其他菌则因为生长原料的缺乏而生长缓慢或者是不能生长。继而将目的菌与其他菌分离开来。

2、筛选平板上的透明圈是否能准确表示蛋白酶活的大小？ 答：不能。原因如下：

筛选平板上的透明圈只能显示出所培养的各种菌哪些有产蛋白酶的能力，以及菌产蛋白酶能力的高低,透明圈越大表示蛋白酶活力越大，从而筛选得到能产蛋白酶的目的菌株，只能表示蛋白酶的多少。

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如果是两个或两个以上的菌长在一起，则其透明圈有可能会比单菌的透明圈大。

因此不应以透明圈的大小来判断蛋白酶活性的大小。要想得知蛋白酶活的大小，则应根据水解圈直径( D )与菌落直径( d )的比值(D / d)的大小来判断。

实验三 微生物接种和菌种保藏

一、实验目的和内容

1、目的：了解并掌握微生物接种和菌种保藏的常用方法及其优缺点。 2、内容：学习斜面传代保藏方法；学习-80℃甘油保藏方法。

二、实验材料和用具

1、菌种：实验2中分离得到的海洋细菌。 2、培养基：海水2216E培养基。 3、试剂 ：陈海水 甘油、NaCl、无菌水。

4、材料：无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌保种管、接种环。

三、操作步骤

(一) 斜面传代保藏法

1.贴标签： 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。

2.斜面接种：将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上。 3.培养： 海洋细菌28℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

4.保藏： 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。海洋细菌16℃生化培养箱保存。管口应用牛皮纸或保鲜袋包扎。 (二) -80℃甘油保藏法

将筛选后的菌株（筛选平板上）接种于2216E斜面上，28℃培养12～18h，用无菌保种液（甘油）洗下（用到振荡器、无菌操作），移液器加入保种管，写好标记，保存于－80℃超低温冰箱（2份/菌）。

四、思考题

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1、讨论各种菌种保藏方法的优、缺点。

答：菌种保藏的方法有：普通冷冻保藏法、液氮冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法、矿物油浸渍保藏法、传代保藏法（定期移植保藏法）、沙土保藏法等。 1) 普通冷冻保藏法

优点：保藏的菌种范围广；实验条件容易得到满足。保藏时间较短一般为1--2

年。

缺点：低温只能一直微生物的生命活动，而不是使其休眠，因而保藏时都会带有

一定的水分，所以保藏时间不宜太长；避免停电等事故，防止保藏过程中的意外发生；经次解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜多数微生物的长期保藏。

2）液氮冷冻保藏法

优点：保藏的质量高；保存的时间长，一般为10年左右。 缺点：实验条件所需的费用高。

3）冷冻干燥保藏法

优点：本法适用于多种放线菌、细菌，多数情况下也适用于病毒、噬菌体、立克

次氏体、真菌和酵母等微生物；可用此法保藏的菌株范围广。保藏期限在10年以上。

缺点：霉菌菌丝、大多数藻类、原虫及病原菌不宜用此法保藏；在真空干燥的过

程中可能引起DNA断裂的缺点，因而对生产菌种不太理想。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖，冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。

4）矿物油浸没保藏法

优点：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入无菌矿物油中于室温下保藏，此方法简

便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。本法不需要特殊的设备，可延长移植间隔时间，一般可达1--3年，少数微生物每隔六个月移植一次。

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缺点：本法不适合固氮菌、乳酸杆菌、分歧杆菌、沙门菌、毛霉、根霉等菌；容

易变异。工业上高产菌株一般也很少用此种方法。

5）传代保藏法（定期移植保藏法）

优点：此法简单和经济，可用于实验室中若干菌种的保藏及某些特殊菌体的保藏

例如：霍乱菌，脑膜炎球菌等；方法简单；保藏时间为1--3个月。 缺点：容易发生遗传变异；连续传代后一些有利性状如所要求的病原性、代谢产

物的生产能力、产孢子能力等减弱；容易造成杂菌污染；培养基组分及培养温度的细微变化可能导致丧失贵重菌株；易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。

6）沙土保藏法

优点：本法适用于产芽孢或孢子的细菌、放线菌和真菌的保藏；本法操作简便。

易于掌握，青霉素及其他霉素菌不少菌种用此方法保藏，可存活5-7年。 缺点：存活率低，变异率高。特别是抗生素工业上的高产菌株采用本法保藏时对

高产特性的保藏效果差，仅在真空干燥这一步，不少军菌的死亡率即达90%以上。另外，在真空后容易引起DNA断裂致使菌体发生变异。

7) 液体石蜡保藏法

优点：此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母

菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。

缺点：保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面

取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

8）-80℃甘油保藏法

优点：该方法适合于中长期菌种保藏，保藏时间一般为2—4年左右。保藏过程中

培养基的理化性质稳定，菌种不容易发生变异，且微生物的性状比较稳定，

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不容易污染杂菌。

缺点：是无法随时检查保藏菌株的生长代谢状况，只能进行中、长期保藏。

实验四 菌种的紫外诱变筛选

一、实验目的

1、学习菌种的诱变育种（物理诱变）基本技术。 2、通过诱变技术筛选出高产蛋白酶的菌株。

二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其光谱比较集中在253.7nm 处， 这与DNA 的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形 成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用 此法获得突变株。紫外线诱变一般采用15W 或30W 紫外线灯，照射距离为20~30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在50％~80％为宜。 被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变 剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数 生长期为最好。

本实验以紫外线处理产蛋白酶的海洋细菌，通过透明圈法初筛，选择蛋白酶 活力高的菌株。

三、实验材料

1、菌种实验二筛选得到的产蛋白酶菌株。

2、器材装有15W 或30W 紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、 低速离心机、培养皿、涂布器、10mL 离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL 三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。 3、培养基和试剂

1) 无菌生理盐水、75%酒精 2) 筛选培养基：脱脂奶粉培养基 3) 海水2216E 液体培养基

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四、实验步骤

（一）出发菌株菌悬液的制备

1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，25℃培养16~24h；

2. 将活化后的菌株接种于液体2216E 培养基，25℃ 150rpm 振荡培养过夜（约 12h；

3. 取4ml 培养液于5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐 水恢复成菌悬液；

4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min，以打散细 胞；

5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注海水 YPD 平板，每一梯度倾注两皿，每皿加0.5ml 菌液，25℃倒置培养24~36h， 进行平板菌落计数。 （二）UV诱变

1. 将紫外灯打开，预热30min；

2. 取直径6cm 的无菌培养皿（含磁力搅拌子），加入菌悬液5ml，控制细胞密 度为107~108 个/ml；

3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1 分钟后开启磁力搅 拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理20s、40s、60s、90s、120s， 照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；

4. 将诱变菌液在黑暗中培养1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。（避光培 养）。

(三) 优良菌株的筛选

1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透 明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落10～20 个，作为复筛 菌株。

2．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入复筛培养基中进行25℃培养，培养3d 检测蛋白酶活性。

附一：蛋白酶活性的测定

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采用folin酚法，1ml酶液（上清液）在40℃下水解1.0ml2%(w/v)的酪蛋白（底物）30min，在上述条件下每分钟释放1ug的酪氨酸所需的酶量为一个单位（U） 步骤：

1．发酵液于4℃下经5000rpm离心10min得发酵上清液

2．测定组：取0.5ml酶液（上清液）与1ml2%（w/v）底物溶液，（事先40℃，预热5min）混合后，40℃反应30min，加入3ml10%（w/v）TCA终止反应，10000rpm离心15min，取上清液。

3．对照组：取0.5ml酶液，先加入3ml10%（w/v）TCA再加入1ml0.5%（w/v）溶液，40℃条件下反应30min，10000rpm离心，取上清

4．3只大试管，每管分别加入1ml测定组上清液，1ml对照组上清，1ml蒸馏水，每管加入0.55M NaCO3 5ml，混匀后加入folin-酚试剂1ml立即混匀，30℃条件下显色15min，以加蒸馏水的试管做空白，650nm处测定测定组和对照组的OD值。

酶活单位：（OD样—OD对照）*K*V/T*N OD样：测定组吸光值650nm OD对照：对照组吸光值650nm T：时间 V：3.5 N：稀释倍数

K：标准曲线上光吸收为1时，酪氨酸ug

五、实验数据

实验测得：OD对照=0.301 OD测定=0.556 将K=114.7 ,T=40min, V=4.5代入公式得：

故：酶活=（OD样-OD对照）×K×V÷T÷5≈0.658 g酪氨酸/0.5ml

实验照片：

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五、思考题

1、试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。 答：（一）紫外线诱变的作用机理：

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，波长在200-380nm之间，但其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体阻碍碱基间的正常配对，从而形成突变型。

在生产和科研中可利用此法获得突变株。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3 min，死亡率控制在50％-80％为宜。 （二）操作中应注意的问题：

1）细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好； 2）在使用紫外灯之前要先开30min进行预热，使其达到稳定状态； 3）紫外照射后，在黑暗中保持一段时间，从而避免光复活；

4）被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现；

5）操作过程中注意避免皮肤等被紫外线照射到，尤其防止紫外线对眼，脸部位的辐射损伤；

6）诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行；

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7）注意控制照射的时间和强度。否则紫外线会杀死细胞或者微生物，达不到诱变的效果。

2、为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？

答：诱变前将菌悬液打散和培养一段时间，可以使其与培养液充分混合。 1）不仅能够减少不纯种的出现，并且利于均匀接触诱变剂； 2）有利于菌种复苏生长，进入对数生长期；

3）使菌液均质，有利于紫外光的均匀分布处理，增加每个菌体与紫外线接触的机会。

3、你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？ 答：以上的筛选方法主要是从产物的角度出发进行筛选。

优点：简单快速。初筛主要是从量的角度筛选，复筛主要是从质的角度筛选，二

者配合可大幅提高筛选的效率。

缺点：因为培养条件的差别，有时会造成初筛与复筛的结果不一致。 改进措施：

在筛选过程中：1）首先进行初筛的菌株可以选择多株菌种进行复筛，并进行平

行实验，为复筛准备；

2）复筛过程中，对于所选择的多株菌株同时再次筛选，并对比观察，挑选出最为优质的菌株作为目的菌，同时进行多次平行实验，从而对比选择出最优菌株。

实验五 单因子实验方法进行碳源优化

一、目的和要求

掌握微生物发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 目的：筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，确定特定产物发酵的工艺参数。

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二、仪器与试剂

1、仪器设备：分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。

2、玻璃仪器（每组需用量）：250 ml三角瓶5个， 500 ml烧杯1个，100 ml量筒1个，1mLTip头1盒。

3、需准备培养基（实验一已完成）。

三、实验方法

(一) 培养基的配制（碳源的优化）

以海水2216E液体培养基（g/L：蛋白胨 5.0，酵母粉 1.0，磷酸铁0.01，pH调至7.6-7.8）为基础， 碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、海藻糖和乳糖，每种碳源的添加量为1%。 （二）测定方法

在种子瓶内接入1环斜面培养基上培养的细胞，28°C，160r/min振荡培养12h作为种子液，将该种子培养液按2%(v/v)接种量（1mL）接种到含50 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中再次进行摇瓶发酵，摇床转速160 r/min，28 °C发酵培养24 h，取培养液测细胞干重。

细胞干重测定：取离心管，首先称重M0，然后将发酵液摇匀，移液器取1mL加入离心管，1200rpm离心1min，小心吸出上清液，保留细胞沉淀，如此做三次，最后将离心管开口放入烘箱中烘干至恒重，再次称重M，计算差值M-M0。 实验数据： 单位（g/L） 葡萄糖 蔗糖 甘油 柠檬酸钠 乳糖

以细胞干重值为纵坐标，各种碳源为横坐标作图，比较不同碳源对细胞生长的影响，确定最佳碳源。

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菌体重量1 0.002 0.008 0.003 0.003 0.014 菌体重量2 0.001 0.006 0.004 0.002 0.013 菌体重量3 0.002 0.006 0.005 0.002 0.014 菌体重量平均值 0.0017 0.0067 0.004 0.0023 0.0133

从上述的实验数据及柱形图可以得知：对目的菌株最适合其生长的碳源是乳糖。

四、思考题

1、 对实验结果进行分析，讨论不同碳源对菌株生长的影响。

答：1）目的微生物对碳源的利用情况依次为：乳糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、葡萄糖。

2）本实验中最有利于目的微生物生长的碳源是乳糖；

3）葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用它。但是在本实验中它却是相比较而言最不适合目的微生物生长的碳源。

2、结合已学过的微生物工程理论课，讨论单因子实验方法的优缺点。 答：单因子实验的基本原理：假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。

应用：由于它的容易、方便，单因子方法一直以来都是培养基组分优化的最流 行的选择之一。

优点：1）简单容易，能够比较明显的检查出实验效果如何；

2）培养基组分的个体效应从图表上明显可见，而不需要统计分析。 缺点：1）忽略了组分间的交互作用，可能会丢失最适宜的条件；

2）不能考察因素的主次关系；

3）当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。

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