2009期末考试论文格式及参考模板

论文格式要求

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二、论文格式

************（中文题目，一般不超过20个字）

院系名称（小四号黑体）作者姓名（小四号楷体）指导老师的姓名和职称：请在学生作者的署名下方另起一行注明。

摘要（五号黑体）：*****************************（中文，五号仿宋。摘要是科研论文主要内容的简短、扼要的重述，必须表达论文本身新的、最具特色的内容，重点是结果和结论；.一般以第三人称的语气写，避免用―本文‖、―我们‖、―本研究‖等作为文摘的开头。）

关键词（五号黑体）：***************************（中文，五号仿宋，一般选取3～8个词，每个词之间应留有空格以区别之。）

正文（五号宋***************************************************** ******************************************************************** ********************************************************************* 说明：①文内必要的解释性说明词语可采用―注释‖形式，其序码以圆括号放在加注处右上角，内容排在加注处所在页的页下，页下注序码每页单独排序。②表格设计必须清晰、规范，每个表格除有栏头、表身外还应在表的上方居中标明表序和表题，中间空一格将两者分开；表随文放，一般应列在―见表×‖文字的自然段落的下面，在正文中要明确提及见表×；表格一般采用三线表。③插图要求大小比例适中，数字清晰，照片黑白对比分明；图也应随文字放在“见图×”文字的自然段落下面；每幅图都要有图序和图题，通常写在图的下方居中位置。④论文内各大部分标题用“一、二┅┅”，次级标题为“（一）、（二）┅┅”，三级标题用“1、2┅┅”，四级标题用“（1）、（2）┅┅”。不再使用五级以下标题。

参考文献（黑体五号，在正文后居中排版）

参考文献是期刊时为…序号?著者.题名[J].期刊名，出版年份，卷号(期号):页码. 参考文献是图书时为…序号?著者.书名[M].版次.出版地:出版社,出版年份.页码.

*************（英文题目，小四号Times New Roman）

Abstract:*********************************************************** ******************************************************************* Key Words: ****；****；****

附：医科论文格式样板参照

人纤溶酶原K5基因与真核表达载体pPICZαA重组体的构建

光华口腔学院陈素洁

指导教师蔡卫斌高国全

摘要: 以K5/pET22b（+）为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原kringle5基因，并用Xba I 和EcoR I双酶切目的基因和真核表达载体pPICZαA，胶回收试剂盒纯化酶切产物，用DNA T4连接酶连接目的基因和载体构建重组体K5/pPICZαA，并转化进大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落，PCR鉴定重组体K5/pPICZαA，为人纤溶酶原K5在真核系统中表达提供基础性研究。

关键词: 人纤溶酶原; kringle结构; 基因克隆

新生血管的生成为恶性肿瘤生长提供营养，也是恶性肿瘤转移的必要条件，抑制新生血管在一定程度上可以减缓肿瘤细胞的恶性扩增，因此，基于抑制血管生成的治疗成为肿瘤治疗的热点。1994 年, O`Reilly 等人从荷瘤小鼠的尿液和血清中分离纯化得到血管生成抑制素(angiostatin) , 它与人纤溶酶原kringle1～4 功能区有同源性, 具有抑制毛细血管内皮细胞增殖、抑制血管生成和转移瘤生长的生物活性[1]。动物试验研究还表明, 血管生成抑制素对纤维肉瘤细胞株、人乳腺癌、结肠癌、前列腺癌细胞株在小鼠体内形成的肿瘤也有很强的抑制作用[2]。最近, Gao 等[3]发现人纤溶酶原的kringle5 功能区有比angiostatin 更强的抑制内皮细胞生长的活性。本课题在已获得原核体系中表达的活性K5蛋白基础上，进一步构建K5/pPICZαA重组体，以期在真核表达体系中获得有活性K5蛋白。

一、材料和方法

（一）材料含K5/pET22b（+）重组体的E.coli BL21(DE3)为本室构建并保存；EcoR I 和Xba I为New England公司产品；酵母粉、胰蛋白胨为OXIOD公司产品；IPTG购自北京鼎国生物技术公司；抗生素zeocin为Sigma公司产品，pfu Tag DNA聚合酶和质粒pPICZαA均购自invitrogen公司，DNA胶回收试剂盒购自NOVAGEN公司，其他试剂为分析纯；引物由赛百盛公司合成。

（二）聚合酶链反应（PCR）扩增K5基因以K5/pET22b（+）重组体为模板，上游引物为：5`-CGAATTCCCAGATGTAGAGACTCCTTC-3`，5`端设计有EcoR I的酶切位点；下游引物为：5`-CTCTAGAGCGGCACACTGAGGGACATCACA-3`，5`端设计有Xba I的酶切位点，建立PCR反应体系：ddH2O 38μl，10?pfu Buffer 5μl，4?dNTPs 4μl，K5 primer(+) 0.7μl，K5 primer(-) 0.8μl，K5/pET22b（+）1μl，pfu Tag DNA聚合酶0.5μl。混匀后，进行PCR反应，反应条件：95℃预变性3m，95℃变性80s，54℃复性100s，72℃延伸2m，循环30次，72℃延伸10m。扩增完毕后，取样5μl，于1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测是否有扩增产物K5基因。

（三）K5基因和载体的酶切及酶切产物的纯化PCR产物K5 DNA片段经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，用EcoR I 和Xba I两种酶同时消化，质粒pPICZαA同样用EcoR I与Not I进行双酶切，双酶切体系组成：ddH2O 39.5μl，10?Buffer 5μl，100?BSA 0.5μl, DNA 2μg , EcoR I 1.0μl, Xba I 1.0μl，总体积50μl。酶切产物按照DNA胶回收试剂盒操作方法进行纯化，纯化产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用Genegenuis凝胶分析系统进行DNA相对定量。

（四）重组体的构建及转化纯化后的产物在T4 DNA 连接酶作用下进行连接反应，反应体系：K5 DNA 8μl，pPICZαA 1.0μl，Buffer 2.0μl，T4 DNA Ligase 1.5μl，ddH2O 6.5μl，总体积20μl。反应液于16℃水浴反应18小时，置于4℃待转化。然后导入感受态的大肠杆菌DH5α（感受态细胞的制备参见《分子克隆》），涂布于含25μg/ml zeocin抗生素的LB板上，37℃过夜培养。

（五）阳性菌落的筛选及鉴定挑取LB平板上单克隆菌落，接种于无菌含25μg/ml zeocin 的LB培养基，过夜培养。参照《分子克隆》中质粒DNA提取方法抽提培养物的质粒DNA，TE溶解DNA，于-20 ℃保存。以抽提DNA为模板，引物和PCR体系同前，鉴定菌落DNA中是否存在目的基因，初步判定重组体构建成功与否。

二、实验结果

（一）PCR反应获得目的基因K5片段通过PCR反应获得K5基因片段，1.0%琼脂糖凝胶

电泳示目的基因大小约为288bp （如图1所示，含设计的双酶识别序列），与理论推测的基因片段大小一致。

图1. PCR 反应扩增目的基因 1~7：PCR 扩增的目的基因片段；M ：标准分子量DNA 片段

（二）K5基因和pPICZ αA 载体双酶切产物的纯化和定量 目的基因K5和载体pPICZ αA 经EcoR I 和Xba I 消化后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒纯化酶切产物（如图2A ），并电泳鉴定纯化后的产物，Genegenius 凝胶分析系统对DNA 进行相对定量示：K5 为14.7ng/μl, pPicz αA 为29.4 ng/μl 。

图2. 目的基因与载体双酶切及酶切产物纯化与相对定量

A ：酶切前后；

B ：酶切产物纯化后鉴定；1：酶切前载体pPICZ αA ；2：酶切后PCR 产物；3：酶切后载体pPICZ αA ；4：PCR 酶切产物纯化后；5：载体酶切产物纯化后；M ：标准分子量1 100bp 200bp

300bp

400bp

500bp 600bp 700bp 800bp 900bp 1038bp 289bp 1 2 3 4 5 6 7 M

A B 2 3 4 M 5

100bp

200bp

300bp

400bp

500bp 600bp 700bp 800bp 900bp 1038bp

DNA 片段

（三）PCR 鉴定阳性菌落 转化菌接种含有25μg/ml zeocin 的LB 平板后，有单克隆菌落产生，挑取菌落扩增培养抽提质粒DNA ，以其为模板PCR 鉴定含重组体菌落（如图3）：从重组菌质粒DNA 中能扩增出目的基因片段，大小与从阳性K5/pET22b （+）扩增出的目的基因相一致，而以空载体为模板则不能扩增出目的片段。

图3.SDS-PAGE 分析重组转化菌株表达产物 1：阳性模板K5/pET22b （+）扩增产物；2：重组菌质粒DNA 扩增产物；3：质粒pPICZ αA

扩增产物；M ：DNA 分子量标准

三、讨 论

人纤溶酶原kringle5 功能区具有抑制毛细血管内皮细胞增殖 、迁移的作用[3，4], 这是血管形成过程的两个关键步骤，推测人纤溶酶原kringle5 功能区可能具有抑制血管形成和肿瘤生长的特性。本课题组已获得从原核体系中表达的活性K5蛋白，但对其活性是否受细菌内毒素的影响及其天然构象是否发生改变尚不清楚。本实验是前期工作的基础上，构建K5与真核表达载体pPICZ αA 的重组体，为下一步的K5真核表达体系的建立提供给出行研究。

人纤溶酶原的Kringle 5功能区约由91个氨基酸组成，编码该蛋白的基因约有289bp 。本实验首先用PCR 的方法从K5/pET22b （+）扩增出目的基因，其大小理论推算一致。目的基因和载体pPICZ αA 均用EcoR Ⅰ和Xba I 两限制性核酸内切酶酶切，产物纯化后进行连接反应，并转化进宿主菌DH5α，挑选单克隆菌落，PCR 方法能从重组菌中扩增出目的基因片段，初步鉴定了K5/pPICZ αA 重组体，为后续工作提供基础。

参 考 文 献

[1] O`reillym S, Holmgren L, Shing Y, et al . Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma [J ]. Cell , 1994, 79: 14.4kD

1 2 3 M

100bp

300bp

500bp 700bp

目的基因

315-328.

[2] O`reillym S , Holmgren L, Chen C, et al. Angiostatin induces and sustains dormancy of human

primary tumors in mice [J ] . Nat Med, 1996, 2: 689-692.

[3] Zhang D, Kaufman PL, Gao G（高国全）, et al. Intravitreal injection of plasminogen kringle 5,

an endogenous angiogenic inhibitor, arrests retinal neovascularization in rats. Diabetologia 2001 Jun;44(6):757-65.

[4] Gao G（高国全）, Li Y, Gee S, et al. Down-regulation of vascular endothelial growth factor and

up-regulation of pigment epithelium-derived factor: a possible mechanism for the anti-angiogenic activity of plasminogen kringle 5. J Biol Chem 2002 Mar 15;277 (11):9492-7.

Construction of the Recombinant of Plasminogen Kringle 5 and pPICZαA

Abstract :The gene encoding kringle 5 of human plasminogen was amplified from the template of K5/pET22b（+）by polymerase chain reaction. The K5 gene fragment and the vector of pPICZαA were digested by Xba I and EcoR I. The product of digestion was purified by gel purification kit and ligated by T4 DNA ligase to construct the recombinant of K5/pPICZαA. Then the recombinant was transducted into E.coli of DH5αand cultured overnight. The colony was screened by the antibiotic of zeocin and identified by polymerase chain reaction.

Keywords : human plasminogen；kringle5 domain；gene cloning；

FoxP3的研究新进展

中山医学院张良明

指导老师彭辉

摘要：FoxP3是一个转录因子，它和调节性T细胞的发育和功能密切相关。FoxP3表达过多或者过少都会影响到机体中免疫系统，FoxP3基因的突变更会引起严重的自身免疫病。对FoxP3的深入研究将有助于了解机体免疫调节机制，对于肿瘤治疗，自身免疫病治疗，诱导移植物耐受等方面将大有好处。

关键词：调节性T细胞；CD4 + CD25 + 调节性T细胞；免疫调节；免疫耐受

调节性T细胞(Treg)是T细胞的一种，它们有控制免疫应答反应和诱导免疫耐受的功能。这些Treg在许多实验模型里都已经得到证实，一般是CD4+ T细胞，并且相当部分是表达CD25分子(IL-2 受体a链)，包括自然产生的(在胸腺里自然发育成熟的)和在外周血中的T 细胞经诱导产生的等。最近的研究表明Treg的功能相当广泛，它们几乎涉足所有的免疫反应，包括过敏症，感染，炎症，移植物排斥反应和肿瘤免疫等。另外，最近研究在早产婴儿的脐带血中CD25+ CD4+ Treg的减少规律这个实验还表明Treg在先天性免疫方面也发挥着重要的功能[1]。FoxP3是一个转录因子，它和调节性T细胞的发育和功能密切相关。下面就谈谈目前FoxP3的研究进展情况。

一、FoxP3的发现以及定位

转录因子是一些多结构域的蛋白质，常根据其结合DNA的保守区域来分类。forhead 区域第一次被证实是作为一个和老鼠肝细胞核因子3相同的果蝇melanogaster转录因子forkhead[2]。forkhead区域包含一段110bp的DNA结合的保守区域，它能通过特异性结合DNA而调节下游基因的表达。各种forkhead家族的转录因子在多种发育过程起重要作用，例如信号的传导，细胞的分化和发育等。FoxP3转录因子就是该家族的成员之一，它是在科学家在研究IPEX(The immune dysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome)时发现的，定位在X染色体上Xp11.23-Xq13.3 [3]。

二、FoxP3表达的细胞

Hori S 和Sakaguchi S等人已经证实FoxP3是调节性T细胞发育和功能的关键性基因，它主要在CD4+CD25+T细胞表达[4]。在老鼠和人上，胸腺和外周来源的CD4+CD25+T细胞都高表达FoxP3 mRNA ，特别是胸腺来源的。通过分析基因组的表达，Bruder D 等人发现Neuropilin-1(Nrp1)是CD4+CD25+T细胞表面的特异性标志物，Nrp1高表达的T细胞也高表达FoxP3 mRNA，同时有抑制CD4+CD25-T细胞的功能[5]。

虽然使外周血中的CD4+CD25- 细胞变成CD4+CD25+细胞的机制还有待进一步研究，

但最近的研究表明IL-2 和TGF-beta 通过作用CD4+CD25-细胞，然后，后者与CD25+ CD4+ 细胞接触而使其变成CD4+CD25+细胞，转变后的细胞表面表达FoxP3，具有抑制功能[6]。研究表明TGFbetal能够刺激CD4+CD25+ T-cells表达FoxP3，并且FoxP3的表达的量会随着TGFbetal的减少而减少[7]。

在日本的Takahata Y等人研究早产儿和新生儿的脐带血的实验中发现，早产儿脐带血中含有高比例的CD4+CD25+ T 细胞，而这个高比例会随着胎儿的生长而趋向一个正常成人的水平，胎儿脐带血中的CD4+CD25+ T 细胞也表达FoxP3，有抑制功能，这表明调节性T 细胞在人发育早期就出现的，而且发挥着调节免疫的功能[8]。

FoxP3在CD4+CD25-T细胞也可以低表达，但是其功能还有待进一步研究来确定。

总之，到目前的研究表明FoxP3基因主要在CD4+CD25+T细胞上表达，是调节性T 细胞发育和功能的关键性的基因。

三、FoxP3表达的产物以及其对自然发生的Treg的作用

以上的研究都表明FoxP3与Treg的发育与功能有极大的关系，那究竟它们是怎样的关系呢? FoxP3是在X染色体上的一段基因，是调节性T细胞表面最特异的标志，与调节性T 细胞的发育和功能有重要的关系[9]。FoxP3表达过多或者过少都会直接影响到T细胞的生长发育，甚至引发免疫性疾病。人们发现FoxP3的表达的蛋白质产物是scurfin，FoxP3有突变的老鼠会因为CD4+T细胞的高反应性而得严重的像自身反应性的疾病，相反大量表达scurfin的老鼠，就会导致身体内的成熟T细胞含量比正常老鼠的要少，而且经过分析其体内B细胞与TD-Ag的反应，发现血清中的特异性Ab的量减少和脾功能结构的混乱[10]。这其中的原因是过度表达scurfin使CD4+T细胞发育有缺陷，从而在依赖T细胞的Ab反应中不能够提供帮助给B细胞，所以血清中的特异性Ab就少了。在荷兰学者研究先天性青少年关节炎(juvenile idiopathic arthritis (JIA))试验中，发现预后良好的关节炎患者比预后差的患者体内外周血中的CD4(+)CD25(bright) FoxP3(+)T 细胞表达的量明显要多，在关节滑液的分析结果也显示预后良好型CD4+CD25+ T 细胞的总量相比较多[11]。这些研究都表明FoxP3能够调节Treg的生长发育，诱导机体免疫耐受，减少自身反应性疾病的发生。

另外，FoxP3在其它细胞上也可以表达，而且也能够发挥免疫抑制功能。最近研究表明体外产生的同种抗原特异性的CD8+ CD28- T抑制性细胞也表达FoxP3，它们与人类内皮细胞相互作用，使其表达抑制性受体支持分子和下调相互刺激的功能，导致内皮细胞的耐受[12]。FoxP3在肿瘤细胞也有表达，最近日本的研究者发现成人T细胞白血病\淋巴瘤(Adult T-cell leukaemia/lymphoma (ATLL))的瘤细胞也表达FoxP3，只不过表达的量比正常的少，这表明这些瘤细胞也有一定的调节功能[13]。

四、FoxP3作用的分子机制以及其诱导机制

既然FoxP3与调节性T细胞的发育和功能有这么多的联系，下面就谈谈FoxP3的作用机制以及FoxP3是怎样诱导产生的。

关于FoxP3的作用机制到目前为止还不是很清楚，但是此前的一些研究可以推测其机制可能与IL-2有关。FoxP3是一个转录因子，能够通过结合到DNA上，调节下游基因的表达。Hori和sakaguchi研究表明转导了FoxP3的初始T细胞，它们的IL-2，IL-4和IFN-gamma 的表达会被抑制[14]。早在2001年，就有人发现FoxP3的结合到DNA上的位点是在IL-2增强子附近的NFAT(nuclear factor of activated T cells)调节位点上，这样FoxP3就可以通过结合NFAT来抑制IL-2的增强子的活性，达到抑制IL-2的产生[15]。这也同样解析了表达FoxP3的CD4+CD25+ T 细胞不表达IL-2了。

FoxP3作为一个转录因子可以结合到DNA上，它有抑制的功能，但它也可能充当一个转录增强子的角色。CD25，GITR，CTLA-4和CD103等是Treg表面重要的标志性分子，和其调节功能有重要联系。有研究表明转导了FoxP3的T细胞能够多表达以上这些表面分子[14]。IL-10是一个负调节的细胞因子，通过诱导FoxP3可以诱导IL-10的产生分泌[15]。至于FoxP3是直接还是间接作用于基因而促进这些分子的表达，目前还不是很清楚。同样，FoxP3这个转录因子是直接还是间接调节Treg的发育和功能，目前也有待研究。

虽然FoxP3作用机制还不是很清楚，但是其免疫调节功能是无容质疑的，因此，人们千方百计地诱导它的表达。我们知道在胸腺中高亲和的TCR相互作用对CD4+CD25+ T 细胞的发育有重要的作用，那么FoxP3的表达与T细胞受体(TCR)有没有关系呢?为了确定它们的关系，研究者从无反应性的TCR转基因小鼠分离出CD4+CD25- T 细胞，然后用该转导的基因编码的同类的配体(高亲和性的自身MHC分子复合物)去刺激它们，发现其表达FoxP3，虽然没有自然产生的CD4+CD25+ T 细胞产生的量多，但是这足以提示TCR的作用可以诱导FoxP3的表达[16]。

胸腺产生的CD4+CD25+ T 细胞的FoxP3表达与TCR的作用有关，那么外周血中的CD4+ T 细胞FoxP3的表达与什么有关呢?人们研究发现TGF-beta与体内的FoxP3的表达有关。CD4+CD25+ T 细胞会随着TGF-beta增加而提高表达的量，同样，当TGF-beta刺激的信号减弱时，FoxP3表达的量也会减少[7]。最近的研究发现TGF-beta和IL-10一起作用目标细胞CD4+CD25- T 细胞，后者在通过与CD4+CD25+ T 细胞接触作用，使其转变成为CD25+细胞，表达FoxP3，具有抑制的功能[17]。另外，最近又有研究表明依靠TGF-beta能够在CD4 Ab被封闭后重新诱导移植耐受，诱导产生的表达FoxP3调节性T细胞会在移植物聚集，发生抑制作用，延长移植物的生存时间[18]。这些研究都表明，TGF-beta就能够促进FoxP3的表达，诱导Treg的产生，但是TGF-beta究竟是怎样作用的还有待进一步的研究。

五、FoxP3的表达与疾病

FoxP3基因的表达与很多疾病有关，下面从几个方面谈谈它们的关系。

（一）FoxP3与自身反应性免疫病的关系

FoxP3与多种自身反应性疾病有关。其致病作用主要是FoxP3影响Treg的功能而致病。最早发现与其有关的是IPEX(the immunodysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy syndrome)，这是一种和X染色体有关的隐性遗传病，主要由免疫调节功能混乱引起的自身免疫病，这个疾病的基因就是FoxP3，正是FoxP3基因的突变使Treg的量减少，对自身反应性T细胞的抑制作用减少了而致病[3]。与此相反，在研究风湿性关节炎过程中，人们用dnaJP1(一种可以诱导未经治疗的风湿性关节炎患者体内的前炎症T细胞反应的多肽)可以引起CD4+CD25+ T cell表达FoxP3，引起耐受，这样就可以减轻关节炎[19]。在与糖尿病的研究中，研究者发现TGF-beta在糖尿病的早期能够通过促进CD4+CD25+ T cell的生长发育从而抑制疾病的发生[20]。令人注意的是I型糖尿病虽然是自身免疫性疾病，但是最近意大利的研究者在研究撒丁岛糖尿病人的FoxP3基因时，发现I型糖尿病与FoxP3基因的变化并没有太大的关系[21]。总之，利用好FoxP3来诱导免疫耐受，对于治疗自身反应性疾病大有好处。

（二）FoxP3与肿瘤免疫

肿瘤治疗难与机体的免疫系统无法清除肿瘤细胞有重要关系，这其中机体对肿瘤的耐受又是主要原因。研究者发现转移性黑色素瘤（metastatic melanoma）淋巴结中表达FoxP3的CD4+CD25+ T细胞是没有发生肿瘤的淋巴结和外周血单个核细胞(PBMC)表达的量的两倍[22]。研究者在体外实验，这些细胞有抑制的功能，能够抑制CD4+CD25- T细胞和CD8+T 细胞的增殖，还可以通过接触抑制的方式抑制IL-2和IFN-gamma的释放，这些都不利于治疗转移性黑色素瘤，如果能够想办法减少体内的Treg，将大大有利于转移性黑色素瘤的治疗。

（三）其它

在HIV患者体内存在高水平的激活的T细胞，但是FoxP3并没有能够促进足够多的记忆性T细胞发展为Treg，研究者发现一部分HIV患者体FoxP3+CD4+CD25+ T细胞的水平已经大大的降低了。降低Treg的比例，提高激活的T细胞的比例，这样此消彼长，就会加重病情的进展[23]。另外，法国的研究者发现从HIV患者外周血中分离的CD4+CD25+ T细胞表达了一种记忆的显形，但是，与CD4+CD25- T细胞不同的是对于有记忆的抗原和p24的刺激，这些CD4+CD25+ T细胞并没有增殖。CD4+T细胞对于结核菌素，CMV和p24的刺激只有在CD4+CD25+ T细胞的减少的情况下才能增殖[24]。所有这些将会诱导机体对HIV耐受的产生，加重病情的发展。

另外，在移植中如果能够利用FoxP3来诱导机体对移植物的耐受，将会大大提高移植物的生存时间。

六、结语

FoxP3是一个与Treg的发育与功能有重要关系的转录因子，目前尚有许多问题有待进一步研究，对该转录因子的深入研究将有助于对机体免疫调节机制的了解以及对自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥等的病理、生理机制的认识，并为临床这些疾病的免疫治疗提供新的途径。

参考文献

[1] Xystrakis E, Dejean AS, Bernard I, Druet P, Liblau R, Gonzalez-Dunia D,Saoudi A. Identification of a novel natural regulatory CD8 T-cell subset and analysis of its mechanism of regulation.Blood. 2004 Jul 22 [Epub ahead of print]

[2] Weigel D, Jackle H. The fork head domain: a novel DNA bindingmotif of eukaryotic transcription factors? Cell 1990;63:455–456.

[3] Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, Kelly TE, Saulsbury FT, Chance PF, Ochs HD. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001 Jan;27(1):20-1. [4] Hori S, Nomura T, Sakaguchi S: Control of regulatory T cell development by the transcription factor FoxP3. Science 2003,299:1057-1061.

[5] Bruder D, Probst-Kepper M, Westendorf AM, Geffers R, Beissert S, Loser K,von Boehmer H, Buer J, Hansen W. Neuropilin-1: a surface marker of regulatory T cells.Eur J Immunol. 2004 Mar;34(3):623-30. Erratum in: Eur J Immunol. 2004May;34(5):1498.

[6] Fantini MC, Becker C, Monteleone G, Pallone F, Galle PR, Neurath MF. Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through FoxP3 induction and down-regulation of Smad7.J Immunol. 2004 May 1;172(9):5149-53.

[7] Schramm C, Huber S, Protschka M, Czochra P, Burg J, Schmitt E, Lohse AW,Galle PR, Blessing M. TGF{beta} regulates the CD4+CD25+ T-cell pool and the expression of FoxP3 invivo.Int Immunol. 2004 Jul 12 [Epub ahead of print]

[8] Takahata Y, Nomura A, Takada H, Ohga S, Furuno K, Hikino S, Nakayama H,Sakaguchi S, Hara T. CD25(+)CD4(+) T cells in human cord blood: an immunoregulatory subset withnaive phenotype and specific expression of forkhead box p3 (FoxP3) gene.Exp Hematol. 2004 Jul;32(7):622-9.

[9] Gavin M, Rudensky A. Control of immune homeostasis by naturally arising regulatory CD4+ T cells.Curr Opin Immunol. 2003 Dec;15(6):690-6.

[10] Kasprowicz DJ, Smallwood PS, Tyznik AJ, Ziegler SF. Scurfin (FoxP3) controls T-dependent

immune responses in vivo through regulation of CD4+ T cell effector function. J Immunol. 2003 Aug 1;171(3):1216-23.

[11] de Kleer IM, Wedderburn LR, Taams LS, Patel A, V arsani H, Klein M, de Jager W, Pugayung G, Giannoni F, Rijkers G, Albani S, Kuis W, Prakken B. CD4+CD25(bright) regulatory T cells actively regulate inflammation in the joints of patients with the remitting form of juvenile idiopathic arthritis.J Immunol. 2004 May 15;172(10):6435-43.

[12] Manavalan JS, Kim-Schulze S, Scotto L, Naiyer AJ, Vlad G, Colombo PC,Marboe C, Mancini D, Cortesini R, Suciu-Foca N. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity.Int Immunol. 2004 Aug;16(8):1055-68. Epub 2004 Jun 28.

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New finding about FoxP3

Abstract: FoxP3 is a transcription factor,which is a critical regulator of the development and function of regulatory T cells.The expression of FoxP3 will affect immune system,and the mutation of FoxP3 will lead to a fatal autoimmune disease.The further research to FoxP3 may show us the mechanism of the immune regulation and a new way for tumor therapy and autoimmune disease.In addition,FoxP3 will be exploited to induce transplantation tolerance.

Key Words: FoxP3;CD4 + CD25 + T cells;immune regulation;immune tolerance

SARS冠状病毒TW1多聚酶putative nsp3片段的克隆、鉴定中山医学院李惠君林莉王林琳李娟古灿基

指导老师：陆家海

摘要：背景：SARS相关冠状病毒是引起人严重急性呼吸综合征的病原体。目前国内外大部分对SARS-CoV的研究主要仍集中于其结构蛋白S、M、N和E，而对其酶系统的认识还十分贫乏。研究SARS-CoV多聚酶有助于了解SARS病毒的生命规律，同时也可能对该疾病的诊断、治疗、甚至药靶等的筛选等起指导作用。目的：克隆SARS-CoV TW1多聚酶中putative nsp3编码基因序列，连接到真核表达载体pCI-neo上，并将其转化到大肠杆菌（E.coli）中，提取重组质粒，为转染细胞做准备。方法：根据SARS-CoV TW1 putative nsp3基因序列设计引物扩增目的基因，在目的基因5’端和3’端导入EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点，将克隆产物连接到经EcoRⅠ、SalⅠ酶切过的pCI-neo质粒上，转化到E.coli中，培养过夜，提

取质粒鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示目的基因成功连接上载体质粒，并且重组pCI-neo 质粒能转化到E.coli。结论：SARS-CoV TW1 putative nsp3基因成功重组到pCI-neo质粒上，为后续的实验研究奠定了物质基础。

关键词：SARS冠状病毒（SARS-CoV），putative nsp3，多聚酶

2003年曾引起全球性大流行的严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS），在我国又称为传染性非典型肺炎；SARS相关冠状病毒是引起该的主要病原体，是一种新发现的传染病[1~3]。目前，该病毒的基因测序已完成[4~5]。

SARS冠状病毒（SARS coronavirus，SARS CoV）基因组编码的蛋白主要包括依赖于RNA的RNA聚合酶、突起子糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、外膜蛋白（N）、核蛋白（E）以及一些非结构蛋白。基因组从5’到3’端依次为：5’-多聚酶-S-E-M-N-3’。5′端有甲基化帽子结构，其后是72个核苷酸的引导序列。基因组RNA约2/3为开放阅读框架（ORF）1a/1b，编码RNA多聚酶（Rep），该蛋白直接从基因组RNA翻译，形成多蛋白前体，后者进一步被病毒主要蛋白酶3CLpro切割，主要负责病毒的转录和复制[6]。其中，病毒复制、转录所需要的病毒特有的RNA聚合酶是在侵入宿主细胞后才合成的[7]，而该酶的合成也可能跟其他多聚酶有所关联，这提示SARS病毒的酶系统在病毒的复制、转录、翻译、调控甚至感染宿主细胞过程中起重要作用。

然而，目前国内外大部分对SARS-CoV的研究主要仍集中于其结构蛋白S、M、N和E，而对其酶的认识还十分贫乏。研究SARS-CoV多聚酶有助于了解SARS病毒的生命规律，同时也可能对该疾病的诊断、治疗、甚至药靶等的筛选和疫苗的研制等起指导作用，故开展本研究。

一、材料和方法

（一）材料

1.质粒、菌株与培养基

真核表达质粒pCI-neo、模板DNA（整合有SARS-CoV TW1基因序列的6号质粒）和宿主菌大肠杆菌DH5α均为中山大学公共卫生学院中心实验室保存。pCI-neo基因序列及酶切位点见文献[8]。

Amp＋LB液体培养基[10ｇ/Ｌ胰化蛋白胨(tryptone)，5ｇ/Ｌ酵母提取物(yeast extract)，10ｇ/ＬＮaCl，50g/L氨卞青霉素（Amp），ｐＨ＝7.5]用于培养重组质粒转化后大肠杆菌。Amp＋LB培养平板[Amp＋LB液体培养基中加入12g/L琼脂粉铺板]用于筛选转化重组质粒的大肠杆菌。

2.试剂及试剂盒

引物由上海博生物技术有限公司合成。限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ购自New England Biolab公司，T4 DNA连接酶购自大连宝生TaKaRa公司。小剂量琼脂糖胶回收试剂盒来自上海华舜生物工程有限公司，质粒快速提取试剂盒为北京鼎国生物技术有限责任公司产品。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

（二）方法

1.目的基因的选择、引物设计和合成

根据NCBI基因库[5]所公布的SARS基因序列，对SARS-CoV TW1全部序列（共29729bp）进行研究并选取putative nsp3 基因（10933bp－11772bp）作为目的基因，经Oligo6.0软件设计，在其5’端和3’端分别导入限制性内切酶EcoRⅠ(GAATTC)和SalⅠ(GTCGAC)的酶切位点，制成上下游引物。引物由上海博生物技术有限公司合成。

上游引物：5’－GCG GAATTC(EcoRⅠ)ATGGGTAAGTTCAAG（共24bp）；

下游引物：5’－GCG GTCGAC(SalⅠ)ATGCTGTACAGTAGCAA（共26bp）。

斜体下划线部分为限制内切酶的酶切位点碱基序列，其前方为保护性碱基，后方为目的基因的起始段碱基序列。目的基因片段长度为869bp（putative nsp3 基因10933bp－11772bp）。

2.目的基因的PCR扩增及分离纯化

PCR扩增循环条件为：95℃变性1min；94℃30s，47.5℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定产物的纯度及分子量的大小，同时对扩增后的目的基因进行分离纯化。

3.目的基因、载体pCI-neo酶切与连接

载体pCI-neo与纯化后目的基因同时经限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切37℃8h，由1.0％琼脂糖凝胶电泳、用小剂量胶回收试剂盒纯化回收。采用T4DNA连接酶在PCR仪上使纯化产物（载体和目的基因）连接，PCR程序如下：14℃5min，16℃45 min，18℃5min，运行24个循环；37℃1h，65℃10min。

4.连接产物的转化、质粒的抽提与鉴定

制备感受态细胞，将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，用Amp＋LB筛选平板培养过夜（pCI-neo含抗Amp基因），筛选出转化成功的大肠杆菌。挑取单克隆，在Amp＋LB液体培养基中培养，经PCR扩增及凝胶电泳鉴定出阳性单克隆，然后在阳性单克隆菌液中抽提重组质粒。

5.重组质粒双酶切、鉴定及测序

使用限制性内切酶EcoRⅠ/SalⅠ对重组质粒双酶切37℃8h，用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。从而构建出重组真核表达质粒，命名为pCI-neo－nsp3。重组质粒pCI-neo－nsp3经上海博生物技术有限公司测序，保留结果。

二、结果

（一）目的基因PCR 扩增后的鉴定结果

以整合有SARS-CoV TW1基因序列的6号质粒的DNA 为模板行PCR 扩增，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见在750bp~1000bp 之间出现清楚的特异扩增带（图1，列5），与目的基因的大小（869bp ）相符。证明PCR 扩增产物确为目的基因。

（二）重组真核表达质粒的构建及酶切鉴定结果

重组真核表达质粒pCI-neo －nsp3经EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见重组质粒的酶切产物出现两条清晰的条带（图1，列4），大小分别与目的基因（图1，列5）和载体pCI-neo 质粒EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后（图1，列3）一致，证明大肠杆菌中转化的质粒的确为重组质粒pCI-neo －nsp3。

（三）重组质粒的测序及保存

重组质粒pCI-neo －nsp3经上海博生物技术有限公司测序，结果保留，用于后续与其他病毒株基因序列的对比研究（另文发表）。重组质粒纯化后保存，用于则下一步实验转染细胞研究之用。

三、讨论与展望

目前所知，SARS 冠状病毒和同家族的其他冠状病毒一样，是单链正义RNA 病毒，具有成熟病毒中不存在RNA 聚合酶及病毒基因组RNA 本身可发挥mRNA 功能作为翻译模板两大特征；但其生命活动规律中所需要酶系统，包括合成、表达和作用机制等，至今尚未明确，可能与一些多聚酶相关；这提示SARS 病毒的酶系统在病毒的复制、转录、翻译、调控甚至感染宿主细胞过程中起重要作用。可惜迄今为止，国内外大部分对SARS-CoV 的研究主要仍集中于其结构蛋白S 、M 、N 和E ，而对其酶的认识还很少，用途也比较有限，目前图1 pCI-neo －nsp3的酶切鉴定

Fig. 2 Restriction analysis of pCI-neo －nsp3

1 Marker DL2,000+ Marker DL15,000

2 EcoR Ⅰ,digestion of pCI-neo －nsp3

3 EcoR Ⅰand Sal Ⅰ,digestion of pCI-neo

4 EcoR Ⅰand Sal Ⅰ,digestion of pCI-neo －nsp3

5 PCR of the aimed gene (869bp)

多只用于经PCR技术进行SARS的诊断[9]。因此开展对SARS-CoV多聚酶的研究项目十分必要，有助于解答SARS病毒目前还未明确及解决的一些问题。推测SARS-CoV多聚酶的作用如下：

（一）了解SARS病毒的生命活动规律

SARS相关冠状病毒复制、转录所需要的病毒特有的RNA聚合酶是在侵入宿主细胞后才合成的；虽然该酶能在独立地启动翻译过程[7]，但其合成、表达和作用机制尚未明确，推测可能与其他多聚酶相关联；而多聚酶的主要功能是病毒的转录及复制，因此本实验着力研究多聚酶系统的结构功能，希望能找出在病毒复制或转录时起决定性作用的多聚酶，以全面了解其生命活动规律和致病关键。

（二）与同病毒株或其他病毒株序列作比较

本序列在重组质粒体系和（或）转染细胞后均可能发生变异，通过以表达序列与同病毒株原序列和其他序列，或与异病毒株序列的差异性来确定本片段在病毒中的变异程度，以推测此片段的产物——多聚酶在病毒转录及复制过程中的重要性，以掌握其的作用。如果表达序列变异程度大，则提示本序列所编码多聚酶产物可能参与了病毒的变异过程，使病毒在变异后能更好地适应宿主或生存环境，或增强毒力等；若表达序列相对保守，则可能参与了病毒关键的生命活动过程。

（三）作为基因诊断的辅助

如前所述，通过比较，若重组质粒体系和（或）转染细胞后的表达序列与原序列差异性小，即相对保守，甚至具有特异性，则本片段可望作为SARS病毒的定位基因片段的诊断，可用于临床快速筛查SARS患者。

（四）提供重要的药靶或疫苗设计思路

明确多聚酶在病毒的生命过程（尤其是致病过程）中所起的作用，将成为研制针对SARS 特异性药物疫苗的一个关键点。利用部分蛋白酶的结构特点开发相应生物抑制剂以抑制病毒感染和增殖，或通过药靶设计阻断相关多聚酶产物合成以诱导病毒致病性的改变等等，都能为SARS治疗提供新的途径。

目前主要的工作是进一步确定这些多聚酶的结构、生物学特点、变异性和功能，以全面掌握SARS的致病过程，才能更有效地控制流行。本实验已成功完成将SARS-CoV多聚酶putative nsp3编码基因序列克隆到真核表达载体pCI-neo质粒上的工作，为将来在真核表达系统中表达出具有生物学活性的多聚酶奠定了基础。

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Cloning and Identification of SARS-CoV TW1 putative nsp3 Gene Abstract：Background:The severe acute respiratory syndrome is cause by a novel coronavirus called SARS-CoV. Most of the present studies is only focus on the protein S, M, N and E. The acknowledgement of its enzyme system has been quite poor at yet. However, the study of the polymeric enzyme can help recognizing the life cycle of SARS-CoV and, may be contributed its dionogsis, treatment, or leading a new area of composing the vaccine. Objective:To clone putative nsp3 coding gene sequence of putative polyprotein of SARS-CoV TW1,induce its fusion expression in E.coli, and epurate plasmid preparing for the transformation into cells. Methods:Design primers according to putative nsp3 coding gene sequence of

SARS-CoV TW1 and clone the aimed gene.Introduce the cut sites of EcoRⅠand SalⅠrestriction enzyme to the 5’ and 3’ends.Transformate into E.coli the pCI-neo plasmid which was digested by EcoRⅠand SalⅠrestriction enzyme and was combined with the product of cloning.Incubate the E.coli one night and extract the plasmid and identify.Results:Gelose gelatin electrophoresis shows that the recombined pCI-neo plasmid was successfully transformated into E.coli,which was successfully recombined with the aimed gene and carrier plasmid. Conclusion:Putative nsp3 coding gene sequence of SARS-CoV TW1 was recombined in pCI-neo plasmid.

Key Words：SARS-coronavirus(SARS-CoV), putative nsp3, polymeric enzyme

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/adoq.html