第5章 细胞的原代与传代培养

关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。

第五章 细胞的原代与传代培养

关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。

一、原代培养 概念：取自体内新鲜组织并臵于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

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原代培养技术的重要意义: 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性 状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性， 而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞 分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过 的阶段。

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原代培养

消化法贴块法

冷消化 温消化

一次性消化 分次消化

消化法：这种培养过程主要是采用无菌 操作的方法，把组织(或器官)从动物 体内取出，经酶消化处理，使分散成单 个细胞，然后在人工条件下培养，使其 不断地生长和繁殖。

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原 代 培 养 方 法 分 类

贴块法

消化法

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分次消化

消化法的分类

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解离释放细胞的方法

最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞 法以及螯合剂解离细胞法。

用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物 细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化 酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。

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动物细胞原代培 养过程图

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器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材

培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒 和铁筒中，160℃,2小时干烤灭菌后备用

手术器材、瓶塞等15磅，121℃,20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用

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方法与步骤(举例)(1)动物处死：将出生2~3d乳鼠，用拉颈椎方法 处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球 擦拭腹部消毒。 (2)剪取心脏：在无菌条件下将心脏(心尖)取 出，臵于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去 除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔 细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再 并用Hanks液洗涤2~3次，直到液体澄清。

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(3)消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无 菌三角烧瓶内，加入5~6倍量的0.1%胰蛋白酶液 (pH7.4 ~ 7.6),臵37℃恒温磁力搅拌器上分次 消化：每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白 酶液于带盖离心管中，加入2滴血清终止消化。直到 组织块基本消化完全。 各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗2-3次 后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。

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(4)计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴 于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计 数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫 升含30 ~50万个细胞为宜。

(5)分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细 胞培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记， 臵于37℃的CO

2培养箱中培养。(6)观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞 生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即 可进行传代培养。

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外植块培养步骤图解

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原代细胞培养结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并 开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可 形成单层

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二、传代细胞培养

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间， 与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3~6次 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生 长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代 培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一 个培养瓶以1:2或其他比率转移，接种到另一培养瓶 的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消 化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞 则用直接传代法或离心法传代。

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方法与步骤(一)贴壁细胞传代培养 (1)选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精

灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2~3ml的D-

Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？)

(2)加入适量0.1%- 0.25%胰蛋白酶消化液，室温消化，倒臵显微镜下观察，待细胞单层 收

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(3)用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

(4)以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 ℃CO2

培养箱培养。(5)观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜

色及细胞的生长情况。

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(二)悬液细胞的传代培养(1)取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。 (2)转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心(1 000r/min)5min。 (3)在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 (4)以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培

养箱培养。 (5)观察：细胞培养24h后，即可进行观察。

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传代细胞培养结果

一般情况，传代后的细胞在2小时左右就 能附着在培养瓶壁上，2~4天就可在瓶 内形成单层，需要再次进行传代

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