RNA干扰

1.1 RNAi及发现

双链RNA介导的一序列特异的转录后基因沉默的过程称为RNAi（RNA interference）。Fire等在1998年在华丽新小杆线虫（Cancorhabditis elegans）首先发现了RNAi效应，随后在许多动物中陆续发现了RNAi效应的存在，如果蝇、锥虫、蜗虫、线虫等。Wiang等在研究鼠卵母细胞及胚胎早期发育过程中也发现存在RNAi效应，最近Sagda等在实验中发现哺乳动物细胞（如人胚肾细胞、Hela细胞等）同样存在RNAi效应，并且发现具有对称性突出2个核苷酸的约21nt siRNAs双链复合物（Short interfering RNAs duplex）可诱导RNAi，但较长的dsRNA由于可以诱发细胞内干扰素系统，从而表现出广泛的非特异性阻抑效应。动物中的RNAi效应与植物中外源性RNA导入细胞后发生PTGS（转录后基因沉默效应），及quelling现象也非常相似。

随着对RNAi的大量研究，人们发现它在许多生物体有着广泛的生理作用。Hiroaki等用华丽新小杆线虫做表型缺失突变时发现，转座子静寂可能是RNAi的一种自然功能，即RNAi可以抑制转座子运动，Keetting认为也可能是保护生殖腺细胞以防止转座子积累过多的一种进化机制。Dvaid等认为在动物中RNAi具有抗病毒反应与植物的PTGS一样抵抗病毒感染，许多研究表明RNAi存在于线虫、锥虫、蜗虫、果蝇等低等动物到鼠等高等动物中，它可能是基因表达调控中的一种策略，它能适当的关闭以适应不同时段细胞的需要。很多研究显示在低等动物与高等动物中均可发生RNAi并与双链RNA特性有关，进而说明RNAi可能是生物体在进化上的一种保卫机制。

1.2 双链RNA（dsRNA）的生化性质

dsRNA的长度对RNAi效应的影响。在线虫、果蝇中研究表明较长的（>100bp）dsRNA阻抑效应较强,在哺乳动物中，大于30bp的dsRNA引起的阻抑效应是广泛的、非特异的，而3′对称性突出2个核苷酸的约21nt siRNAs双链复合物可以诱导特异的阻抑效应或沉默效应。

dsRNA必须要与靶基因有较好的同源性。在dsRNA较长时对序列的特异性要求不是非常严格，dsRNA中碱基修饰的不同也影响其阻抑效应。碱基修饰主要有磷酸化和糖基化两种。硫代磷酸化修饰碱基的种类和数量也影响阻抑效应，单个碱基A或C或G被硫化后影响不大，而U被硫化后阻抑效应基本上就消失了。糖基化修饰则是当3′的核苷酸糖基化，如胞嘧啶转换为脱氧胞嘧啶，或尿嘧啶转换为胸腺嘧啶后阻抑效应大大降低。另外每一种情况下反义链的修饰对阻抑效应的影响更大。

dsRNA浓度影响阻抑效应。实验中阻抑效应不会随着dsRNA浓度的增加而增强。可能与RNA腺嘌呤核苷酸脱氨酶（ADARS）的存在有关。

dsRNA进入机体细胞的方式可以是微注射，也可以采用饲喂的方式。一般认为双链RNA（dsRNA）经由微注射产生的RNAi阻抑效应较强，而且适用范围广泛，但饲喂方式省力、节时、经济。Kamarh等已经采用饲喂的方式对华丽新小杆线虫进行大规模的基因组功能分析。

1.3 RNAi的一些作用机制模型

最近，Bernstein及同事用果蝇研究了RNAi，认为靶基因mRNA被切割成小段至少需要两步，而且两步反应需要不同的核酸酶（RNases）。他们把参与第一步的酶命名为Dicer，并利用3个实验证实了参与第一步反应的酶：（1）在体外用dicer基因编码的蛋白把dsRNA切割成约22nt的片段；（2）该蛋白的抗体可识别果蝇胎盘提取物种的一种酶，它加工dsRNA为为22nt的片段；（3）当双链dicer RNA导入果蝇，发现绿色荧光素蛋白基因的RNAi效应

减弱。显然如果dicer基因在沉默效应中是必需的，它是不可能用RNAi效应来完全阻抑dicer的另一个氨基酸序列特征是还有一个PAZ结构域，后者也存在于果蝇ARG-ONAUTE蛋白、华丽新小杆线虫、真菌及高等动物细胞相关蛋白中。Dicer通过PAZ结构域与这类蛋白结合，RNaseⅢ也常与这些的蛋白结合，进而形成一个多亚单元复合物，特异性的切割靶基因。David Baulcombe据此提出一个更为合理的模型：第一步dicer结合到dsRNA（病毒、移动的DNA或实验方法导入），dsRNA被加工成许多短片段，每个片段约22nt；第二步dicer通过PAZ与含有PAZ的ARG-ONAUTE蛋白结合，而RNaseⅢ与后者相连形成多个亚单元的复合物，这样使得22nt siRNA被称为引导RNA，它可以将多单元复合物引到靶基因Mr-NA处。因为有引导的siRNA在起作用，所以只要有少量的dsRNA就可以引发大量的切割mRNA的反应。笔者认为，尽管目前人们对RNAi的作用机制尚不明了，然而dicer家族一个显著的特征是进化保守，在线虫、果蝇、Arabidopsis、哺乳动物（包括人类）等细胞中均有同源物，这些蛋白结构相似，具有相似的生化功能，从而更有力的说明RNAi这种调节具有进化保守的结构基础，这更进一步提示它可能是生物体的一种进化保守机制。

1.4 RNAi生理作用及可能的用途

随着对RNAi的大量研究，人们发现它在许多生物体有着广泛的生理作用，也暗示了它良好的用途。

1 抑制转座子运转

Hiroaki等用华丽新小杆线虫做表型缺失突变时发现，转座子静寂可能是RNAi的一种自然功能，即RNAi可以抑制转座子运动。Keetting认为这也可能是保护生殖腺细胞以防止转座子积累过多的一种进化机制。

2 抗病毒

Dvaid等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应，与植物的PTGS（转录后基因沉默效应）一样抵抗病毒感染。

3 基因表达调控

许多研究发现从线虫、锥虫、蜗虫、果蝇等低等动物到鼠等高等动物均存在RNAi现象，这说明了RNAi可能是基因表达调控中一种策略，它能适当的关闭以适应不同时段细胞需要。

4 基因功能研究的有力工具

人类基因组计划中的基因测序已经完成，已绘制出了人类基因图谱框架图，人类将进入后基因组计划已经蛋白质组学，后者的主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因功能的技术。尽管人们对RNAi的作用机理还没有真正弄清，但是RNAi的特异性和有效性已成为已经线虫、果蝇等低等动物已知序列基因功能的理想工具。Andrew等用可分泌dsRNA的细菌喂养新小杆线虫，研究了染色体Ⅰ约90％的预测基因，13.9％的基因与其功能对应起来，使已知表型的基因数目由70增至378，这种方法与经典基因筛选方法相比各有千秋，但它主要的一个优点使逆基因分析，即已知特定的基因序列，通过阻抑这一特异基因的表达而出现功能或个体表型的改变，进而得到基因与其功能的相对应联系。可以预测，不久的将来RNAi将会是人类基因组功能研究的得力工具。

5 基因治疗及抗肿瘤策略

RNAi具有特异高效的特点，因此可以用来对一些肿瘤进行治疗。最近Linsl等把针对bcl2基因的Mrna cDNA杂交体转染到人前列腺癌Lucap细胞中，产生了长时期阻抑bcl2表达效应，这一效应与体外培养的前列腺癌细胞中的RNAi相似，进而说明了哺乳动物中可以发生RNAi。

1.5 RNAi的作用特点

1 21～23ntRNA双链复合物（duplex）为RNAi降解靶基因的中介分子

Phillip等在研究双链RNA的性质时发现，32P标记511bpPr-dsRNA在胚胎裂解物中孵育时，结果是约15％生成了21～23ntRNA片段，它们稳定存在，而且不要求有相应的mRNA存在。这证实了小片段RNA是由长双链RNA切割而来，而不是dsRNA针对的靶基因Mr-NA的产物。进一步实验研究表明21～23ntRNA duplex为降解靶基因的介质分子，而且决定了切割的位置。

2 细胞中RNAi装置（machinary）具有饱和性

Susan等进行了如下实验：特异性dsRNA（针对靶基因）浓度一定，而非特异性dsRNA浓度改变，在一标准的RNAi反应中结果发现：随着非特异性dsRNA浓度的增加，特异阻反逐渐减弱。

3 RNAi作用广泛

Fire等在新小杆线虫中发现dsRNA介导RNAi不仅在导入部位产生阻抑效应，而且可以跨越细胞界线弥散到其它腔道和组织发挥阻抑作用。

4 RNAi需要ATP合成来参与其效应

Phillip等用果蝇胚胎做实验时通过观察针对靶基因Rr-lue mRNA的P32标记的蛋白合成情况，他们用己糖激酶和葡萄糖（可以将ATP转化为ADP）处理胚胎裂解物，结果发现：当ATP水平由250?mol降至10?mol以下时，并且加入外源性ATP，针对靶基因的dsRNA没有阻抑Rr-lue的表达，因此可以说明在体外RNAi是需要ATP合成的，外源性ATP对此不能起到促进作用。他们进一步研究发现在ATP合成缺失的裂解物，不能发生，该研究说明RNAi需要有ATP的参与。

5 RNAi过程不需合成蛋白来辅助产生阻抑效应

Phillip等在验证RNAi中是否有蛋白合成（为排除RNAi中有其它的酶类产生起辅助作用）。他们用环已亚胺等蛋白合成拮抗剂，发现RNAi仍以正常效率作用，说明RNAi中不需合成蛋白辅助产生阻抑效应。

6 RNAi作用的靶基因有一定的选择性

Andrew等在研究染色体Ⅰ基因功能，发现保守的基因更易产生RNAi效应，而且神经元细胞较其它类型细胞对RNAi不敏感。参与精子运动的基因也很少能够发生RNAi效应。

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