微生物

微生物学假期综合教学实习

实习时间： 2013年 6 月 25 日 开始

实习班级： 应技1101-1102 人

生命科学技术学院微生物教研室

微生物教学实习基本实验流程

第 配制牛肉膏固体培养基、3倍和单倍乳糖发酵液， 一准备无菌水及各种器皿、器材 天

）

灭菌

采集样品

（

第按要求做10倍梯度稀释

二

天

）配制伊红美测样品的细菌总数： 乳糖培养基初发酵试验：

样品的稀释液涂布按实验要求将稀释液接入兰固体和E.C液 牛肉膏平板 3倍、单倍乳糖发酵培养液 体培养基

37OC培养 37OC培养 灭菌

数平板上菌落看乳酸发酵 倒伊红美兰平板 （数，计算样品的细结果，查MPN表 第菌总数 三 检验乳酸发酵管中产酸产气的样品天 ）

伊红美兰平板划线 接E.C管

37OC培养 44.5OC培养

（挑有金属光泽、看结果，鉴定是 第

无光泽的菌落 否有粪大肠杆菌 四

天接单倍乳糖发酵管 革兰氏染色 ）

37OC培养

看复发酵结果 （ 第 综合本实验的六项结果（细菌总数、乳糖管初发酵（MPN）、伊红美兰平板鉴定、 五E.C平板鉴定、革兰氏染色、乳糖复发酵），写出实验报告 天清洗器材，并做好室内清洁。 ） （

微生物学综合教学实习

学习目的：应用所学的微生物学知识，按一定的方向，学生自己设计实验路线、实验方法，培养组织和实施实验的独立工作能力、科研思维和动手能力；建立团队成员间的合作、交流与探讨氛围。

学习内容：本实验以自来水、天然水样、食品、饮料为检测对象，考察被检测样品中的细菌总数、大肠菌群数量、基本形态及生理特征、有无粪大肠菌群等微生物学特征。对被检测样品的卫生状况做出评价。同时，通过实习熟练掌握相关的微生物技术。

背景介绍：大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，大肠菌群是一群以大肠杆菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸菌属（Citrobacter）、肠细菌属（Enterobacter）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）等，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌。

饮用水和食品检疫的微生物主要是大肠菌群数。每升水中的大肠菌群数量称为大肠菌群指数。

国家饮用水标准规定：大肠菌 自来水<3个/L；

饮用水源<1000个/L；

细菌数 自来水<100个/ml

大肠菌群的共同特点是：发酵乳糖产酸产CO2气体。水源大肠菌群数量检测有多管发酵法（MPN法）和滤膜法。

在37℃培养生长的大肠菌群，包括在粪便内生长的大肠菌群称为“总大肠菌群”(Total coliform)；在44．5℃仍能生长的大肠菌群，称为“粪大肠菌群”(Fecal coliform)，它直接来自粪便，在44-44．5℃的高温条件下仍可生长。

在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，在37℃培养仍可生长，但温度再升高至44．5℃，则不再生长。因此，可用提高培养温度方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分。

粪大肠菌的鉴别方法：将待测菌种接种于EC肉汤管，在44.5±0.5℃培养24±2h。EC肉汤管中的杜氏小管中有气泡即为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

在大肠菌群中，大肠杆菌（Escherichia coli）在伊红美兰固体培养基生长时，菌落具有黑色中心，并呈现金属光泽，据此可将大肠杆菌从其他大肠菌群区分开。

实验计划：实验分五天完成：

1、分组配制培养基并准备实验所需器材。

2、初发酵接种后配E·C培养基、伊红美兰培养基。

3、观察初发酵结果并挑阳性管转E·C培养，同时作划线分离。

4、观察划线分离和E·C培养结果，并挑典型菌落转接牛肉膏斜面，然后作复发酵试验。

5、典型菌落作革兰氏染色，观察复发酵结果并撰写实验报告。

参考书目：赵斌、何绍江 主编《微生物学实验》，实验107、108。

李阜棣、喻子牛、何绍江 主编《农业微生物学实验技术》，实验42。

成绩评定：由4人为1单位共同完成本次实习；4人共同撰写本次实验报告，享有相同的评定结果。因此，注意团队的相互合作、交流与讨论，教师只对团队作出评价。

第一天实验

本日内容：全班同学平均分散到4个实验台面上，分别准备如下培养基和器材

（培养基配方在本讲义后面）：

第1实验台：

配三倍浓缩乳糖发酵液，分装到试管和小蓝盖瓶中。

1、试管每管装5ml（要用移液管或移液器定量），管中加一倒立杜氏小管（开口朝下），

塞胶塞。（共装 250 支 / 班）

2、用200ml大蓝盖瓶每瓶装50ml（用量筒定量）。 （共装瓶/ 班）

第2实验台：

配牛肉膏蛋白胨固体培养基，200ml / 瓶（琼脂粉添加量为1.5%）。（共配 32 瓶 / 班） 另配牛肉膏蛋白胨固体培养基1100ml，装试管110支，灭菌后摆斜面。

第3实验台：

配单倍乳糖发酵液，分装到试管中，每管10ml，管中加一倒立杜氏小管（开口朝下），塞胶塞。 （共装 350 支 / 班）

第4实验台：

（1）纸包5ml或10ml 塑料吸头 ，10-11支/ 包 ； （ 10 包/ 班,）

塑料盒装1ml塑料吸头。 （ 10 盒 / 班）

（2）空的200ml大蓝盖瓶，灭菌后供采水样用。 （瓶/ 班）

（3）用80ml小蓝盖瓶装自来水，90ml / 瓶， （ 30 瓶/ 班）。

另用500ml三角瓶装自来水，225ml / 瓶，瓶中加玻璃珠10-15粒。 （ 10 瓶/ 班）

试管装自来水，9ml / 管（要用移液管或移液器定量） （ 60 管/ 班）

（4）报纸包培养皿，每筒包10套培养皿。 （ 50 筒/ 班）

培养基和器材准备完毕后，送到灭菌室灭菌。单倍、3倍乳糖发酵液的灭菌工艺条件为115℃, 20 min。 下午由值日同学从灭菌锅拿出，放到实验室边台上，分类摆放。

第二天实验

一、本日内容：初发酵试验，每4个同学为一个实验组（个别组可3或5人），头天下午或当天采样，检测如下样品中的大肠菌群数和细菌总数，实验结果4人共享。

1、南湖水（或其他水域样品）

2、自来水 每人任选一种

3、市售豆奶（或奶茶、豆浆等饮料）

4、市售热干面（或凉粉等其他凉拌食品）

二、每小组（4人）本日所需器材：

采样用空大蓝盖瓶：2瓶 小蓝盖瓶装90ml无菌水：3瓶

试管装9 ml 无菌水：3管 加玻璃珠三角瓶装225ml无菌水：1瓶

灭菌5ml吸头（tip）：1包 灭菌1 ml吸头（tip）：1盒

试管装单倍乳糖发酵液：10ml /管x 30管 试管装3倍浓缩乳糖发酵液：5ml /管x 25管 大蓝盖瓶装三倍浓缩乳糖发酵液：50ml / 瓶x 2 瓶

培养皿（10皿/筒）4筒

牛肉膏蛋白胨固体培养基：200ml / 瓶x 4 瓶

三、操作步骤：

1、稀释平皿测数法：每人1瓶牛肉膏蛋白胨培养基，融化后倒10皿，以供试材料作10倍

稀释（自来水不稀释，用原液作实验），对各样品均稀释至10，共三个稀释度（原

-1-2样、10、10），每个稀释度做三个重复，用涂抹法（0.1ml）测其中的细菌总数。 -2

2、MPN测数法：根据污染情况确定稀释度，并接种乳糖初发酵管。

稀释方法：水域、饮料和豆浆等液体样品做10倍稀释

10 – 1稀释度用5ml吸头吸两次共10ml原液加入瓶装90ml水中

10 – 2稀释度用1ml吸头吸10 – 1稀释液1ml加入试管装9ml水中

热干面或其它固体食品取25克放入225ml无菌水震荡10分钟作为10 – 1再进行稀

释；自来水不稀释，用原液做实验。

接种方法：

（1

10，以最末稀释度水样接种，接种方法按下图所示

（接种总量55.5 ml）

-2（2

取原液直接如图加入，但隔夜豆奶需稀释10倍，以

10稀释度水样按下图所示接种（接种总量55.5 ml / 样品）。

-1（3

25克放入225 ml无菌水振荡半小时后为10稀释液。如图

以10稀释度接种（接种总量55.5 ml / 样品）。

培养液，加被检测水样10 ml，5管重复 3倍乳糖发酵管，内有5ml

1倍乳糖发酵管，内有 10ml 培养液，加被检测水样1 ml，5管重复

1倍乳糖发酵管，内有 10ml 培养液，加被检测水样0.1 ml，5管重复

（4

在装有50 ml三倍乳糖发酵液的三角瓶中加入自来水100 ml，共2瓶；在装有5 ml

三倍乳糖发酵液的试管中加入自来水10 ml，共加10管。（总接种水量300 ml）。 -2

3、接好菌的发酵管和平板放37OC培养。

注意：1、样品接入乳糖管后，要混匀。

2、所有平板和试管都要写清标记，包括样品种类、稀释度、接种量等

四、准备第三天所需培养基、器材。

（1）配伊红美兰固体培养基：150ml / 瓶 （每个瓶中称琼脂1.5%） （瓶/ 班）

（2）配E·C培养液，试管装，10 ml / 管，管中加杜氏小管。（ 120 管/ 班）

（注意：为和乳糖发酵管区别，每只试管都要贴纸标签，用铅笔或中性笔标记

“E·C”，不要用圆珠笔或记号笔写）

（3）配单倍乳糖发酵液3000ml，装200支试管。

另包培养皿10筒灭菌备用（视具体情况决定）。

注意：切记加指示剂，分装时每支试管中加杜氏小管。

下午灭菌，灭菌工艺条件为115℃/20min。

第三天实验

一、本日内容：大肠菌群初发酵结果观察、大肠菌群的纯种分离、粪大肠菌的检验

二、每小组（4人）本日所需器材：

（1） 伊红美兰2瓶，融化后倒平板13-14块，

（注意：伊红-美兰染料易漂在培养基上层，倒平板前要摇匀）

（2）试管装E.C培养液13管

三、操作步骤：

1、统计牛肉膏蛋白胨平板菌落数，计算样品的细菌总数。

2、观察乳糖初发酵结果，查MPN表。

3、每人分伊红美兰平板3块。取产酸产气乳糖发酵管2管，只产酸不产气管1管，分别用

O接种环蘸取，在平板上划线（平板上写清标记）。培养温度37C

4、每人从上面步骤的2支产酸产气管和1支只产酸不产气管中各取1ml，分别按种到E·C

培养管中，置44.5℃下培养，检验是否为粪大肠菌。每组用1支不接种的E·C做对照

第四天实验

一、本日内容：大肠菌群的革兰氏染色观察及复发酵实验

二、操作步骤：

1、每人挑取在伊红美兰平板上有金属光泽的样品菌落2个、无光泽的样品菌落1个。每个菌落分两部分使用：

O（1）其中一部分各接种斜面1支（共3支），置于37C培养。

O（2）另一部分接种单倍乳糖管作复发酵，每个菌2个重复，置于37C培养。

2、观察、记录昨日的E·C培养结果。

下午查国家标准

第五天实验

一、本日内容：

1、大肠菌群的复发酵结果观察。

2、取长好的斜面进行革兰氏染色后镜检，并记录结果。

3、对总细菌数、乳糖管初发酵的MPN结果、伊红美兰平板上的形态、E.C管鉴定、

革兰氏染色、乳糖管复发酵等6项结果做分析

4、由4人共同写1份实验报告，包括：

（1）实验原理

（2）实验方法

（3）实验结果：总细菌数、乳糖管初发酵的MPN结果、伊红美兰平板上的形态、

E.C管鉴定、革兰氏染色、乳糖管复发酵

（4）讨论: 评价几种样品的卫生状况。

5、清洗器材，并做好室内清洁。

附录：培养基配制

1、单倍、3倍乳糖发酵液（1000ml） 灭菌条件：O猪胆盐 5 g（可不加） 蛋白胨 10 g NaCl 5 g

牛肉膏 3 g 乳糖 5 g 自来水 1000ml

0.04%溴甲酚紫溶液25ml 或者 1.6%溴甲酚紫溶液1ml 调pH 7 - 7.2

（配三倍乳糖发酵液时将各成分用量乘3）

2、牛肉膏蛋白胨培养基 1000ml pH7.2 灭菌条件：121OC，30min

牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g NaCl 5g 自来水1000ml 调pH7-7.2

3、E·C培养液（1000ml，pH7.2-7.4） 灭菌条件：O蛋白胨 20 g 乳糖 5 g 三号胆盐 1.5 g

K2HPO4 4 g KH2PO4 1.5 g NaCl 5 g

1.6%溴甲酚紫溶液1ml 自来水1000ml 调 pH7.2-7.4

4、伊红美兰培养基 1000 ml（pH7.2） 灭菌条件：蛋白胨 10 g 乳糖 10 g K2HPO4 2 g 自来水1000ml 2%伊红（曙红 cosin）20 ml 0.5%美兰（Methylene blue）13 ml

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/mfoi.html